Summary
타겟이 불분명 한 대사는 대사 프로파일의 스냅 샷을 생성하는 가설을 제공합니다. 이 프로토콜은 혈청 세포 또는 조직에서 대사 산물의 추출 및 분석을 보여줍니다. 대사 산물의 범위는 액체 - 액체 상 추출을 사용하여 조사하는, 마이크로 ultraperformance 액체 크로마토 그래피 / 차동 분석 소프트웨어에 결합 고해상도 질량 분석법 (UPLC-HRMS).
Abstract
여기에서 우리는 등 그 생물 학적 샘플 신진 대사 프로파일을 분석 할 수있는 워크 플로우를 제시, 세포, 혈청, 또는 조직. 샘플을 먼저 액체 - 액체 상 적출에 의해 극성 및 비극성 분획으로 분리하고, 부분적으로 다운 스트림 분석을 용이하게 정제된다. 초기 추출 수용액 (극성 대사 물질) 및 유기 모두 (비 극성 대사 물질) 단계는 대사의 넓은 범위를 조사하기 위해 처리됩니다. 대사는 자신의 파티션 속성에 따라 다른 액체 크로마토 그래피 방법으로 구분됩니다. 이 방법에서는, 우리는 (UP) LC 방법을 마이크로 초 성과를 제시하지만, 프로토콜은 높은 흐름과 낮은 압력으로 확장됩니다. 질량 분석기에 도입 일반 또는 화합물 최적화 된 소스 조건 중 하나를 할 수 있습니다. 이온의 넓은 범위의 검출은 최근 C에 높은 해상도를 사용하여 광범위한 m / Z 범위에서 긍정적이고 부정적인 모드에서 전체 스캔 모드에서 수행됩니다악기를 alibrated. 레이블 무료 차동 분석은 생물 정보학 플랫폼에서 수행됩니다. 이 방법의 응용 프로그램은 대사 경로 검사, biomarker 발견과 약물 개발이 (가) 있습니다.
Introduction
HRMS 분야의 최근 기술 발전으로 인해, 타겟이 불분명 한, 가설 생성 대사 접근은 복잡한 시료의 분석 가능한 방법이되고 있습니다. 백만 루틴 낮은 부분을 촉진 100,000 해상도 (PPM)의 질량 정확도 수 1 질량 분석기 널리되고있다 여러 공급 업체에서 제공. 2,3이 질량 정확도는 더 특이 분석의 정체성, 동위 원소 패턴 인식, 내전 식별의 예비 할당에 대한 신뢰하실 수 있습니다. 4 적절한 추출 절차 및 고성능 LC 또는 UPLC, 복잡한 혼합물과 결합 할 때 유지 시간 데이터에서 파생 된 추가 특이성 분석 할 수 있습니다. 5 UPLC 더 큰 크로마토 그래피의 효율성을 소유하고 그 결과 큰 데이터 집합이 어떤에 통합 될 수있는 가능한 대사 체 6.의 큰 범위를 만드는 민감도, 해상도 및 분석 시간을 허용여러 개의 차동 분석 소프트웨어 및 유용한 패턴이나 관심의 개별 분석을 위해 채굴. 7,8,9,10,11 상상 속 히트 곡이 처음 피크 검출 알고리즘의 조합, 정확한 질량 기반의 화학 수식 예측, 조각 예측을 사용하여 식별 할 수있는, 그리고 화학 데이터베이스 검색을. 이 방법은 수 시간이 소요되는 전체 구조 식별을 위해 또는 더 민감하고 더 구체적인 안정 동위 원소 희석 개발을위한 목표 UPLC / 선택 또는 다중 반응 모니터링 / 정량에 대한 현재 금 표준 방법입니다 MS 연구. 12 우선 순위
생물학적 시료의 다양한 자연 뇨 13, 셀 14, 혈청 15, 또는 조직 16 추출 프로토콜 최적화되었다. 이 프로토콜 기능을 추출 세포, 혈청 및 조직합니다. 적절한 경우, 코멘트 및 추가 참조는 수정 여부에 대한 포함되어 있습니다절차 화 : 안정 동위 원소의 포함을 해결하거나, 특히 불안정한 대사 산물 포함 할 수 있습니다.
