Summary
לא ממוקד metabolomics מספק השערת יצירת תמונת מצב של פרופיל מטבולי. פרוטוקול זה יהיה להדגים את המיצוי והניתוח של מטבוליטים מתאי, סרום, או רקמות. מגוון המטבוליטים סקר באמצעות מיצוי שלב נוזלי נוזלי, microflow ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית / רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS) מצמידים את תוכנת ניתוח ההפרש.
Abstract
כאן אנו מציגים זרימת עבודה כדי לנתח את הפרופילים המטבוליים לדגימות ביולוגיות של עניין, כולל; תאים, סרום, או רקמה. המדגם מופרד ראשון לשברים קוטביים ולא קוטבי על ידי מיצוי שלב נוזלי נוזלי, ומטוהר באופן חלקי כדי להקל על ניתוח במורד הזרם. שניהם מימיים (מטבוליטים קוטב) ואורגניים (מטבוליטים שאינם קוטביים) שלבי ההפקה הראשונית מעובדים ליסקרו מגוון רחב של מטבוליטים. מטבוליטים מופרדים על ידי שיטות כרומטוגרפיה נוזליות שונות המבוססות על מאפייני החלוקה שלהם. בשיטה זו, אנו מציגים Ultra-ביצועי microflow (UP) שיטות LC, אך הוא ניתן להרחבה לפרוטוקול תזרים גבוה ולחצים נמוכים יותר. מבוא לספקטרומטר המסה יכול להיות דרך או תנאים אופטימליים כלליים מקור או תרכובת. זיהוי של מגוון רחב של יונים מתבצע במצב סריקה מלא במצב חיובי ושלילי על פני טווח מ '/ z רחב ברזולוציה גבוהה תוך שימוש בבאחרונה גalibrated מכשיר. תווית ללא ניתוח ההפרש מתבצע על פלטפורמות ביואינפורמטיקה. יישומים של גישה זו כוללים הקרנת טבולי מסלול, גילוי סמן ביולוגי, ופיתוח תרופות.
Introduction
בשל התקדמות טכנולוגית האחרונה בתחום HRMS, לא ממוקדים, בmetabolomics השערה שהניבו גישות הפכו גישה אפשרית לניתוח של דגימות מורכבות. 1 ספקטרומטרים המוני המסוגלים להקל על חלק 100,000 רזולוציה נמוכה שגרה למ' (חל"מ) דיוק המוני הפכו נרחב זמין של ספקים מרובים. 2,3 דיוק זו מאפשר מסה סגוליות ואמון במשימה ראשונית של זהות אנליטי, זיהוי תבניות איזוטופי, והזדהות adduct גדולים יותר. 4 בשילוב עם הליך מיצוי הולם ו, תערובות מורכבות עתירי ביצועים LC או UPLC ניתן לנתח עם ייחוד נוסף נובע מנתונים בזמן שמירה. 5 UPLC בעל יעילות רבה יותר ומאפשר chromatographic רגישות רבה יותר, רזולוציה וניתוח בזמן ביצוע כיסוי גדול יותר של 6 metabolome אפשרי. במערכי הנתונים הגדולים כתוצאה מכך יכולים להיות משולבים בכלשל תוכנת ניתוח ההפרש מרובה ולכרות לדפוסים שימושיים או analytes הבודדים של עניין. 7,8,9,10,11 להיטים משוער יכולים להיות מזוהים בתחילה באמצעות שילוב של אלגוריתמים לזיהוי שיא, ניבוי המבוסס על נוסחה כימי מסה מדויקת, תחזית פיצול, ו חיפוש כימי מסד הנתונים. גישה זו מאפשרת לתעדוף של מטרות לזמן רב הזדהות מבנית מלאה או לפיתוח של דילול איזוטופ יציב יותר רגיש ויותר ספציפי תגובת UPLC / הנבחר או מרובה ניטור / MS מחקרים שהשיטות הסטנדרטיות הנוכחיות הזהב לכימות. 12
הטבע שונה של דגימות ביולוגיות הוביל לאופטימיזציה של פרוטוקולי חילוץ לשתן 13, 14 תאים, סרום 15, 16 או רקמה. זה פרוטוקול תכונות עקירות לתאים, סרום, ורקמות. במקרה צורך, הערות והפניות נוספות כבר כלולות עבור modifications של ההליך כדי לטפל בהכללתו של איזוטופים יציבים, או להכללה של מטבוליטים לא יציבים במיוחד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הפקת דגימה מתאים
- לצלחת 10 ס"מ של תאים: לאסוף 1.5 מ"ל של השעיה תא הגבהה מדיה לתוך צינור צנטריפוגות זכוכית מסומן מראש 10 מ"ל. לשורות חסיד, צריכים להיות הרים תאים עם גירוד עדין ב1.5 מ"ל של תקשורת כל הזמן על קרח אופציונלי:. אם נעשה שימוש בסטנדרטים פנימיים, להוסיף aliquot מתאימה בשלב זה.
