Summary
Untargeted metabolomics stellt eine Hypothese generieren Momentaufnahme eines metabolischen Profils. Dieses Protokoll wird zeigen, die Extraktion und Analyse von Metaboliten von Zellen, Serum oder Gewebe. Eine Reihe von Metaboliten werden mit flüssigem befragten-Flüssigphasenextraktion, Mikroströmungsfühler UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie / hochauflösende Massenspektrometrie (UPLC-HRMS), gekoppelt mit Differential-Analyse-Software.
Abstract
Hier präsentieren wir einen Workflow, um die metabolische Profile für biologische Proben des Interesses einschließlich analysieren; Zellen, Serum oder Gewebe. Die Probe wird zunächst in polaren und nicht-polaren Fraktionen durch eine Flüssig-Flüssig-Flüssig-Extraktion abgetrennt und teilweise gereinigt, um stromabwärts Analyse zu erleichtern. Sowohl wässrige (polare Metaboliten) und organischen (nicht-polaren Metaboliten) Phasen der ersten Extraktion verarbeitet werden, um eine breite Palette von Metaboliten zu überblicken. Stoffwechselprodukte werden von verschiedenen Flüssigkeits-Chromatographie-Methoden auf ihre Eigenschaften Partition Basis getrennt. Bei diesem Verfahren stellen wir Mikroströmungsfühler ultra-Leistung (UP) LC-Methoden, aber das Protokoll ist skalierbar, um höhere Ströme und niedrigere Drücke. Einführung in das Massenspektrometer kann entweder durch allgemeine oder Verbindung optimierte Quelle Bedingungen. Erkennung von einem breiten Spektrum von Ionen erfolgt im Full-Scan-Modus in positive und negative Modus durchgeführt über einen breiten m / z-Bereich mit hoher Auflösung auf einem kürzlich calibrated Instrument. Markierungsfreie Differentialanalyse wird auf Bioinformatik-Plattformen durchgeführt. Anwendungen dieses Ansatzes umfassen Stoffwechselweg Screening zur Entdeckung von Biomarkern und Entwicklung von Arzneimitteln.
Introduction
Aufgrund der jüngsten technologischen Fortschritte auf dem Gebiet der HRMS haben ungezielte, Hypothesen-Generierung metabolomics Ansätze werden eine praktikable Ansatz zur Analyse von komplexen Proben. 1-Massenspektrometer zur Auflösung 100.000 erleichtert Routine niedrigen Teil pro Million (ppm) Massegenauigkeit haben sich weitgehend von verschiedenen Herstellern. 2,3 Diese Masse Genauigkeit ermöglicht eine größere Spezifität und Vertrauen in eine vorläufige Zuordnung der Analyten Identität Isotopen Mustererkennung und Addukt Identifikation. 4 Wenn mit einem geeigneten Extraktionsverfahren und High-Performance-LC oder UPLC, komplexe Mischungen gekoppelt kann mit zusätzlichen Spezifität von Verweilzeit Daten abgeleitet analysiert werden. 5 UPLC besitzt größere chromatographische Effizienz und ermöglicht eine höhere Empfindlichkeit, Auflösung und Analyse Zeit macht eine größere Abdeckung des Metaboloms möglich. 6 Die entstehenden großen Datenmengen können in einem integriert werdenmehrerer Differential-Analyse-Software und abgebaut für brauchbare Muster oder einzelne Analyten von Interesse. 7,8,9,10,11 Putative Treffern zunächst identifiziert werden mit einer Kombination aus Spitze Algorithmen, genaue Masse basierte chemische Formel Vorhersage, Fragmentierung Vorhersage und chemische Datenbank suchen. Dieser Ansatz ermöglicht die Priorisierung von Zielen für zeitaufwändige vollständige strukturelle Identifizierung oder für die Entwicklung von empfindlicher und präziser Isotopenverdünnungsanalyse UPLC / ausgewählte oder multiple reaction monitoring / MS-Studien, dass die derzeitige Goldstandard Methoden zur Quantifizierung sind. 12
Die unterschiedliche Art von biologischen Proben ist die Optimierung der Extraktion Protokolle für Urin 13 Zellen 14, 15 Serum oder Gewebe 16 geführt. Dieses Protokoll bietet Extraktionen für Zellen, Serum und Gewebe. Gegebenenfalls haben Kommentare und weitere Referenzen für Modifikationen einbezogengen des Verfahrens zur Bewältigung Einbeziehung von stabilen Isotopen, oder für die Aufnahme von besonders instabilen Metaboliten.