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Protocol
1. 세포 시료 전처리
- 세포의 10 센티미터 플레이트 : 미리 표시 10 mL 유리 원심 분리기 튜브에 미디어 해제 세포 현탁액의 1.5 ML를 수집합니다. 접착 라인의 경우, 세포는 얼음에 보관 매체의 1.5 ML에 부드러운된다고으로 해제해야합니다 옵션 :. 내부 표준 물질을 사용하는 경우,이 단계에서 적절한 나누어지는을 추가합니다.
코멘트 : 세포 대사의 담금질 특정 대사 산물 중요합니다. 시간에 민감한 대사 산물의 분석을 위해, 같은 차가운 메탄올 추출 등의 절차가 고려되어야한다. 17 - 샘플을 포함하는 10 ML 유리 튜브에 각각 6 클로로포름 ML (CHCl 3) / 메탄올 (CH 3 OH) (2:1 V / V)를 추가합니다. 30 분 동안 저속에 쉐이커 또는 다중 vortexer에 샘플을 설정합니다. 흔들어 후, 샘플은 4에서 10 분 동안 1,935 XG에서 낮은 가속 / 감속 설정으로 원심 분리 ° C 완전히 단계를 분리 할 수 있습니다.
선택 3 사용하지 않으려면, 추출은 (CH 2 망할 CIA 2) 디클로로 메탄으로 수행 할 수있다 18,12. - 긴 줄기 파스퇴르 피펫 사용하여 새 사전 표시 10 ㎖ 유리 원심 분리기 튜브에 유기 (아래) 레이어를 전송할 수 있습니다. 4.1 계속합니다.
- 나중에 깨끗한 플라스틱 2 ㎖ 에펜 도르프 튜브에 위 수성을 전송합니다. 질소 가스 하에서 시료를 증발. 액상 탈염을 위해 2.6.2을 계속하거나 직접 분석을 위해 4.1를 계속합니다.
2. 혈청의 샘플 추출
- 플라스틱 2 ㎖ 에펜 도르프 튜브에 혈청 20 μl를 전송 옵션 :. 내부 표준 물질을 사용하는 경우,이 단계에서 적절한 나누어지는을 추가합니다.
- 10 초 동안 CH 3 OH와 소용돌이의 190 μl를 추가합니다.
- 10 초 동안 CHCl 3와 소용돌이의 380 μl를 추가합니다.
- 상 분리를 유도하기 위해 H 2 O 120 μl를 추가합니다. 소용돌이 10 초 샘플 및 10에 대한 RT에서 평형 수분.
- 4시 10 분 8,000 XG에서 샘플을 원심 분리기 ° C 단계를 구분합니다.
- 깨끗한 플라스틱 2 ㎖ 에펜 도르프 튜브에 더 낮은 유기 상을 전송합니다. 4.1 계속합니다.
- 나중에 깨끗한 플라스틱 2 ㎖ 에펜 도르프 튜브에 위 수성을 전송합니다. 질소 가스 하에서 시료를 증발.
- 200 μL H 2 O에서 샘플을 다시 일시 중지합니다 산 또는 염기 시약 (0.1 % 아세트산, 포름산 0.1 %의 수산화 암모늄)를 우선적으로 산도에 민감한 대사를 추출하는 데 사용할 수 있습니다. 완전히 샘플을 다시 일시 중단 얼음에 20 분간 초음파 처리.
- 500 μL CH 3 OH와 C18 스핀 컬럼을 활성화합니다.
- 500 μL H 2 O의 두 세척과 스핀 열 평형 후 샘플을로드합니다. 산 / 염기 시약을 사용하는 경우 세척 단계에서이 농도를 유지한다.
- 샘플을 탈염하는 500 μL H 2 O로 씻으십시오. 산 / 염기 시약을 사용하는 경우 다시 세척이 농도를 유지단계.
- 이전 레이블 깨끗한 2 ㎖ 에펜 도르프 튜브에 H 2 O 3 OH CH 200 μL 80 %의 두 권으로 용출. 산 / 염기 시약을 사용하는 경우 다시 세척 단계에서이 농도를 유지한다. 4.1 계속합니다.