הערה: מרווה של חילוף חומרים תאיים חיונית למטבוליטים מסוימים. לניתוח של מטבוליטים זמן רגישים, כגון מיצוי הליכי מתנול קר צריכים להיחשב. 17 - הוסף 6 מ"ל של כלורופורם (CHCl 3) / מתנול (CH 3 OH) (2:1, V / V) לכל אחד מצינורות זכוכית 10 מ"ל המכילים את הדגימות. הגדר את הדגימות שבייקרו או רב vortexer במהירות נמוכה למשך 30 דקות. אחרי שלחצתי, דגימות centrifuged עם הגדרת ההאצה / האטה נמוכה ב 1935 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להפריד את השלבים לגמרי.
אופציונלי 3, עקירות יכולות להתנהל עם dichloromethane (CH 2 Cl 2) 18,12. - השימוש בגבעול ארוך פיפטה פסטר, להעביר את השכבה האורגנית (תחתון) לצינור חדש שכותרתו מראש 10 מיליליטר זכוכית צנטריפוגות. המשך 4.1.
- העבר מימית העליון מאוחר יותר לתוך צינור פלסטיק נקי 2 מיליליטר אפנדורף. להתאדות המדגם תחת גז חנקן. תמשיך 2.6.2 לdesalting השלב המימית או להמשיך 4.1 לניתוח ישיר.
2. הפקת מדגם מסרום
- העבר את 20 μl של סרום לתוך צינור פלסטיק 2 מ"ל אפנדורף אופציונלי:. אם נעשה שימוש בסטנדרטים פנימיים, להוסיף aliquot מתאימה בשלב זה.
- הוסף 190 μl של CH 3 OH ומערבולת עבור 10 שניות.
- הוסף 380 μl של CHCl 3 ו מערבולת עבור 10 שניות.
- הוסף 120 μl של H 2 O כדי לגרום להפרדת פאזות. וורטקס הדגימות עבור 10 שניות ומאפשר לאזן על RT במשך 10דקות.
- צנטריפוגה הדגימות ב 8000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להפריד בין השלבים.
- מעבירים את השלב האורגני נמוך יותר לתוך צינור פלסטיק נקי 2 מיליליטר אפנדורף. המשך 4.1.
- העבר מימית העליון מאוחר יותר לתוך צינור פלסטיק נקי 2 מיליליטר אפנדורף. להתאדות המדגם תחת גז חנקן.
- Re-להשעות מדגם H בμl 200 2 א ' ריאגנטים חומצה או בסיס (0.1% חומצה אצטית, חומצה פורמית או 0.1% אמוניום הידרוקסיד) עשויים לשמש כדי לחלץ מעדיף מטבוליטים רגישים pH. Sonicate במשך 20 דקות על קרח כדי מחדש להשעות המדגם לחלוטין.
- הפעל את עמודות ספין C18 עם CH μl 500 3 OH.
- לאזן את עמודת הספין עם שני שוטף של H 2 O μl 500 ולאחר מכן לטעון את המדגם. אם נעשה שימוש בחומרים כימי חומצה / בסיס לשמור על ריכוז זה בשלבים לשטוף.
- לשטוף עם H 2 O μl 500 לdesalt המדגם. שוב, אם נמצאים בשימוש חומרים כימיים חומצה / בסיס לשמור על הריכוז הזה בכביסהצעדים.
