Summary
Non ciblée métabolomique fournit une hypothèse générer instantané d'un profil métabolique. Ce protocole démontrera l'extraction et l'analyse des métabolites provenant de cellules, le sérum ou les tissus. Une gamme de métabolites sont interrogés par extraction en phase liquide-liquide, microflow UltraPerformance chromatographie liquide / haute résolution spectrométrie de masse (UPLC-HRMS) couplé à un logiciel d'analyse différentielle.
Abstract
Nous présentons ici un flux de travail pour analyser les profils métaboliques des échantillons biologiques d'intérêt, y compris, les cellules, le sérum ou les tissus. L'échantillon est d'abord séparé en fractions polaires et non polaires par une extraction en phase liquide-liquide, et partiellement purifié pour faciliter l'analyse en aval. Les deux aqueuses (métabolites polaires) et organique phases (métabolites non polaires) de l'extraction initiale sont traitées pour étudier un large éventail de métabolites. Les métabolites sont séparées par différentes méthodes de chromatographie liquide en fonction de leurs propriétés de la partition. Dans cette méthode, nous présentons microflow ultra performant (UP) méthodes LC, mais le protocole est extensible à des débits plus élevés et des pressions plus basses. L'introduction dans le spectromètre de masse peut être soit par des conditions optimisées de source générales ou composé. La détection d'un large éventail d'ions est effectuée en mode balayage complet en mode à la fois positif et négatif sur une large gamme m / z en utilisant haute résolution sur un récemment calibrated instrument. Sans étiquette analyse différentielle est effectuée sur les plates-formes bioinformatique. Les applications de cette approche comprennent le dépistage métabolique de la voie, la découverte de biomarqueurs et le développement de médicaments.
Introduction
Grâce aux progrès technologiques récents dans le domaine de la gestion des ressources humaines, non ciblées, génératrice d'hypothèses métabolomique approches sont devenus une approche réalisable à l'analyse d'échantillons complexes. 1 spectromètres de masse capables de 100.000 résolution facilitant routine faible partie par million (ppm) Précision de masse sont devenus largement disponibles auprès de plusieurs fournisseurs. 2,3 Cette précision de masse permet une plus grande spécificité et la confiance dans une mission préliminaire de l'identité de l'analyte, reconnaissance de formes isotopiques, et l'identification des produits d'addition. 4 Lorsque couplé avec une méthode d'extraction appropriée et, mélanges complexes de haute performance LC ou UPLC peuvent être analysées avec une spécificité supplémentaire tirée des données de temps de rétention. 5 UPLC possède une plus grande efficacité chromatographique et permet une plus grande sensibilité, la résolution et l'analyse temps à faire une plus grande couverture du métabolome possible. 6 Les grands ensembles de données qui en résultent peuvent être intégrés dans n'importe quelde multiples logiciels d'analyse différentielle et exploitées pour les modèles d'utilité ou d'analytes individuels d'intérêt. 7,8,9,10,11 coups putatifs peuvent être initialement identifiés à l'aide d'une combinaison d'algorithmes de détection de pointe, précise basée sur la prévision de la formule chimique de masse, la prédiction de la fragmentation et recherche de base de données chimique. Cette approche permet la priorisation des objectifs de temps identification structurelle complète ou pour le développement de dilution des isotopes stables plus sensible et plus spécifique de surveillance UPLC / sélectionné ou multiple réaction / MS études qui sont les méthodes standards actuels de l'or pour la quantification. 12
La nature variable des échantillons biologiques a conduit à une optimisation des protocoles d'extraction d'urine 13, 14 cellules, le sérum 15 ou 16 tissu. Ce protocole caractéristiques extractions de cellules, le sérum et le tissu. Le cas échéant, des commentaires et des références supplémentaires ont été incluses pour moditions de la procédure pour l'inclusion des isotopes stables, ou l'inclusion des métabolites particulièrement instables.