3. 조직의 샘플 추출
- 조직에 따라 냉동 조직의 10-100 밀리그램 사이에 사용합니다. 얼음 목욕 PBS 1 ㎖ (1 M, 산도 6.8)로 미리 표시된 2 ㎖ 낮은 유지 에펜 도르프 튜브에 조직의 모든 조각을 추가 선택 사항 :. 내부 표준 물질을 사용하는 경우 추가하기 전에, 버퍼에 추가 조직.
- 각 에펜 도르프에서 30 초 동안 전기 조직 분쇄기 얼음의 조직을 균질화. 샘플 사이, 각각 CH 3 OH와 H 2 O를 포함하는 두 개의 별도의 튜브에 조직 분쇄기를 청소하십시오.
- 미리 표시 10 mL 유리 원심 분리기 튜브에 플라스틱 피펫으로 조직 균질을 전송합니다. 전송 후 각 에펜 도르프 튜브 린스CH 3 OH 1 ㎖로 2 배와 유리 튜브에 조직 균질 액으로 세척을 추가합니다.
- 조직 균질 및 CH 3 OH 세척을 포함하는 10 ML 유리 튜브의 각 CHCl 3 4 ML을 추가합니다. 30 분 동안 저속에 쉐이커 또는 다중 vortexer에 샘플을 설정합니다.
- 진동 후 완전히 단계를 구분하는 10 분 동안 1,935 XG에서 낮은 가속 / 감속 설정으로 샘플을 원심 분리기 선택 :. 클로로포름을 사용하지 않으려면, 추출은 CH 2 망할 CIA 2 개발되었습니다.
- 긴 줄기 파스퇴르 피펫 사용하여 새 사전 표시 10 ㎖ 유리 원심 분리기 튜브에 유기 (아래) 레이어를 전송할 수 있습니다. 4.1 계속합니다.
- 긴 줄기 파스퇴르 피펫 사용하여 새 사전 표시 10 ㎖ 유리 원심 분리기 튜브에 수성 레이어를 전송합니다. 탈염을 위해 2.6.2로 이동하거나 4.1로 진행합니다.
4. 재 서스펜션과 UPLC에 대한 샘플의 여과
- SAMP을 증발질소 가스 하에서 레.
- 재구성하여 원하는 UPLC 방법 (표 1 참조) 시작 솔루션의 적절한 볼륨 샘플을 건조. 50-100 μL 일반적으로 바람직한 재 서스펜션 볼륨입니다. 부드럽게 소용돌이 및 / 또는 분석을 용해에 도움 아래 샘플을 피펫.
- 시료가 완전히 필터 (~ 5 분)를 통과 한 때까지 14,000 XG에에서 0.22 μm의 나일론 튜브 필터와 스핀에 샘플을 전송합니다. 샘플에 남아있는 침전물 눈에 보이는이 없는지 확인하십시오.
- 인서트 미리 표시 UPLC 유리 병에 필터링 된 시료의 상등액을 전송합니다. 캡 유리 병은, 다음 샘플 유리 병의 바닥에서 모든 거품을 제거하기 위해 유리 병을 가볍게. 냉장 자동 시료 주입기 (4-5 ° C)에서 샘플을 놓습니다.
5. UPLC 설정
- 액체 크로마토 그래프의 제어 소프트웨어를 사용에 나열된 조건을 기반 유기 샘플 실행을 만들
- UPLC 적절하게 평형을 허용합니다. 이 열을 연결하고 새 열 (보통 3-5 열 볼륨)의 평형 볼륨에 대한 제조 업체의 지침을 수행하기 전에 용매의 전체 프라이밍를 포함해야합니다. 미래의 문제를 진단하는 데 도움이되는 압력을 다시 시작 로그를 유지합니다.
6. 질량 분광계 설정
- 고해상도 질량 분석기의 제어 소프트웨어를 사용하여 표 2에 나열된 조건을 사용하여 긍정적 인 모드 메서드를 만듭니다. 그런 다음 같은 조건을 사용하여 음의 모드 메서드를 만듭니다 사항 :. 대상 분석 물질의 알려진 세트는 높은 INT의 경우erest 최적화 소스 및 이들 화합물의 무거운 표시된 아날로그를 사용하여 광학 조건 및이 조건을 사용하는 방법을 생성합니다.