- Elute עם שני כרכים של 80% μl 200 CH 3 OH בH 2 O לתוך צינור נקי 2 שכותרתו מראש מיליליטר אפנדורף. שוב, אם נמצאים בשימוש חומרים כימיים חומצה / בסיס לשמור על ריכוז זה בשלבים לשטוף. המשך 4.1.
3. הפקת דגימה מהרקמה
- בהתאם לרקמות, השתמש בין 10-100 מ"ג של רקמה קפוא. הוסף כל פיסת הרקמה שלכותרתו מראש צינור Eppendorf שייר נמוך מ"ל 2 עם 1 מ"ל של PBS (1 M, pH 6.8) באמבט קרח אופציונלי:. אם נעשה שימוש בסטנדרטים פנימיים, להוסיף אותו למאגר, לפני הוספה הרקמה.
- Homogenize הרקמות בקרח עם מטחנת רקמה חשמלית למשך 30 שניות בכל אפנדורף. בין דגימות, לנקות את מטחנת הרקמה בשני צינורות נפרדים המכילים CH 3 OH ו-H 2 O, בהתאמה.
- מעבירים את homogenate הרקמות עם טפטפת פלסטיק לתוך צינור צנטריפוגות זכוכית שכותרתו מראש 10 מ"ל. לאחר ההעברה, יש לשטוף את כל צינור Eppendorf2x עם 1 מ"ל של CH 3 OH ולהוסיף את שוטף לhomogenate הרקמות בצינורות הזכוכית.
- הוסף 4 מ"ל של CHCl 3 לכל אחד מצינורות זכוכית 10 מ"ל המכילים homogenate הרקמות ו3 שוטף OH CH. הגדר את הדגימות שבייקרו או רב vortexer במהירות נמוכה למשך 30 דקות.
- אחרי שלחצתי, צנטריפוגה דגימות עם הגדרת ההאצה / האטה נמוכה ב1,935 XG במשך 10 דקות כדי להפריד את השלבים אופציונלי לחלוטין:. כדי להימנע משימוש בכלורופורם, עקירות פותחו עם CH 2 Cl 2.
- השימוש בגבעול ארוך פיפטה פסטר, להעביר את השכבה האורגנית (תחתון) לצינור חדש שכותרתו מראש 10 מיליליטר זכוכית צנטריפוגות. המשך 4.1.
- השימוש בגבעול ארוך פיפטה פסטר, מעביר את השכבה המימית לצינור חדש שכותרתו מראש 10 מיליליטר זכוכית צנטריפוגות. עבור ל2.6.2 לdesalting או להמשיך ל -4.1.
4. השעיה מחדש וסינון של דוגמאות לUPLC
- להתאדות SAMPLes תחת גז חנקן.
- לשקם ייבש את דגימות בנפח מתאים של הפתרון מוצא לשיטת UPLC הרצויה (ראה טבלה 1). 50-100 μl הוא בדרך כלל נפח השעיה מחדש רצוי. מערבולת בעדינות ו / או פיפטה המדגם למעלה ולמטה כדי לסייע בהמסת analytes.
- להעביר את הדגימה למסנן 0.22 מיקרומטר ניילון צינור ספין במהירות של עד 14,000 XG עד המדגם עבר לחלוטין דרך המסנן (~ 5 דקות). ודא שאין משקעים שנותרו גלוי במדגם.
- מעבירים את supernatant המדגם המסונן לתוך בקבוקון UPLC שכותרתו מראש עם הוספה. בקבוקון פקק, לאחר מכן קפיצי בקבוקון כדי להסיר בועות מתחתית בקבוקון המדגם. הנח את הדוגמא בautosampler המקורר (4-5 מעלות צלזיוס).
5. התקנת UPLC
- שימוש בתוכנת השליטה לכרומטוגרף נוזלי, ליצור ריצה למדגם האורגני המבוססת על הנחה של התנאים המפורטים ב
- לאפשר UPLC לאזן כראוי. זו צריכה לכלול תחול מלא ממסים לפני הצמדת טור, ובעקבות הוראות היצרן עבור נפח איזון של עמודה חדשה (בדרך כלל 3-5 כרכי עמודות). לשמור על יומן של הפעלה לחצים בחזרה כדי לסייע באבחון בעיות בעתיד.