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Protocol
1. Extraction de l'échantillon à partir de cellules
- Pour une plaque de cellules cm 10: recueillir 1,5 ml de suspension cellulaire dans un milieu levé dans un tube à centrifuger de verre pré-marqué 10 ml. Pour les lignes adhérentes, les cellules devraient être levées avec grattant délicatement dans 1,5 ml de milieu conservés dans la glace en option:. Si les normes internes sont utilisées, ajouter une aliquote appropriée à cette étape.
Commentaire: Trempe du métabolisme cellulaire est cruciale pour certains métabolites. Pour l'analyse des métabolites sensibles au facteur temps, des procédures telles que l'extraction de méthanol froid devraient être considérés. 17 - Ajouter 6 ml de chloroforme (CHCl 3) / méthanol (CH 3 OH) (2:1, v / v) pour chacun des tubes de verre de 10 ml contenant les échantillons. Définissez les échantillons dans un shaker ou multi-vortex à basse vitesse pendant 30 min. Après agitation, les échantillons sont centrifugés avec un réglage bas d'accélération / décélération à 1.935 g pendant 10 min à 4 ° C pour séparer complètement les phases.
Optionnel CHCl3, extractions peuvent être menées avec du dichlorométhane (CH 2 Cl 2) 18,12. - Utilisation d'une tige longue pipette Pasteur, transférer la couche organique (inférieure) à une nouvelle pré-marquée tube de centrifugeuse de 10 ml en verre. Continuer à 4,1.
- Transférer la phase aqueuse supérieure plus tard dans un plastique de 2 ml Eppendorf tube propre. Évaporer l'échantillon dans de l'azote gazeux. Continuer à 2.6.2 pour le dessalage de phase aqueuse ou de continuer à 4.1 pour l'analyse directe.
2. Extraction des échantillons de sérum
- Transférer 20 ul de sérum dans un tube en plastique de 2 ml Eppendorf option:. Si les normes internes sont utilisées, ajouter une aliquote appropriée à cette étape.
- Ajouter 190 ul de CH 3 OH et vortex pendant 10 sec.
- Ajouter 380 ul de CHCl 3 et vortex pendant 10 sec.
- Ajouter 120 ul de H 2 O pour induire une séparation de phase. Vortex les échantillons pendant 10 secondes et laisser s'équilibrer à température ambiante pendant 10min.
- Centrifuger les échantillons à 8000 g pendant 10 min à 4 ° C pour séparer les phases.
- Transférer la phase organique inférieure en plastique de 2 ml Eppendorf tube propre. Continuer à 4,1.
- Transférer la phase aqueuse supérieure plus tard dans un plastique de 2 ml Eppendorf tube propre. Évaporer l'échantillon dans de l'azote gazeux.
- Re-suspendre l'échantillon dans 200 pi H 2 O. Acide ou une base réactifs (0,1% d'acide acétique, d'acide formique ou de 0,1% d'hydroxyde d'ammonium), peuvent être utilisés pour extraire préférentiellement métabolites sensibles au pH. Ultrasons pendant 20 min sur la glace pour remettre en suspension l'échantillon complètement.
- Activez les colonnes de centrifugation C18 avec 500 pi CH 3 OH.
- Équilibrer la colonne de spin avec deux lavages de 500 pi H 2 O puis charger l'échantillon. Si réactifs acides / bases sont utilisées maintenir cette concentration au cours des étapes de lavage.
- Laver avec 500 pi H 2 O pour dessaler l'échantillon. Là encore, si réactifs acides / bases sont utilisées maintenir cette concentration dans le lavageétapes.
- Eluer avec deux volumes de 200 pi 80% CH 3 OH en H 2 O dans un tube Eppendorf pré-étiquetés propre 2 ml. Là encore, si réactifs acides / bases sont utilisées maintenir cette concentration au cours des étapes de lavage. Continuer à 4,1.