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Protocol
1. Beispiel Extraktion aus Zellen
- Für eine 10 cm Platte von Zellen: collect 1,5 ml angehoben Zellsuspension in Medien in ein beschriftetes 10 ml Glaszentrifugenröhrchen. Für Anhänger Linien sollten die Zellen mit sanften Schaben in 1,5 ml Medium auf Eis gehalten angehoben werden. Optional: Wenn interne Standards verwendet werden, fügen Sie die entsprechende Aliquot bei diesem Schritt.
Kommentar: Abschrecken des Zellstoffwechsels ist entscheidend für bestimmte Metaboliten. Für die Analyse von Zeit-und Kleinschreibung Metaboliten sollten Verfahren wie kalte Methanolextraktion Betracht gezogen werden. 17 - 6 ml Chloroform (CHCl 3) / Methanol (CH 3 OH) (2:1, v / v) zu jedem der 10 ml Glasröhrchen mit den Proben. Stellen Sie die Proben in einem Shaker oder Multi-Vortexer bei niedriger Geschwindigkeit für 30 min. Nach dem Schütteln werden die Proben mit einer geringen Beschleunigung / Verzögerung Einstellung bei 1.935 xg für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert, um die Phasen vollständig zu trennen.
Wahlfrei 3, Extraktionen mit Dichlormethan durchgeführt werden (CH 2 Cl 2) 18,12. - Mit einem langen Stiel Pasteurpipette übertragen die organische (untere) Schicht auf eine neue Pre-markierten 10 ml Glaszentrifugenröhrchen. Weiter zum 4.1.
- Übertragen Sie die obere wässrige später in einen sauberen Kunststoff 2 ml Eppendorf-Röhrchen. Verdampft die Probe unter Stickstoffgas. Weiter zu 2.6.2 für wässrige Phase Entsalzung oder weiter auf 4,1 für die direkte Analyse.
2. Beispiel Extraktion aus Serum
- Übertragen Sie 20 ul Serum in einem Kunststoff 2 ml Eppendorf-Röhrchen. Optional: Wenn interne Standards verwendet werden, fügen Sie die entsprechende Aliquot bei diesem Schritt.
- In 190 ul CH 3 OH und Vortex für 10 Sekunden.
- In 380 ul CHCl 3 und Vortex für 10 Sekunden.
- In 120 ul H 2 O, um eine Phasentrennung zu induzieren. Vortex die Proben für 10 sec und damit bei RT für 10 äquilibrierenmin.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 8000 g für 10 min bei 4 ° C, um die Phasen zu trennen.
- Übertragen Sie die untere organische Phase in einen sauberen Kunststoff 2 ml Eppendorf-Röhrchen. Weiter zum 4.1.
- Übertragen Sie die obere wässrige später in einen sauberen Kunststoff 2 ml Eppendorf-Röhrchen. Verdampft die Probe unter Stickstoffgas.
- Re-suspend die Probe in 200 ul H 2 O. Säure oder Base Reagenzien (0,1% Essigsäure, Ameisensäure oder 0,1% Ammoniumhydroxid) verwendet werden, um bevorzugt extrahieren pH-empfindliche Metaboliten werden. Ultraschallbad für 20 min auf Eis, um erneut zu suspendieren die Probe vollständig.
- Aktivieren Sie die C18-Spin-Säulen mit 500 ul CH 3 OH.
- Equilibrieren die Spin-Säule mit zwei Waschungen von 500 ul H 2 O und laden Sie dann die Probe. Wenn Säure / Base-Reagenzien verwendet werden, halten diese Konzentration in den Waschschritten.
- Waschen mit 500 ul H 2 O, um die Probe zu entsalzen. Auch wenn Säure / Base-Reagenzien verwendet werden, halten diese Konzentration in der WäscheSchritte.
- Eluieren mit zwei Volumen von 200 ul 80% CH 3 OH in H 2 O in ein beschriftetes sauberes 2 ml Eppendorf-Röhrchen. Auch wenn Säure / Base-Reagenzien verwendet werden, halten diese Konzentration in den Waschschritten. Weiter zum 4.1.