6. התקנת ספקטרומטר מסות
- שימוש בתוכנת השליטה לספקטרומטר מסות ברזולוציה גבוהה, ליצור שיטת מצב חיובית תוך שימוש בתנאים המפורטים בטבלה 2. לאחר מכן שימוש באותם תנאים, ליצור שיטת מצב שלילית אופציונלי:. אם סט ידוע של analytes היעד הוא של int הגבוהerest, מקור לייעל ותנאי שימוש באופטיקה האנלוגי שכותרתו כבדה של תרכובות אלה, וליצור באמצעות שיטה בתנאים אלה.
- לנקות ולכייל את המכשיר, להקים תרסיס יציב לספקטרומטר, ולאפשר זמן לפתרון הכיול כדי להפיג במידה מספקת מהמקור ואופטיקה. יציבות קביל של תרסיס צריכה לתת 3-5% RSD בעוצמה מעל 100 לפחות סריקות עם הזרקה של תמיסת כיול באותו קצב הזרימה כשיטת LC בשימוש.
- להגדיר רצף עבור כל הדגימות, להגדיר את עוצמת זריקה מתאימה, ולהפעיל ריק לפני המדגם הראשון. אם שריד או מטריצת השפעות בין דגימות חשודות, לרוץ החסר / שטיפה נאותים. דגימות צריכה להיות הגדרה באופן אקראי באמצעות מחולל מספרים אקראיים ומפתח כדי למנוע השפעות אצווה שהוצגו על ידי ניתוח.
הערה: דגימות בקרת איכות לרבות תקני איזוטופ יציבים או סטנדרטים אנליטיות של מטרות סבירות יכולות להיותיקר מאוד בפתרון הבעיות ומבטיחים תוצאות אמינות, לשחזור, וחוקיות. לשכפל טכני של מדגם רק סטנדרטי ואחריו ריק ממס יכול לשמש לכניסות סטייה של עוצמת אות וזמן שמירה, כמו גם שריד לטווח הריק. - להתחיל רצף ולפקח מעת לעת לבעיות, כולל תנודות בלחץ, או אובדן של עוצמת אות על פני הטווח. אם בעיות חמורות מזוהות, להפסיק את הריצה, וחזור מ -6.2.
7. ניתוח ההפרש
- שתי זרימות עבודה מוצגות לפרוטוקול זה. הראשון הוא בנפה 2.0, תוכנה לניתוח ההפרש ללא תווית קניינית נמכרת על ידי תרמו פישר. העבודה השנייה היא באמצעות XCMS באינטרנט, פלטפורמה החופשית באמצעות מכון מחקר Scripps. -11 לפני תחילת ניתוח ההפרש, באופן ידני לבדוק את טיקים או להסתכל chromatograms מסונן לכל תרכובת ידועה במדגם כדי להבטיח שחזור של ריצותוהזרקת יציבות / UPLC / ספריי לאורך כל הדגימות.
- נפה
- להעביר את קבצי הנתונים הגולמיים. מספקטרומטר המסות על הכונן הקשיח של תחנת העבודה שבו נפה מותקנת. (הערה: נפו את הריצה עם הנתונים המאוחסנים על כונן מחובר לרשת או יציאת USB לא מומלצת כפי שהוא יכול להגביל את המהירות של ניתוח.)
- נפה את פתוח, ולהתחיל ניסוי חדש.
- לטעון את הקבצים המתאימים למסננת.
- הקצאת קבוצות השוואה ובחר בקובץ התייחסות אחת כדי לאפשר למסננת כדי ליצור את הפרמטרים לניתוח.
- בצע את ההנחיות ולהתאים את כל פרמטרים לדרישות של כל ניסוי בודד. זה בדרך כלל מומלץ להתחיל עם פרמטרים מחמירים ולאחר מכן לחזור ולשחרר את הפרמטרים כהגדרות נדיבות יותר יכולות להאריך את זמן ניתוח.
- טען את רשימת adduct הנכונה למצב חיובי או שלילי בפרמטרים.
- XCMS המקוון
- המר קבציםלפורמט מקובל לXCMS באינטרנט. במקרה שלנו, אנחנו להמיר לפורמט mzXML. 19
- XCMS הפתוח באינטרנט, וליצור עבודה.