3. Extraction des échantillons de tissus
- Selon le tissu, utiliser entre 10-100 mg de tissus congelés. Ajouter le morceau entier de tissu à un ml bas tube de pré-étiquetés 2 de rétention Eppendorf avec 1 ml de PBS (1 M, pH 6,8) dans un bain de glace en option:. Si les normes internes sont utilisés, ajoutez-le dans la mémoire tampon, avant d'ajouter le tissu.
- Homogénéiser le tissu dans la glace avec un broyeur de tissus électrique pendant 30 secondes dans chaque Eppendorf. Entre échantillons, nettoyer le broyeur de tissus à deux tubes séparés contenant CH 3 OH et H 2 O, respectivement.
- Transfert de l'homogénat de tissu avec une pipette en plastique dans un tube de centrifugation de verre pré-marqué 10 ml. Après le transfert, rincer chaque tube Eppendorf2x avec 1 ml de CH 3 OH et ajouter les lavages à l'homogénat de tissu dans des tubes de verre.
- Ajouter 4 ml de CHCl3 à chacun des tubes de verre de 10 ml contenant le broyat de tissus et de CH 3 OH lavages. Définissez les échantillons dans un shaker ou multi-vortex à basse vitesse pendant 30 min.
- Après agitation, centrifuger les échantillons avec une faible valeur d'accélération / décélération à 1.935 g pendant 10 min à séparer complètement les phases En option:. Pour éviter d'utiliser le chloroforme, les extractions ont été mis au point avec CH 2 Cl 2.
- Utilisation d'une tige longue pipette Pasteur, transférer la couche organique (inférieure) à une nouvelle pré-marquée tube de centrifugeuse de 10 ml en verre. Continuer à 4,1.
- En utilisant une tige longue pipette Pasteur, transférer la couche aqueuse à une nouvelle pré-étiquetés tube de centrifugation en verre de 10 ml. Aller à 2.6.2 pour le dessalage ou continuer à 4,1.
4. Re-suspension et la filtration des échantillons pour UPLC
- Évaporer le samples sous azote gazeux.
- Reconstituer séché jusqu'à échantillons dans un volume approprié de la solution de départ pour la méthode UPLC désirée (voir tableau 1). 50-100 ul est habituellement un volume re-suspension souhaitable. Doucement vortex et / ou d'une pipette l'échantillon de haut en bas pour aider à dissoudre les analytes.
- Transférer l'échantillon dans une um filtre du tube de nylon 0,22 et tournent à jusqu'à 14.000 xg jusqu'à ce que l'échantillon ait complètement passé à travers le filtre (~ 5 min). Assurez-vous qu'il n'y a pas visible précipités restant dans l'échantillon.
- Transférer le surnageant de l'échantillon filtré dans un flacon UPLC pré-marquée avec insert. Flacon de capsule, puis feuilleter le flacon pour éliminer les bulles à partir du fond de la cuvette d'échantillon. Placer l'échantillon dans l'échantillonneur automatique réfrigéré (4-5 ° C).
5. UPLC Setup
- Utilisation du logiciel de contrôle du chromatographe en phase liquide, de créer une course pour l'échantillon biologique basé au large des conditions énumérées à l'
- Permettre à l'UPLC pour équilibrer adéquatement. Cela devrait inclure un amorçage complet de solvants avant de fixer une colonne, et en suivant les instructions du fabricant pour le volume d'équilibration d'une nouvelle colonne (habituellement 3-5 volumes de colonne). Tenir un registre de départ de retour pressions pour aider à diagnostiquer les problèmes futurs.
6. Configuration du spectromètre de masse
- Utilisation du logiciel de contrôle du spectromètre de masse à haute résolution, de créer une méthode en mode positif en utilisant les conditions énumérées dans le tableau 2. Ensuite, en utilisant les mêmes conditions, créer une méthode de mode négatif en option:. Si un ensemble connu des analytes cibles sont de haute intEREST, la source et optimiser les conditions de l'optique en utilisant l'analogue marqué lourd de ces composés, et de générer un procédé utilisant ces conditions.