- 기기를 청소하고 교정, 분광계에 안정적인 스프레이를 수립하고 적절하게 소스 및 광학에서 발산하는 교정 솔루션을위한 시간을 허용합니다. 스프레이 허용 안정성 LC 방법을 사용하는 것과 동일한 유량 보정 용액의 주입 최소 100 스캔을 통해 강도의 RSD ~ 5 %를 주어야한다.
- 모든 샘플에 대한 순서를 설정, 적절한 주입 볼륨을 설정하고 첫 번째 샘플 전에 빈을 실행합니다. 샘플 사이 이월 또는 행렬 효과가 의심되는 경우, 적절한 공백 / 세척을 실행합니다. 샘플 분석을 도입하는 일괄 처리 효과를 방지하기 위해 난수 생성기 및 키를 사용하여 무작위 방식으로 설정해야합니다.
코멘트 : 가능성이 대상의 안정 동위 원소 표준이나 분석 기준 등 품질 관리 샘플이 될 수 있습니다신뢰성, 재현성, 그리고 유효한 결과를 해결하고 보장에서 매우 중요. 용매 빈 다음에 표준 만 샘플의 기술적 복제는 빈 실행에 신호 강도 및 체류 시간의 편차뿐만 아니라 이월에 액세스 할 수 있습니다. - 순서를 시작하고 압력 변동, 또는 실행을 통해 신호 강도의 손실을 포함하여 문제를 주기적으로 모니터링 할 수 있습니다. 심각한 문제가 발견되는 경우, 실행을 중지하고 6.2에서 반복합니다.
7. 차이 분석
- 두 워크 플로는이 프로토콜에 대한 안내되게됩니다. 첫 번째는 SIEVE 2.0, 써모 피셔에 의해 판매 독점 레이블 무료 차동 분석 소프트웨어를 통해이다. 두 번째 워크 플로 차이 분석을 시작하기 전에 XCMS 온라인, 스크립스 연구소를 통해 무료 플랫폼을 제공합니다. 11까지이며, 수동 틱을 확인하거나 실행의 재현성을 보장하기 위해 예제의 모든 알려진 화합물 여과 크로마토 그램에서 보면모든 샘플에 걸쳐 주입 / UPLC / 스프레이 안정성.
- SIEVE
- 질량 분석기에서 SIEVE가 설치된 워크 스테이션의 하드 드라이브에. 원시 데이터 파일을 전송합니다. (참고 : 분석의 속도를 제한 할 수있는 네트워크 또는 USB 포트에 연결된 드라이브에 저장된 데이터 자체를 실행하는 것이 좋습니다되지 않습니다.)
- 열기 체, 새로운 실험을 시작합니다.
- SIEVE에 해당 파일을로드합니다.
- 비교 그룹을 지정하고 SIEVE 분석을위한 변수를 생성 할 수 있도록하는 하나의 참조 파일을 선택합니다.
- 프롬프트 및 개별 실험의 요구 사항에 따라 모든 매개 변수를 조정하십시오. 그것은 엄격한 매개 변수와 함께 시작하고 되돌아 가서 더 관대 한 설정은 분석 시간을 길게 수있는 매개 변수를 느슨하게하는 것이 좋습니다.
- 매개 변수에서 양 또는 음의 모드에 대한 올바른 부가 생성물 목록을로드합니다.
- XCMS 온라인
- 파일을 변환온라인 XCMS에 대한 허용 형식으로. 우리의 경우, 우리는 형식을 mzXML로 변환. 19
- 오픈 XCMS 온라인 및 작업을 만듭니다.
- 업로드 및 데이터 세트 이름을 지정합니다. 두 데이터 집합 (예 : 제어 대 치료) 독립형 XCMS는 헤드 투 헤드 비교로 제한되어 있으므로 업로드 할 수 있습니다.
- 드롭 다운 목록에서 원하는 설정을 선택합니다. 미리 채워진 매개 변수를 다른 기기에 설치할 경우에 사용할 수 있으며, 이러한 추가 실험 필요를 수정할 수 있습니다. 우리의 경우, 우리는 HPLC-Orbi2 설정을 사용합니다.
- 제출하고 작업을 확인합니다.