- העלה שם את מערכי נתונים. רק שני מערכי נתונים (לדוגמה, בקרה לעומת טיפול) ניתן להעלות כXCMS עצמאי מוגבל להשוואות ראש בראש.
- בחר את הגדרות רצויות מהרשימה הנפתחת. פרמטרים שאוכלסו כבר זמינים עבור setups מכשור שונה, ויכולים להיות שונה אלה נוספים לצרכי ניסוי. במקרה שלנו, אנו משתמשים בהגדרות HPLC-Orbi2.
- שלח ולאשר את העבודה.
- ניתוח נתונים
- למסננת וXCMS רשימה של מסגרות ותכונות, בהתאמה, תהיה מאוכלסת ברגע הניתוח הוא סיים. להבטיח כי כל שכבות יישור LC פסגות ציון דרך. אם כל אחד מריצות LC המעוות מראה סטייה גדולה בפסגות ציון דרך זה עשוי להצביע על בעיה במדגם.
אופציונלי: למסננת, אם נעשו שימוש בסטנדרטים פנימיים, אתרקבוצת השיא המקבילה ולנרמל למסגרת שנבחרה. לXCMS on-line, ניתן לעשות נורמליזציה בגיליון אלקטרוני לאחר יצוא. - להתוות את הנתונים על ידי מקדם שונה (CV) בתוך אוכלוסיית מדגם כמו (דגימות בקרה למשל). כל ערכי CV גדולים עשויים להצביע על בעיה בדגימה אחת או יותר. למיין את הרשימה המבוססת על תכונות רצויות (p-value <0.05, שינוי פולד> לדוגמא 1.5, סטיית תקן נמוכה בתוך קבוצה, וכו ').
- לבחון כל שיא ביישור מתאים לשיא בכל קבוצות, אינטגרציה שיא, שיא צורת גאוס, עוצמת אות, איזוטופים, והמחאת adduct.
- יצוא הנתונים המועדפים לניתוח נוסף או ליצור רשימות המוניות ממוקדות על אישור וניסויי n טרשת נפוצה.
- למסננת וXCMS רשימה של מסגרות ותכונות, בהתאמה, תהיה מאוכלסת ברגע הניתוח הוא סיים. להבטיח כי כל שכבות יישור LC פסגות ציון דרך. אם כל אחד מריצות LC המעוות מראה סטייה גדולה בפסגות ציון דרך זה עשוי להצביע על בעיה במדגם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות שהוצגו מראות נתונים נבחרים מטיפול של 6 שעות של תאי glioblastoma SH-SY5Y עם חומרי ההדברה וrotenone מעכב אני מורכב המיטוכונדריה. לשם קיצור, רק את הנתונים החיוביים במצב האורגני השלב מוצגים. הדגימות עובדו ונותחו כמתואר לעיל (איור 1, טבלת 1, טבלת 2) והועמסו על שתי פלטפורמות ניתוח דיפרנציאלי עבור תווית ללא כימות, מסננת וXCMS באינטרנט. למרות מספר גדול של להיטים (איור 2, איור 3) מזוהה על ידי שתי התוכניות המשמשות לניתוח ההפרש תכונות אלה כוללות ממצא סביר, פסגות גרועה משולבות, ותכונות אחרות של ערך האנליטי בספק. זה יכול להישפט על ידי הקרנת הלהיטים לעוצמת אות מתאימה, וריאציה נמוכה בין דגימות של אותה הקבוצה, רמות רקע, וצורות שיא chromatographic טובות (איור 3).
כדי להדגים את downstreבוקר של להיטי אישור ראשוניים, אנו בודד תכונה עם מסה מקבילה לrotenone מתחם הטיפול שלנו במרחק של 3 עמודים לדקה (איור 3, איור 4). אנו מאשרים את זהותו של זה עם אנליטי UPLC-HR/tandem ספקטרומטריית מסה (MS / MS) של המדגם שלנו ומתחם הטהור (איור 5). כמו כן, אנו מזהים תכונה באופן דיפרנציאלי בשפע מופחתת בקבוצה שטופלה rotenone שנוצר בהיסוס כמו D-pantethine על ידי חיפוש במסד נתונים של מסה מדויקת (איור 3).