3. Beispiel Extraktion aus Gewebe
- Je nach Gewebe zwischen 10-100 mg von gefrorenem Gewebe verwenden. Fügen Sie das ganze Stück Gewebe zu einer pre-markierten 2 ml low retention Eppendorf-Röhrchen mit 1 ml PBS (1 M, pH 6,8) in einem Eisbad. Optional: Wenn interne Standards verwendet werden, fügen Sie es in den Puffer, bevor das Gewebe.
- Homogenisieren des Gewebes im Eis mit einer elektrischen Schleifmaschine Gewebe für 30 sec in jedem Eppendorf. Zwischen Proben, reinigen das Gewebe Mühle in zwei getrennten Röhren mit CH 3 OH und H 2 O auf.
- Übertragen Sie die Gewebehomogenat mit einer Kunststoff-Pipette in ein beschriftetes 10 ml Glaszentrifugenröhrchen. Nach der Übertragung, spülen jedes Eppendorf-Röhrchen2x mit 1 ml CH 3 OH und fügen Sie die Waschungen der Gewebehomogenat in den Glasröhren.
- 4 ml CHCl 3 zu jeder der 10 ml-Röhrchen, die das Gewebe-Homogenat und CH 3 OH wäscht. Stellen Sie die Proben in einem Shaker oder Multi-Vortexer bei niedriger Geschwindigkeit für 30 min.
- Nach dem Schütteln, zentrifugieren Sie die Proben mit einer geringen Beschleunigung / Verzögerung Einstellung bei 1.935 xg für 10 min vollständig zu trennen die Phasen Optional:. Um zu vermeiden, mit Chloroform, haben Extraktion mit CH 2 Cl 2 entwickelt worden.
- Mit einem langen Stiel Pasteurpipette übertragen die organische (untere) Schicht auf eine neue Pre-markierten 10 ml Glaszentrifugenröhrchen. Weiter zum 4.1.
- Mit einem langen Stiel Pasteurpipette übertragen die wässrige Schicht auf eine neue Pre-markierten 10 ml Glaszentrifugenröhrchen. Gehe zu 2.6.2 für Entsalzung oder weiter auf 4,1.
4. Re-Suspension und Filtration von Proben für UPLC
- Man dampft das samples unter Stickstoffgas.
- Den Inhalt herabgetrocknetes Proben in einem geeigneten Volumen der Ausgangslösung für die gewünschte UPLC Methode (siehe Tabelle 1). 50-100 ul ist in der Regel eine wünschenswerte Resuspension Volumen. Vortexen und / oder einer Pipette die Probe nach oben und unten, um das Lösen der Analyten zu unterstützen.
- Übertragen Sie die Probe in einen 0,22 um Nylon-Rohr-Filter und drehen sich mit bis zu 14.000 xg, bis die Probe vollständig durch den Filter (ca. 5 Min.) geleitet. Stellen Sie sicher, dass es keine sichtbare Partikel in der Probe verbleibt.
- Den Überstand des gefilterten Probe in ein beschriftetes UPLC Fläschchen mit Einsatz. Cap Fläschchen, dann streichen Sie das Fläschchen, um alle Blasen aus dem Boden der Probe Fläschchen entfernen. Legen Sie die Probe in der gekühlten Autosampler (4-5 ° C).
5. UPLC-Setup
- Mit der Steuer-Software für die Flüssigkeitschromatographen, erstellen Sie einen Lauf für die organischen Probe aus der genannten Bedingungen in der Basis
- Lassen Sie die UPLC angemessen auszugleichen. Dies sollte eine vollständige Grundierung von Lösungsmitteln, bevor Sie eine Spalte, und nach den Anweisungen des Herstellers für die Äquilibrierung Volumen von einer neuen Spalte (in der Regel 3-5 Säulenvolumen) umfassen. Pflegen Sie ein Protokoll ab Rückdrücke zur Diagnose zukünftige Probleme.
6. Massenspektrometer-Setup
- Mit der Steuersoftware für den hochauflösenden Massenspektrometer, erstellen Sie eine positive Mode-Verfahren unter Verwendung der in Tabelle 2 aufgeführt. Dann unter den gleichen Bedingungen, einen negativen Modus Verfahren Optional:. Wenn ein bekannter Satz von Analyten sind von hoher intERest, zu optimieren und eine Optik, mit der schweren Bedingungen markiertes Analogon dieser Verbindungen enthält, und eine Methode unter Verwendung dieser Bedingungen.