- 데이터 분석
- 분석이 완료되면 SIEVE 및 XCMS에 대한 각각 구조와 기능의 목록이 채워집니다. LC 정렬은 모든 랜드 마크 피크를 겹쳐 있는지 확인합니다. 정렬되지 않은 LC가 실행 중 하나가 랜드 마크 피크에 큰 편차를 표시하는 경우이 샘플 문제를 나타낼 수 있습니다.
옵션 : 내부 표준 물질을 사용하는 경우 SIEVE를 들어, 위치해당 피크 그룹과 선택된 프레임에 정상화. 온라인 XCMS를 들어, 정규화 보낸 후 스프레드 시트에서 수행 할 수 있습니다. - 같은 샘플 집단 (예를 들어, 컨트롤 샘플) 내 변동 계수 (CV)에 의해 데이터를 플롯합니다. 어떤 큰 CV 값은 하나 또는 그 이상의 샘플 문제를 나타낼 수 있습니다. 원하는 특성 (예를 들어, P-값 <0.05, 겹 변경> 1.5 그룹 내에서 낮은 표준 편차 등)에 따라 목록을 정렬합니다.
- 그룹간에 적절한 피크 정렬, 피크 통합, 가우스 피크 모양, 신호 강도, 동위 원소 및 부가 생성물 할당 각 피크를 검사합니다.
- 추가 분석을 위해 원하는 데이터를 내보내거나 확인 및 MS n 개의 실험 대상 물질 목록을 생성 할 수 있습니다.
- 분석이 완료되면 SIEVE 및 XCMS에 대한 각각 구조와 기능의 목록이 채워집니다. LC 정렬은 모든 랜드 마크 피크를 겹쳐 있는지 확인합니다. 정렬되지 않은 LC가 실행 중 하나가 랜드 마크 피크에 큰 편차를 표시하는 경우이 샘플 문제를 나타낼 수 있습니다.
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Representative Results
제시된 결과는 농약과 미토콘드리아 복잡한 I 억제제 로테 논을 가진 SH-SY5Y 아교 모세포종 세포의 6 시간 처리에서 선택된 데이터를 보여줍니다. 간결 만 유기 상 긍정적 인 모드 데이터가 표시됩니다. 샘플을 처리하고 위에서 설명한대로 분석 (그림 1, 표 1, 표 2)와 레이블이없는 정량 SIEVE 및 XCMS 온라인으로 두 개의 차동 분석 플랫폼에 탑재되었다. 조회수 많은 수의 (그림 2, 그림 3) 차동 분석에 사용되는 두 개의 프로그램으로 식별되지만 이러한 기능은 가능성 유물, 제대로 통합 봉우리, 그리고 의심 분석 값의 다른 기능이 포함되어 있습니다. 이것은 적절한 신호 강도, 같은 그룹의 샘플 배경 수준, 좋은 크로마토 그래피 피크 모양 (그림 3)과 낮은 변동에 대한 안타를 심사하여 판단 할 수 있습니다.
downstre을 보여초기 히트의 확인입니다, 우리는 3 ppm으로 내 우리의 치료 화합물 로테 논 (그림 3, 그림 4)에 해당하는 질량 기능을 분리. 우리는 UPLC-HR/tandem 대량 샘플의 분석법 (MS / MS)와 순수한 화합물 (그림 5)와 함께이 분석의 ID를 확인합니다. 우리는 또한 잠정적으로 정확한 질량 데이터베이스 검색 (그림 3)에 의해 D-pantethine로 확인 로테 논 투여군에서 감소 차동 풍부한 기능을 식별합니다.
그림 1. Microspray UPLC-HRMS에 의한 시료 준비 및 분석을위한 일반적인 실험 개요. 내부 표준 단백질이나 지질 / 단백질 함량 분석의 선택적 도입 등 샘플 준비의 일반 개요. 다른 IO에 의한 상 분리, 액체 크로마토 그래피 및 분석질량 분석기에서 N 모드가 설명되어 있습니다.