איור 1. מתאר ניסויי כללי להכנת מדגם וניתוח על ידי Microspray UPLC-HRMS. מתווה כללית של הכנת מדגם, כולל ההקדמה אופציונלית של תקנים וחלבונים או שומנים / חלבון ניתוח תוכן פנימיים. הפרדת פאזות, כרומטוגרפיה נוזלית, וניתוח על ידי IO שונהמצבי n בספקטרומטר המסה מפורטים.
טבלת מס '1. תנאי UPLC. כללי ותנאים אופטימליים UPLC מתחם. עבור שלב אורגני 1, קצב זרימה קבוע של 1.8 μl / דקה דרך עמודה C18 nanoACQUITY וטרס BEH130 המשיכה בתנור על 35 מעלות צלזיוס הייתה בשימוש. ממס: 99.5% אצטוניטריל water/0.5% עם 0.1% חומצה פורמית, מרכך ב ': 98% אצטוניטריל / מים 2% עם חומצה פורמית 0.1% לשלב אורגני 2, קצב זרימה קבוע של 3.4 μl / דקה דרך עמודת Acentis אקספרס C8 המשיך בתנור על 35 מעלות צלזיוס הייתה בשימוש. ממס: 40% אצטוניטריל water/20% עם 0.1% חומצה פורמית ו10 formate אמוניום מ"מ, מרכך ב ': 90% אצטוניטריל isopropanol/10% עם 0.1% חומצה פורמית ו10 formate אמוניום מ"מ עבור השלב המימית, קצב זרימה מתמיד של 1.2 μ ליטר / דקה דרך עמודה C18 nanoACQUITY וטרס BEH130 המשיכה בתנור על 35 מעלות צלזיוס היה בשימוש. ממסים: מתנול 95% מים / 5% עם 0.1% הידרוקסיד, B אמוניום מרכך: 95% מתנול / מים 5% עם 0.1% אמוניום הידרוקסיד.
איור 2. מגרש מראה שנוצר עם XCMS. עלילת מראה מראה תכונות באופן דיפרנציאלי בשפע כפי שזוהה ולכמת באמצעות XCMS המקוון מניתוח UPLC-MS המצב חיובי השלב האורגני. כל נקודה מייצגת את "תכונה". ברור נקודות ירוקות הן תכונות עשירות יותר (אזור משולב גדול יותר) בשליטה, ואילו נקודות אדומות הן שופעים יותר בטיפול. הגדלת גודל של הנקודה מציינת בסדר גודל הולך וגדל של שינוי הקיפול בין הקבוצות, ועוצמת הצבע מציינת P-ערך יורד עם הגדלת הרוויה של צבע.
איור 3. פיקס אנליטי. Chromatograms מראה ניתוח האורגני השלב החיובי יון מצב UPLC-MS. סה"כ יון) תיקון (מקביל) נוכחי (עוית) מנפה 2.0. ב ') שחולץ chromatogram יון לתכונה מזוהות היסוס כמו D-pantethine דרך XCMS. C ) מחולץ chromatogram יון לתכונה שלאחר מכן זוהתה כrotenone ממסננת. ד ') XIC לתכונה שלאחר מכן זוהתה כrotenone מנפה מנורמל עוית. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
PG "/>
איור 4. תוצאות חיפוש באתר. להיטי מסד נתונים עבור מסד נתוני metabolome אנוש) (http://www.hmdb.ca) ו-B) ChemSpider / KEGG (באמצעות נפה) (גם יכול להיות מועסק ChemSpider לבד - http://www.chemspider.com ) באמצעות קביעת מסה מדויקת לתכונות אחרות שמוצגות באיורים 3 ב, 3 ג, ו3D מתאימים ליונים של m / z 555.2516 395.1481 ומבוססים על זיהוי של יונים אלה כ[ MH] + מינים. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 5. משאבי אנוש / MS / MS Sאישור tructural. אישור על זיהוי התכונה המקביל ליון ב395.1481 מ '/ z עם זמן שמירה של 23.22 דקות כrotenone מבוסס על השוואת UPLC-MS/MS בסטנדרט מסחרי עם זמן שמירה דומה) ו-B) באותו מ '/ z (395.1481, ~ שגיאת עמודים לדקה 0) עם פיצול כמעט זהה. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
| פרמטר ספקטרומטריית מסה | הצבה | הערה |