- Nettoyer et étalonner l'instrument, d'établir un spray stable dans le spectromètre, et laisser le temps à la solution d'étalonnage pour dissiper correctement de la source et de l'optique. Bonne stabilité de pulvérisation doit donner une 3-5% RSD de l'intensité sur au moins 100 balayages par injection d'une solution d'étalonnage à la même vitesse d'écoulement que la méthode LC étant utilisé.
- Mettre en place la séquence pour tous les échantillons, régler le volume d'injection approprié, et d'exécuter un espace avant le premier échantillon. Si report ou la matrice des effets entre les échantillons sont soupçonnés, exécutez blancs / lave adéquates. Les échantillons doivent être configurés de manière aléatoire à l'aide d'un générateur de nombre aléatoire et une clé pour éviter les effets de lots introduits par l'analyse.
Commentaire: Les échantillons de contrôle de la qualité, y compris les normes d'isotopes stables ou normes d'analyse de cibles potentielles peuvent êtreextrêmement précieux pour le dépannage et d'assurer des résultats fiables, reproductibles et valides. Une technique répliquée d'un seul échantillon de référence, suivie par un blanc de solvant peut être utilisé pour les accès écart d'intensité du signal et le temps de rétention, ainsi que des reports dans la course vide. - Commencez séquence et surveiller périodiquement pour des problèmes tels que la variation de pression ou de perte d'intensité du signal à travers la course. Si de graves problèmes sont détectés, arrêter la course, et recommencez à partir de 6.2.
7. Differential Analysis
- Deux flux sont présentés pour ce protocole. La première est à travers un tamis 2.0, un logiciel d'analyse différentielle sans étiquette exclusive vendu par Thermo Fisher. Le deuxième flux est par XCMS en ligne, une plate-forme libre par Scripps Research Institute. 11 Avant de commencer l'analyse différentielle, vérifier manuellement les TIC ou regarder chromatogrammes filtrés pour tous les composés connus dans l'échantillon afin d'assurer la reproductibilité des essaiset l'injection / UPLC / spray stabilité dans tous les échantillons.
- TAMIS
- Transférez le fichier. Fichiers de données brutes du spectromètre de masse sur le disque dur du poste de travail où tamis est installé. (Note: en cours d'exécution tamis données stockées sur un disque dur connecté en réseau ou le port USB n'est pas conseillé car il peut limiter la vitesse d'analyse.)
- Ouvert crible, et commencer une nouvelle expérience.
- Chargez les fichiers appropriés dans tamis.
- Affectez des groupes de comparaison et de sélectionner un fichier unique de référence pour permettre tamis pour générer des paramètres à analyser.
- Suivez les instructions et régler tous les paramètres selon les exigences de toute expérience individuelle. Il est souvent conseillé de commencer avec des paramètres stricts, puis revenir en arrière et desserrer les paramètres comme paramètres plus généreuses peuvent allonger le temps d'analyse.
- Charger la liste de produit d'addition correcte pour le mode positif ou négatif dans les paramètres.
- XCMS ligne
- Convertir des fichiersdans un format acceptable pour XCMS en ligne. Dans notre cas, nous convertissons à mzXML le format 19.
- XCMS ouverts en ligne, et création d'emploi.
- Téléchargez et nommer des ensembles de données. Seuls deux ensembles de données (contrôle vs traitement) peuvent être téléchargées comme XCMS autonomes sont limitées à des comparaisons en tête-à-tête.
- Sélectionnez les paramètres souhaités dans la liste déroulante. Paramètres pré-remplis sont disponibles pour différentes configurations d'instrumentation, et ceux-ci peuvent encore être modifiés pour répondre aux besoins expérimentaux. Dans notre cas, nous utilisons les paramètres HPLC-Orbi2.
- Soumettre et confirmer travail.