표 1. UPLC 조건. 일반 및 화합물 최적화 된 UPLC 조건. 유기농 1 단계 1.8 35 히터에 보관 워터스 nanoACQUITY C18 BEH130 칼럼을 통해 μL / min의 일정한 유량 ° C가 사용되었습니다. 용매 A : 99.5 % 0.1 % 포름산, 용매 B와 water/0.5 % 아세토 니트릴 : 유기농 2 단계를위한 98 % 아세토 니트릴 / 0.1 % 개미산 2 %의 물, Acentis 익스프레스 C8 컬럼을 통해 3.4 μL / min의 일정한 유량 35 히터에 보관 ° C를 사용 하였다. 용매 : 40 % 0.1 % 포름산 10 MM의 암모늄 편대, 용매 B와 water/20 % 아세토 니트릴 : 90 % 수용액 0.1 % 포름산 10 MM의 암모늄 편대와 isopropanol/10 % 아세토 니트릴, 일정한 유량 1.2 μ L / 35 히터에 보관 워터스 nanoACQUITY C18 BEH130 열을 통해 분은 ° C가 사용되었습니다. 95 % 메탄올 / 0.1 % 수산화 암모늄과 5 % 물 : 용매 A : 0.1 % 수산화 암모늄, 용매 B와 물 95 % / 5 % 메탄올.
그림 2. 거울 플롯 XCMS으로 생성됩니다. 감지 및 유기 상 긍정적 인 모드 UPLC-MS 분석에서 온라인 XCMS를 통해 정량화으로 거울 음모 차동 풍부한 기능을 표시합니다. 각 점은 별개 "기능을."를 나타냅니다 빨간색 점은 치료에 더 풍부 반면 녹색 점은 컨트롤에 (큰 통합 지역) 더 풍부한 기능입니다. 도트의 크기를 늘리면 그룹 사이에 배 변화의 증가 크기를 나타내며, 색의 강도 색상의 증가 채도 감소 P-값을 나타냅니다.
그림 3. 분석 봉우리. 유기 상 양이온 모드 UPLC-MS 분석을 보여주는 크로마토 그램. SIEVE 2.0. B에서 전류 A) 수정했습니다 (정렬) 총 이온 (TIC))은 잠정적 XCMS를 통해 D-pantethine으로 식별 기능에 대한 이온 크로마토 그램을 추출. C는 ) 나중에 TIC로 정규화 SIEVE에서 로테로 식별 기능에 대한 XIC하기 SIEVE. D에서 로테로 식별 기능)을위한 이온 크로마토 그램을 추출. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
PG "/>
그림 4. .) 인간의 대사 체 데이터베이스 (에 대한 데이터베이스 검색 결과 데이터베이스 안타 http://www.hmdb.ca )와 B) ChemSpider / KEGG (SIEVE를 통해) (단독 ChemSpider도 사용될 수있다 - http://www.chemspider.com )은 이러한 이온의 확인에 따라 M / Z 555.2516와 395.1481의 이온에 해당하는 그림 3B, 3C 및 3D에 표시된 기능에 대한 정확한 질량의 결정을 사용하여 [MH] + 종. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 5. HR / MS / MS Structural 확인.) 유사한 보존 기간 및 B) 같은과 상업 표준 UPLC-MS/MS 비교를 기반으로 로테로 23.22 분의 유지 시간 395.1481 m / Z의 이온에 해당하는 기능을 식별 확인 거의 동일한 조각을 가진 M / Z는 (395.1481 ~ 0 PPM 오류). 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
| 질량 분석 매개 변수 | 설정 | 논평 |
| 출처 | ESI | Michrom CaptiveSpray |
| 이온 모델 | 양수 또는 음수 | |
| 방법 길이 | 변수 (~ 40-60 분) | |
| 해결 | 60,000-100,000 | |
| 스프레이 (kV의) | 1.75 | |
| 튜브 렌즈 (V) | 130 | 종속 대상 화합물 |
| 모세관 온도 (° C) | 250 | 스프레이 팁의 수명이 단축 될 수 있습니다 |
| 모세관 전압 (V) | 50 | 종속 대상 화합물 |
| 데이터 형식 | 중심 | (프로파일 데이터에 대해 설명을 참조하십시오) |
표 2. MS 설정. 일반 및 화합물 최적화 된 질량 분석기의 설정은 Michrom 열 사전 포로 스프레이 ESI 소스와 LTQ XL-Orbitrap에 사용됩니다.