| מקור | ESI | Michrom CaptiveSpray |
| דגם יון | חיובי או שלילי | |
| אורך שיטה | משתנה (~ 40-60 דקות) | |
| החלטה | 60,000-100,000 | |
| ספריי (ק) | 1.75 | |
| צינור עדשה (V) | 130 | מתחם יעד תלוי |
| טמפרטורת נימים (מעלות צלזיוס) | 250 | עלול לקצר את חייו של ספריי טיפ |
| מתח נימים (V) | 50 | מתחם יעד תלוי |
| סוג נתונים | Centroid | (לנתונים בפרופיל, ראה דיון) |
טבלת 2. הגדרות טרשת נפוצה. כללית והגדרות ספקטרומטר מסה אופטימיזציה מתחם המשמשים ל- Orbitrap XL LTQ עם מקור Michrom תרמו מראש שבוי תרסיס ESI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לא ממוקד metabolomics מציע כלי רב עוצמה לחקירת biotransformations אנדוגניים או xenobiotic, או לכידת פרופיל מטבולי ממדגם של ריבית. הפלט של המאזניים הטכניקה עם הרזולוציה והרגישות של הטכנולוגיה המשמשת להפריד ולנתח את הדגימה, את היכולת להתמודד עם מערכי נתונים הגדולים שנוצרו, ואת היכולת שלי לבסיס נתוני מידע שימושי (חיפוש מסד הנתונים מסה מדויקת לדוגמה). לאחרונה, זה כבר בהנחייתם של התקדמות בספקטרומטרים המוני ברזולוציה גבוהה, וגבוהת כרומטוגרפיה נוזלית או Ultra-ביצועים. תוכנת ניתוח ההפרש התייחס צוואר בקבוק הניתוח, והוא יכול להשיג התאמת איתור שיא למשמרות שמירת זמנים, סינון וניתוח סטטיסטי עם 20,21,22 בחירה. תפוקה גבוהה של צינור אינפורמטיקה הנכון צריך לכלול שיקולים כמו לנתונים centroiding אלגוריתמים, איתור שיא, אינטגרציה שיא, alignmenלא, יכולת לשלב נתונים MS / MS, והיכולת להתמודד עם איזוטופים או adducts. בחירה של 23 מסדי נתונים cheminformatics המתאימים צריכה להיות גם נחשבת. 24,25,26,27 ההתאמה הנוכחית של כל מסד נתונים מסוימים כדי לזהות באופן מקיף ולשלב תרכובות נתוני מסה מדויקים, MS / MS נתונים, או LC הנתונים נשארים בעיה מרכזית בתחום.
זרימת העבודה שהוצגה כאן משלבת מיצוי נוזלי נוזלי, כרומטוגרפיה מיקרו זרימת נוזל, וספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה עם שתי פלטפורמות תוכנה לניתוח דיפרנציאלי שונות הפגינו במודל טיפול תרבית תאים. בנוסף, פרוטוקולי חילוץ רשומים לסרום ורקמות, כמו אלה יכולים לשמש כדוגמאות שימושיות עבור ניתוח דומה.
למרות שכל שיטה המשמשת לmetabolomics לא ממוקדים צריכה להיות מותאמת לדירות, תנאי UPLC יציבים, ויציבות מקור, וריאציה כלשהי היא בלתי נמנעת. גם מסננת וXCMS Allow תיקון לשינוי זמן שמירה, אך תשומת לב מיוחדת צריך להיות משולם על מנת להבטיח כי הפרמטרים שנקבעו בניסוי מספיקים כדי לתקן את הווריאציה. כמו כן, ניתן לשלב באיזוטופ היציב שכותרתו הפנימית הסטנדרטית (ים) בקלות להליך זה כדי להפחית את החפצים ווריאצית מדגם בין שנגרמה על ידי הבדלים בעקירות או ניתוח מדגם LC-MS. 12 כמו בכל מתודולוגיה LC-MS רגישה, חשוב להשתמש בחומרים כימיים בטוהר גבוה, ולהבטיח כי הכנת המדגם מסירה חומר חלקיקים לא רצוי או מצטבר. יכולים להיות שנוצרו על ידי חפצי הווריאציה הנורמלית במזהמים, וזה עשוי להיות רצוי כדי לאשר שלהיטים משוערים הם לא במזהמים בכל מקום עובדה של תהליך החילוץ או ניתוח.