- Reinigen und kalibrieren Sie das Gerät, eine stabile Spray in das Spektrometer und genügend Zeit für die Kalibrierung Lösung angemessen von der Quelle und Optik abzuleiten. Akzeptabel Stabilität der Spray sollte eine 3-5% der Intensität über mindestens 100 Scans RSD mit Einspritzung der Kalibrierlösung zur gleichen Durchfluss wie die LC-Methode verwendet wird.
- Richten Sie die Sequenz für alle Proben, setzen entsprechende Injektionsvolumen, und führen Sie eine leere vor der ersten Probe. Wenn Verschleppung oder Matrix-Effekte zwischen den Proben vermutet werden, laufen angemessene Rohlinge / Wäschen. Die Proben sollten Einrichtung in einer randomisierten Weise unter Verwendung eines Zufallszahlengenerators und eine Taste, um die Charge durch die Analyse eingeführt Wirkungen zu vermeiden.
Kommentar: Qualitätskontrolle Proben einschließlich stabiler Isotope Normen oder Analysestandards wahrscheinliche Ziele können seinäußerst wertvoll bei der Fehlersuche und Sicherung zuverlässige, reproduzierbare und valide Ergebnisse. Ein technisches Replikat eines Standard nur Probe durch eine Blindlösung gefolgt kann verwendet werden, um Zugriff auf Abweichung von Signalintensität und Verweildauer sowie Verschleppung in die leere run werden. - Start-Sequenz und überwachen regelmäßig für Probleme wie Druckschwankungen oder Verlust der Signalstärke in der Flucht. Wenn eine schwere Probleme erkannt werden, stoppen den Lauf, und wiederholen von 6,2.
7. Differential Analysis
- Zwei Workflows werden für dieses Protokoll vorgestellt. Die erste ist durch SIEVE 2.0, proprietäre markierungsfreie Differential-Analyse-Software von Thermo Fisher verkauft. Der zweite Workflow ist durch XCMS Online, eine kostenlose Plattform durch Scripps Research Institute. 11. Vor Beginn Differentialanalyse, manuell überprüfen die Tics oder schauen gefiltert Chromatogramme für jede bekannte Verbindung in der Probe, um die Reproduzierbarkeit der Läufe zu gewährleistenund Einspritzung / UPLC / Aerosol Stabilität in allen Proben.
- SIEVE
- Übertragen Sie die. Rohdaten aus dem Massenspektrometer auf die Festplatte der Workstation, SIEVE installiert ist. (Anmerkung: Laufen Sieb mit Daten auf einem vernetzten oder USB-Port angeschlossen Laufwerk gespeichert ist nicht ratsam, da sie die Geschwindigkeit der Analyse können zu begrenzen.)
- Offene SIEVE, und beginnen ein neues Experiment.
- Legen Sie die entsprechenden Dateien in SIEVE.
- Weisen Vergleichsgruppen und wählen Sie eine einzelne Referenz-Datei, damit SIEVE, um die Parameter für die Analyse zu generieren.
- Folgen Sie den Anweisungen und stellen Sie alle Parameter pro Anforderungen jedes einzelnen Experiments. Oft ist es ratsam, mit strengen Parametern zu starten und dann gehen Sie zurück und lösen Sie die Parameter als großzügiger Einstellungen Analyse Zeit verlängern kann.
- Legen Sie das richtige Addukt Liste für positive oder negative Modus in den Parametern.
- XCMS Online
- Konvertieren von Dateienin einem akzeptablen Format für XCMS Online. In unserem Fall, wandeln wir mzXML Format. 19
- Offene XCMS Online und E-Mail Job.
- Upload und nennen Datensätzen. Nur zwei Datensätze (zB Steuerung vs Behandlung) können als Stand-alone-XCMS wird Kopf-an-Kopf-Vergleiche beschränkt hochgeladen werden.
- Wählen Sie die gewünschten Einstellungen aus der Dropdown-Liste. Pre-besiedelte Parameter sind für verschiedene Instrumente Setups zur Verfügung, und diese können weiter für experimentelle Bedürfnisse modifiziert werden. In unserem Fall nutzen wir die HPLC-Orbi2 Einstellungen.
- Senden und bestätigen Job.
- Data Analysis
- Für SIEVE und XCMS eine Liste der Rahmen und Ausstattung, bzw. aufgefüllt wird, sobald die Analyse abgeschlossen sein. Stellen Sie sicher, dass die LC Ausrichtung keine Wahrzeichen Peaks überlagert. Wenn eine der unaligned LC läuft große Abweichung zeigen in Wahrzeichen Gipfel kann dies auf ein Problem mit der Probe.