- Analyse des données
- Pour passoire et XCMS une liste de cadres et de fonctionnalités, respectivement, sera rempli une fois l'analyse terminée. Assurez-vous que l'alignement LC superpose les pics de repère. Si l'une des séries LC non alignés spectacle à grand écart de sommets emblématiques, cela peut indiquer un problème avec l'échantillon.
Facultatif: Pour Sieve, si les normes internes sont utilisés, localisezle groupe de pic correspondant à normaliser et à la monture choisie. Pour XCMS On-line, la normalisation peut être effectuée dans un tableur après l'exportation. - Tracer les données par le coefficient de variation (CV) dans un échantillon de population comme (par exemple des échantillons de contrôle). Toutes les grandes valeurs de CV peut indiquer un problème avec un ou plusieurs échantillons. Trier la liste en fonction des caractéristiques souhaitées (par exemple p-value <0,05, facteur de variation> 1,5, faible écart type au sein d'un groupe, etc.)
- Examinez chaque pic pour l'alignement approprié de pointe dans tous les groupes, l'intégration de pointe, gaussien forme de pic, intensité du signal, isotopes et l'affectation des produits d'addition.
- Exporter des données comme vous le souhaitez pour une analyse ultérieure ou pour générer des listes de masse ciblées pour confirmation et n expériences de SEP.
- Pour passoire et XCMS une liste de cadres et de fonctionnalités, respectivement, sera rempli une fois l'analyse terminée. Assurez-vous que l'alignement LC superpose les pics de repère. Si l'une des séries LC non alignés spectacle à grand écart de sommets emblématiques, cela peut indiquer un problème avec l'échantillon.
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Representative Results
Les résultats présentés montrent les données sélectionnées à partir d'un traitement de 6 h de cellules de glioblastome SH-SY5Y avec le pesticide et complexe mitochondrial I inhibiteur de la roténone. Par souci de concision, seules les données du mode positifs de phase organique est présenté. Les échantillons ont été traités et analysés comme décrit ci-dessus (figure 1, tableau 1, tableau 2) et chargés sur deux plates-formes d'analyse différentielle pour le label sans quantification, tamis et XCMS ligne. Bien qu'un grand nombre de hits (Figure 2, Figure 3) sont identifiés par les deux programmes utilisés pour l'analyse différentielle de ces caractéristiques comprennent des artefacts susceptibles, pics mal intégrés, et d'autres caractéristiques de valeur analytique discutable. Cela peut être jugé par criblage des résultats pour l'intensité du signal approprié, une faible variation entre les échantillons d'un même groupe, les niveaux de fond, et de bonnes formes de pic chromatographique (Figure 3).
Pour démontrer la downstreh confirmation des hits initiales, nous isolons une caractéristique avec une masse correspondant à notre traitement roténone composé à moins de 3 ppm (figure 3, figure 4). Nous confirmons l'identité de cette substance avec la spectrométrie de masse UPLC-HR/tandem (MS / MS) de notre échantillon et le composé pur (Figure 5). Nous identifions également une fonction différentielle abondante réduite dans le groupe traité à la roténone, provisoirement identifiée comme D-pantethine par la recherche de base de données précise de la masse (Figure 3).
Figure 1. Plan expérimental général pour la préparation d'échantillons et analyse par Microspray UPLC-HRMS. Un aperçu général de préparation de l'échantillon, y compris l'introduction facultative de normes internes et de protéines ou lipides / analyse de la teneur en protéines. La séparation de phase, chromatographie en phase liquide, et l'analyse par différents ion modes dans le spectromètre de masse sont décrits.