לבסוף, למרות שהשיטה היא שכותרתו "לא ממוקד" או "משוחד" metabolomics, זה שם מטעה חלקי. טבעו של המיצוי, הפרדה, והניתוח יעדיף מטבוליטים מסוימים עם characterisטיקים כוללים יציבות במהלך חילוץ, אינטראקציה עם נייח וניידים במהלך שלבי הפרדה, ויינון במקור ספקטרומטר המסה. 28,29,30 בהתאם למכשור זמין, הליך זה יכול להיות מותאם לעקירות אחרת, ספיקות, לחצי LC , מקורות יון, או ספקטרומטרים המוני. לכן, יש לנו כלל הערות בהליך שבו יכולים להיות מותאמים תנאים מסוימים המבוססים על ידע כללי או נציג סטנדרטים הפנימי של כיתה של מולקולות של עניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש מחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מכירים תמיכה של NIH מענקי P30ES013508 ו5T32GM008076. אנו מודים גם תרמו מדעיים לגישה לנפה 2.0 ובני זוג. יוג'ין Ciccimaro ומארק סנדרס של תרמית מדעית לדיונים מועילים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
References
- Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation. Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).
- Makarov, A., Denisov, E., et al. Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer. Analytical Chemistry. 78 (7), 2113-2120 (2006).
- Timischl, B., Dettmer, K., Kaspar, H., Thieme, M., Oefner, P. J. Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics. Electrophoresis. 29 (10), 2203-2214 (2008).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. J. Chromatogr. A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data. BMC Bioinformatics. 6, 179 (2005).
- Wilson, I. D., Nicholson, J. K., et al. High resolution ultra performance liquid chromatography coupled to q-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. Journal of Proteome Research. 4 (2), 591-598 (2005).
- Benton, H. P., Wong, D. M., Trauger, S. A., Siuzdak, G. XCMS2: processing tandem mass spectrometry data for metabolite identification and structural characterization. Anal. Chem. 80 (16), 6382-6389 (2008).
- Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
- Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data. Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).
- Gelhaus, S. L., Mesaros, A. C., Blair, I. A. Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (57), e3399 (2011).
- Want, E. J., Wilson, I. D., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLCGÇôMS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nature Protocols. 6 (8), 1241-1249 (2011).
- Dunn, W. B., Broadhurst, D., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
- Shaham, O., Slate, N. G., et al. A plasma signature of human mitochondrial disease revealed through metabolic profiling of spent media from cultured muscle cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (4), 1571-1575 (2010).
- Cequier-Saünchez, E., Rodriüguez, C., Ravelo, A. G., Zaürate, R. Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (12), 4297-4303 (2008).
- Keller, A., Eng, J., Zhang, N., Li, X. J., Aebersold, R. A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats. Mol. Syst. Biol. 1, (2005).
- Cleveland, W. S., Devlin, S. J. Locally weighted regression - an approach to regression-analysis by local fitting. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 596-610 (1988).
- Lange, E., Tautenhahn, R., Neumann, S., Gropl, C. Critical assessment of alignment procedures for LC-MS proteomics and metabolomics measurements. BMC Bioinformatics. 9 (1), 375 (2008).
- Tautenhahn, R., Bottcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9 (1), 504 (2008).
- Kuhl, C., Tautenhahn, R., Bottcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets. Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).
- Kanehisa, M., Goto, S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).
- Smith, C. A., O'Maille, G., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit. 27 (6), 747-751 (2005).
- Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules. Nucleic Acids Res. 37 Web Server, W623-W633 (2009).
- Wishart, D. S., Knox, C., et al. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic Acids Res. 37 Database, D603-D610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Folch, J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).
- Avery, M. J. Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).