Optional: Für SIEVE, wenn interne Standards verwendet werden, findendie entsprechende Peakgruppe und zu normalisieren, um die ausgewählte Fassung. Für XCMS On-line können Normalisierung in einer Tabellenkalkulation nach der Ausfuhr durchgeführt werden. - Zeichnen Sie die Daten, die von der Variationskoeffizient (CV) innerhalb einer Probe wie Bevölkerung (zB Kontrollproben). Alle großen CV-Werte kann auf ein Problem mit einem oder mehreren Probe. Sortieren Sie die Liste auf die gewünschten Eigenschaften (z. B. p-Wert <0,05, Fold Change> 1.5, niedrige Standardabweichung innerhalb einer Gruppe, etc.) basiert.
- Untersuchen Sie jeden Peak für Peak entsprechende Ausrichtung über Gruppen, Peak-Integration, Gauß-Peak-Form, Signalintensität, Isotope und Addukt Zuordnung.
- Exportieren von Daten als für die weitere Analyse gewünscht oder gezielt Masse Listen zur Bestätigung und MS n Experimente zu generieren.
- Für SIEVE und XCMS eine Liste der Rahmen und Ausstattung, bzw. aufgefüllt wird, sobald die Analyse abgeschlossen sein. Stellen Sie sicher, dass die LC Ausrichtung keine Wahrzeichen Peaks überlagert. Wenn eine der unaligned LC läuft große Abweichung zeigen in Wahrzeichen Gipfel kann dies auf ein Problem mit der Probe.
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Representative Results
Die vorgestellten Ergebnisse zeigen ausgewählte Daten aus einer 6-stündigen Behandlung von SH-SY5Y Glioblastom-Zellen mit dem Pestizid und mitochondrialer Komplex I-Inhibitor Rotenon. Der Kürze halber werden nur die organische Phase positive Mode-Daten dargestellt. Die Proben wurden aufgearbeitet und analysiert, wie oben beschrieben (Abbildung 1, Tabelle 1, Tabelle 2) geladen und auf zwei Differentialanalyse Plattformen für Label-freie Quantifizierung SIEVE und XCMS online. Obwohl eine große Anzahl von Treffern (Abbildung 2, Abbildung 3) durch die beiden Programme für differenzielle Analyse verwendet werden identifiziert diese Features sind wahrscheinlich Artefakte, schlecht integrierten Spitzen, und andere Merkmale der fragwürdigen analytischen Wert. Dies kann durch Screening Hits für die entsprechende Signalintensität, geringe Abweichungen zwischen den Proben der gleichen Gruppe, Hintergrund Ebenen und gute Chromatographiespitze Formen (Abbildung 3) beurteilt werden.
Um das zu demonstrieren downstrebin Bestätigung der ersten Hits, isolieren wir eine Funktion mit einer entsprechenden Masse unserer Behandlungsverbindung rotenone innerhalb von 3 ppm (Abbildung 3, Abbildung 4). Wir bestätigen die Identität dieser Analyten mit UPLC-HR/tandem Massenspektrometrie (MS / MS) unserer Probe und der reinen Verbindung (Abbildung 5). Darüber hinaus sehen wir ein differentiell reichlich Feature im Rotenon behandelten Gruppe, vorläufig als D-Pantethin durch genaue Masse Datenbanksuche (Abbildung 3) identifiziert reduziert.
Abbildung 1. Allgemeine Experimentelle Gliederung für die Probenvorbereitung und Analyse durch Microspray UPLC-HRMS. Einen allgemeinen Überblick über die Probenvorbereitung, einschließlich der optionalen Einführung des internen Standards und Protein oder Lipid / Protein-Content-Analyse. Phasentrennung, Flüssigkeits-Chromatographie und Analyse von verschiedenen ion Moden im Massenspektrometer dargestellt.