Tableau 1. Conditions UPLC. Générales et conditions UPLC composés optimisés. Pour la phase organique 1, débit constant de 1,8 pi / min à travers une colonne C18 nanoACQUITY des eaux BEH130 conservé dans un appareil de chauffage à 35 ° C a été utilisé. Solvant A: 99,5% water/0.5% d'acétonitrile avec de l'acide formique 0,1% solvant B: 98% acétonitrile / 2% d'eau avec de l'acide formique 0,1% de phase organique 2, à débit constant de 3,4 ul / min à travers une colonne C8 Acentis express conservé dans un dispositif de chauffage à 35 ° C a été utilisée. Solvant A: 40% water/20% d'acétonitrile avec de l'acide formique 0,1% et 10 mM de formiate d'ammonium, le solvant B: 90% isopropanol/10% d'acétonitrile avec de l'acide formique 0,1% et 10 mM de formiate d'ammonium pour la phase aqueuse, le débit constant d' 1,2 μ l / min à travers une colonne C18 nanoACQUITY des eaux BEH130 conservé dans un appareil de chauffage à 35 ° C ont été utilisées. Solvant A: 95% d'eau / méthanol à 5% avec 0,1% d'hydroxyde d'ammonium, le solvant B: méthanol 95% / 5% d'eau avec 0,1% d'hydroxyde d'ammonium.
Figure 2. Mirror Terrain Généré avec XCMS. Une parcelle de miroir montrant des caractéristiques différemment abondantes que détectés et quantifiés par XCMS de la mode positif analyse UPLC-MS de phase organique en ligne. Chaque point représente une «caractéristique». Distinct Les points verts sont des éléments les plus abondants (plus grande zone intégrée) dans le contrôle, tandis que les points rouges sont plus abondants dans le traitement. L'augmentation de la taille du point indique augmenter l'ampleur des changements de pliage entre les groupes, et l'intensité de la couleur indique une p-valeur décroissante avec l'augmentation de la saturation de couleur.
Figure 3. Peaks analyte. des chromatogrammes montrant le mode positif analyse organique en phase d'ions UPLC-MS. A) corrigé (aligné) courant ionique total (TIC) du tamis de 2,0. B) Extrait chromatogramme ionique pour la fonction provisoirement identifié comme D-pantethine par XCMS. C ) Extrait chromatogramme ionique pour la fonction plus tard identifié comme la roténone de tamis. D) XIC pour la fonction plus tard identifié comme la roténone de TAMIS normalisée à TIC. Cliquez ici pour agrandir la figure .
pg "/>
Figure 4. . Résultats de la recherche de base de données Base de données résultats pour A) Base de données métabolome humain ( http://www.hmdb.ca ) et B) ChemSpider / KEGG (via Sieve) (ChemSpider seul peut également être utilisé - http://www.chemspider.com ) en utilisant les déterminations de masse précises pour les caractéristiques indiquées dans les figures 3B, 3C et 3D correspondant aux ions de m / z 555,2516 et 395,1481 basé sur l'identification de ces ions que [MH] + espèces. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 5. HR / MS / MS SConfirmation tructures. Confirmation de l'identification de la fonction correspondant à l'ion à 395.1481 m / z avec un temps de rétention de 23,22 min comme la roténone basée sur la comparaison UPLC-MS/MS à un niveau commercial avec A) temps de rétention similaire et B) de la même m / z (395.1481, ~ 0 Erreur ppm) à fragmentation presque identiques. Cliquez ici pour agrandir la figure .
| Spectrométrie de masse Paramètre | Définition | Commenter |
| Source | ESI | Michrom CaptiveSpray |
| Ion modèle | Positif ou négatif | |
| Méthode Longueur | Variable (~ 40-60 min) | |
| Résolution | 60,000-100,000 | |
| Spray (kV) | 1,75 | |
| Tube Lens (V) | 130 | composé cible dépendante |
| Température capillaire (° C) | 250 | Peut raccourcir la vie de la buse de pulvérisation |
| Tension capillaire (V) | 50 | composé cible dépendante |
| Type de données | Centroid | (Pour les données de profil, voir Discussion) |
Tableau 2. Paramètres MS. Général et optimalisé réglages de Spectromètre de masse de composés utilisés pour la LTQ XL-Orbitrap avec une avance Thermo captive source ESI de pulvérisation Michrom.