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Discussion
타겟이 불분명 한 대사는 내인성 또는 생체이 biotransformations을 조사하거나, 그 샘플의 대사 프로파일을 캡처하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 해상도와 감도, 생성 된 대용량 데이터를 처리 할 수있는 능력을 샘플을 분리하고 분석하는 데 사용되는 기술과 유용한 정보 (예 : 정확한 질량 데이터베이스 검색)에 대한 데이터 집합을 채굴 할 수있는 능력을 가진 기술 저울의 출력. 최근, 이것은 고해상도 질량 분석기의 발전에 의해 촉진, 고 또는 초 고성능 액체 크로마토 그래피되었습니다. 차동 분석 소프트웨어는 분석 병목 현상을 해결하고 있으며, 적절한 정보학 파이프 라인의 높은 처리량. 20,21,22 선택과 유지 시간 교대, 필터링 및 통계 분석을위한 피크 검출 조정을 수행 할 수있는 것은, 알고리즘을 centroiding 데이터와 같은 고려 사항을 포함해야 피크 탐지, 첨단 통합, alignmenT, MS / MS 데이터를 통합 할 수있는 능력, 그리고 동위 원소 또는 부가 물을 다루는 능력. 적절한 정보학 데이터베이스으로 23 선택도 고려되어야한다. 특정 데이터베이스 24,25,26,27 현재의 부족함을 종합적으로 화합물을 식별하고 통합하는 정확한 질량 데이터, MS / MS 데이터 또는 LC 데이터 필드에 큰 문제가 남아있다.
여기에 제시된 워크 플로는 액체 - 액체 추출, 마이크로 플로우 액체 크로마토 그래피 및 세포 배양 치료 모델에서 보여준 두 개의 서로 다른 차이 분석 소프트웨어 플랫폼과 고해상도 질량 분석을 통합합니다. 또한, 추출 프로토콜이 비슷한 분석을위한 유용한 샘플이 될 수 있으므로, 혈청 및 조직에 대해 나열됩니다.
타겟이 불분명 한 대사를 위해 사용되는 방법은 반복, 안정 UPLC 조건 및 소스 안정성을 최적화해야하지만, 몇 가지 변화가 불가피하다. SIEVE 및 XCMS 알로 두체류 시간의 변화,하지만 특별한주의에 대한 W 보정은 실험에서 설정 한 매개 변수가 변화를 해결하기 위해 적합 함을 보장하기 위해 지불해야한다. 또한, 내부 규격 (들)로 표시 안정 동위 원소는 쉽게 유물과 표본 추출 또는 LC-MS 분석의 차이로 인한 간 샘플 편차를 줄이기 위해이 프로 시저에 통합 할 수 있습니다. 모든 민감한 LC-MS 방법론과 마찬가지로 12, 그것은 매우 중요합니다 고순도 시약을 사용하고, 샘플 준비가 원하지 않는 미립자 물질 또는 집계를 제거되었는지 확인합니다. 유물은 오염 물질의 일반적인 변화에 의해 생성 될 수 있고, 추정 안타 추출 또는 분석 과정의 사실 유비 쿼터스 오염 물질에 있지 않은지 확인하는 것이 바람직 할 수 있습니다.
방법은 "불분명"또는 "공정한"대사로 표시되어 있지만 마지막으로,이 부분 명칭이 잘못된 것입니다. 추출, 분리 및 분석의 본질은 특정 characteris과 대사 산물을 선호합니다질량 분석기의 소스에서 추출, 분리시 고정 및 이동상과의 상호 작용, 그리고 이온화 동안 안정성 등의 틱. 28,29,30 가능한 장비에 따라,이 절차는 다른 추출, 유량, LC 압력에 적용 할 수 있습니다 이온 소스, 또는 질량 분석기. 그러므로, 우리는 특정 조건이 일반적인 지식이나 관심 분자의 클래스의 내부 표준 대표를 기반으로 최적화 할 수있는 절차에 메모를 포함했다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 NIH 보조금 P30ES013508 및 5T32GM008076의 지원을 인정합니다. 우리는 또한 SIEVE 2.0 및 박사 부부에 액세스하기 위해 온도 과학을 감사합니다. 유용한 토론 유진 Ciccimaro 및 온도 과학의 마크 샌더스.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
References
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