Tabelle 1. UPLC AGB. Allgemeine und optimierte Verbindung UPLC Bedingungen. Für organische Phase 1 konstanten Fließgeschwindigkeit von 1,8 ml / min durch ein Waters nanoACQUITY C18 BEH130 Spalte in einer Heizvorrichtung bei 35 ° C verwendet wurde. Lösungsmittel A: 99,5% water/0.5% Acetonitril mit 0,1% Ameisensäure, Lösungsmittel B: 98% Acetonitril / 2% Wasser mit 0,1% Ameisensäure Für organische Phase 2, konstanten Flussrate von 3,4 ml / min durch eine Acentis Express C8-Säule gehalten in einer Heizvorrichtung bei 35 ° C verwendet wurde. Solvent A: 40% Wasser und 20% Acetonitril mit 0,1% Ameisensäure und 10 mM Ammoniumformiat, Lösungsmittel B: 90% isopropanol/10% Acetonitril mit 0,1% Ameisensäure und 10 mM Ammoniumformiat für die wässrige Phase, konstante Strömungsrate 1,2 μ l / min durch ein Waters nanoACQUITY C18 BEH130 Spalte in einer Heizvorrichtung bei 35 ° C verwendet wurde. Solvent A: 95% Wasser / 5% Methanol mit 0,1% Ammoniumhydroxid, Lösungsmittel B: 95% Methanol / 5% Wasser mit 0,1% Ammoniumhydroxid.
Abbildung 2. Spiegel Grundstück mit XCMS generiert. Ein Spiegel Diagramm, unterschiedlich reichlich Funktionen wie nachgewiesen und quantifiziert durch XCMS online von der organischen Phase positive Modus UPLC-MS-Analyse. Jeder Punkt steht für ein deutliches "-Funktion." Grüne Punkte sind Merkmale häufiger (größere integrierte Fläche) in der Kontrollgruppe, während rote Punkte häufiger in Behandlung sind. Zunehmender Größe der Punkt zeigt zunehmender Größe der Falte Veränderung zwischen den Gruppen, und die Intensität der Farbe zeigt eine abnehmende p-Wert mit zunehmender Sättigung der Farbe.
Abbildung 3. Analyt Peaks. Chromatogramme zeigt die organische Phase positive Ionen-Modus UPLC-MS-Analyse. A) korrigiert (ausgerichtet) insgesamt Ionenstrom (TIC) von SIEVE 2.0. B) extrahiert Ionenchromatogramm für das Feature vorläufig als D-Pantethin durch XCMS identifiziert. C ) extrahiert Ionenchromatogramm für das Feature später als Rotenon aus SIEVE. identifiziert D) XIC für das Feature später als Rotenon aus SIEVE normiert auf TIC identifiziert. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Abbildung 4. . Database Search Results Database Treffern für A) Menschliche Metabolome Database ( http://www.hmdb.ca ) und B) ChemSpider / KEGG (via SIEVE) (ChemSpider auch allein eingesetzt werden können - http://www.chemspider.com ) mit genauen Massebestimmungen für die Funktionen in den 3B, 3C und 3D entsprechend den Ionen mit m / z 555,2516 395,1481 und auf die Identifizierung dieser Ionen als Basis gezeigt [MH] +-Spezies. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 5. HR / MS / MS Structural Bestätigung. Bestätigung der Identifizierung der Funktion entsprechend dem Ion bei 395.1481 m / z mit einer Retentionszeit von 23,22 min als Rotenon auf UPLC-MS/MS Vergleich zu einem kommerziellen Standard A) ähnliche Retentionszeit und B) der gleichen Basis m / z (395.1481, ~ 0 ppm Fehler) mit nahezu identischen Fragmentierung. Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
| Massenspektrometrie Parameter | Einstellen | Kommentar |
| Quelle | ESI | Michrom CaptiveSpray |
| Ion Modell | Positive oder Negative | |
| Method Länge | Variable (~ 40-60 min) | |
| Auflösung | 60.000-100.000 | |
| Spray (kV) | 1,75 | |
| Rohr Lens (V) | 130 | Zielverbindung Dependent |
| Kapillar-Temperatur (° C) | 250 | Kann Leben Sprühspitze verkürzen |
| Kapillar-Spannung (V) | 50 | Zielverbindung Dependent |
| Datentyp | Centroid | (Für Profil-Daten, siehe Diskussion) |
Tabelle 2. MS-Einstellungen. Allgemeine und optimierte Verbindung Massenspektrometer Einstellungen für die LTQ XL-Orbitrap mit einem Thermo Michrom Geleistete gefangen Spray ESI-Quelle verwendet.