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Discussion
Non ciblée métabolomique offre un outil puissant pour étudier biotransformations endogènes ou xénobiotiques, ou de capturer un profil métabolique d'un échantillon d'intérêt. La sortie de la balance de la technique avec la résolution et la sensibilité de la technologie utilisée pour séparer et analyser l'échantillon, la capacité de faire face aux grands ensembles de données générées, et la possibilité d'exploiter l'ensemble des données des informations utiles (par exemple, la recherche précise de la base de données de masse). Récemment, cela a été facilitée par les progrès de spectromètres de masse à haute résolution, et la chromatographie liquide à haute ou ultra-performance. logiciel d'analyse différentielle a abordé le goulot d'étranglement de l'analyse, et peut accomplir réglage de détection de pic pour les quarts de rétention de temps, le filtrage et l'analyse statistique avec haut débit 20,21,22 Sélection du informatique pipeline appropriée. devrait inclure des considérations relatives à des données centroïde algorithmes, détection de crête, l'intégration de crête, alignment, la capacité à intégrer des données MS / MS, et sa capacité à faire face à des isotopes ou des adduits. 23 Sélection des bases de données appropriées chimio devrait également être envisagée. 24,25,26,27 L'insuffisance actuelle de toute base de données particulière pour identifier globalement composés et intégrer données de masse précises, MS / MS ou LC données reste un problème majeur dans le domaine.
Le flux de travail présenté ici intègre extraction liquide-liquide, chromatographie liquide micro-circulation et la spectrométrie de masse à haute résolution avec deux plates-formes logicielles d'analyse des différentiels différents démontré dans un modèle de traitement de culture cellulaire. En outre, les protocoles d'extraction sont répertoriées pour le sérum et les tissus, comme ceux-ci peuvent servir échantillons utiles pour l'analyse similaire.
Bien que toute méthode utilisée pour la métabolomique non ciblées doit être optimisé pour la répétabilité, conditions UPLC stables, et la stabilité de la source, une certaine variation est inévitable. Les deux passoire et XCMS allow correction de décalage dans le temps de rétention, mais une attention particulière devrait être accordée à assurer que les paramètres définis dans l'expérience sont suffisantes pour corriger la variation. Aussi, isotope stable marqué étalon interne (s) peut être facilement intégré dans cette procédure pour réduire les artefacts et les variations inter-échantillon causée par des différences dans l'échantillon extractions ou analyse LC-MS. 12 Comme avec tous sensibles méthode LC-MS, il est crucial d'utiliser des réactifs de haute pureté, et de s'assurer que la préparation de l'échantillon élimine les particules indésirables ou ensemble. Les artefacts peuvent être générés par la variation normale des contaminants, et il peut être souhaitable de s'assurer de coups putatifs ne sont pas en fait des contaminants omniprésents dans le processus d'extraction ou d'analyse.
Enfin, bien que la méthode est étiqueté comme métabolomique "non ciblée" ou "impartiale", c'est un abus de langage partielle. La nature de l'extraction, de séparation et d'analyse privilégiera les métabolites avec certaines caractics, y compris la stabilité lors de l'extraction, l'interaction avec l'arrêt et des phases mobiles lors de la séparation, et l'ionisation à la source du spectromètre de masse. 28,29,30 Selon l'instrumentation disponible, cette procédure peut être adapté à différentes extractions, les débits, les pressions LC , les sources d'ions ou des spectromètres de masse. Par conséquent, nous avons inclus des notes dans la procédure lorsque certaines conditions peuvent être optimisés en fonction de connaissances générales ou normes internes représentant d'une classe de molécules d'intérêt.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous reconnaissons l'appui de subventions des NIH P30ES013508 et 5T32GM008076. Nous remercions également Thermo Scientific pour l'accès au tamis de 2,0 et Drs. Eugene Ciccimaro et Mark Sanders de Thermo Scientific pour des discussions utiles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
References
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