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Discussion
Untargeted metabolomics bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von endogenen oder xenobiotischen Biotransformationen, oder die Erfassung eines metabolischen Profils aus einer Probe von Interesse. Der Ausgang der Technik skaliert mit der Auflösung und Empfindlichkeit der verwendeten Technologie zu trennen und analysieren die Probe, die Fähigkeit, mit der große Datenmengen erzeugt umzugehen, und die Fähigkeit, um die Datenmenge für nützliche Informationen (zB genaue Masse Datenbanksuche) abzubauen. Kürzlich wurde dies durch Fortschritte in hoher Auflösung Massenspektrometern erleichtert worden, und High-oder Ultra-Flüssigkeits-Chromatographie. Differential-Analyse-Software hat die Analyse Engpass angesprochen und kann Peakdetektion Einstellung zur Aufbewahrung Zeitverschiebungen, Filtern und statistische Analyse mit hohem Durchsatz. 20,21,22 Die Auswahl der richtigen Informatik Pipeline erreichen sollten Überlegungen, Daten centroiding Algorithmen Peak-Erkennung, Peak-Integration, alignment, die Fähigkeit, MS / MS-Daten zu integrieren, und die Fähigkeit, mit Isotopen oder Addukte umzugehen. 23 Auswahl geeigneter Cheminformatik Datenbanken sollten ebenfalls berücksichtigt werden. 24,25,26,27 Die aktuelle Unzulänglichkeit eines bestimmten Datenbank umfassend zu identifizieren und Verbindungen integrieren genaue Massendaten, MS / MS-Daten oder Daten LC vor ein großes Problem in diesem Bereich.
Die hier vorgestellten Workflow integriert Flüssig-Flüssig-Extraktion, Mikro-flow Flüssigkeits-Chromatographie und hochauflösender Massenspektrometrie mit zwei verschiedenen Differentialanalyse Software-Plattformen in einer Zellkultur Behandlung Modell demonstriert. Zusätzlich werden Extraktionsverfahren für Serum und Gewebe aufgeführt, da diese als nützliche Beispiele für ähnliche Analyse dienen.
Obwohl jedes Verfahren für ungezielte metabolomics verwendet für die Wiederholbarkeit, stabile UPLC Bedingungen und Quelle Stabilität optimiert werden sollte, ist eine gewisse Variation unvermeidlich. Sowohl SIEVE und XCMS allow Korrektur für Retentionszeitverschiebung, aber besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden sollte, um sicherzustellen, dass die Parameter im Experiment gesetzt angemessen Variation korrekt sind. Auch isotopenmarkierten internen Standard (s) leicht in diesem Verfahren integriert werden, um Artefakte und Zwischen-Abtastwert-Variante durch Unterschiede in Probenahmen oder LC-MS-Analyse zu reduzieren. 12 Wie bei allen sensiblen LC-MS-Verfahren, ist es entscheidend, hochreinen Reagenzien zu verwenden, und sicherzustellen, dass die Probenvorbereitung unerwünschte Partikel oder Aggregat entfernt. Artefakte können durch die normale Variation Verunreinigungen erzeugt werden, und es kann wünschenswert sein, zu bestätigen, dass putative Treffern tatsächlich nicht überall Verunreinigungen von der Gewinnung oder Analyseprozess.
Schließlich obwohl das Verfahren als "ungezielte" oder "unvoreingenommene" Metabolomics bezeichnet wird, ist dies eine teilweise irreführend. Die Art der Extraktion, Trennung und Analyse Metaboliten mit bestimmten Merk begünstigenTics wie Stabilität während der Extraktion, die Interaktion mit stationären und mobilen Phasen während der Trennung und Ionisierung an der Quelle des Massenspektrometers. 28,29,30 Je nach verfügbarem Instrumentierung, kann dieses Verfahren auf verschiedene Extraktionen, Strömungsgeschwindigkeiten, Drücke LC angepasst werden , Ionenquellen, oder Massenspektrometern. Deshalb haben wir Hinweise in dem Verfahren, wenn bestimmte Voraussetzungen auf der Grundlage allgemeiner Kenntnisse oder interne Standards Vertreter einer Klasse von Molekülen von Interesse optimiert werden können enthalten.
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Disclosures
Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken für die Unterstützung der NIH Zuschüsse P30ES013508 und 5T32GM008076. Wir danken auch Thermo Scientific für den Zugang zu SIEVE 2.0 und Drs. Eugene Ciccimaro und Mark Sanders von Thermo Scientific für hilfreiche Diskussionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
References
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