Vilkårlige Metabolomics fra biologiske kilder Bruke UltraPerformance væskekromatografi-High Resolution massespektrometri (UPLC-HRMS)
Summary
Vilkårlige metabolomikk gir en hypotese generere øyeblikksbilde av en metabolsk profil. Denne protokollen vil demonstrere ekstraksjon og analyse av metabolitter fra celler, serum eller vev. En rekke metabolitter blir kartlagt ved hjelp av væske-væske-fase ekstraksjon, microflow UltraPerformance væskekromatografi / høy-oppløsnings masse-spektrometri (UPLC-HRMS) koblet til differensial-analyse-programvare.
Abstract
Her presenterer vi en arbeidsflyt for å analysere de metabolske profilene for biologiske prøver av interesse, inkludert; celler, serum eller vev. Prøven blir først separert i polare og ikke-polare fraksjoner ved en væske-væske-fase ekstraksjon, og delvis renset for å lette genetisk analyse. Begge vandige (polare metabolitter) og organiske (ikke-polare metabolitter) faser ved den første ekstraksjon blir behandlet for å undersøke et bredere spekter av metabolitter. Metabolitter er atskilt med forskjellige væskekromatografi fremgangsmåter basert på deres skillevegger egenskaper. I denne metoden, presenterer vi microflow ultra-ytelse (UP) LC metoder, men protokollen er skalerbar til høyere strømmer og lavere trykk. Innføring i massespektrometer kan være gjennom enten generelle eller sammensatte optimaliserte kilde forhold. Påvisning av et bredt utvalg av ioner blir utført i fullt scan mode i både positiv og negativ modus over en bred m / z rekkevidde med høy oppløsning på en nylig calibrated instrument. Label-free differensial analysen er utført på bioinformatikk plattformer. Søknader med denne tilnærmingen er metabolismen screening, biomarkører, og narkotika utvikling.
Introduction
På grunn av de siste teknologiske fremskritt innen HRMS, har vilkårlige, hypotese-genererende metabolomics tilnærminger bli en mulig tilnærming til analyse av komplekse prøver. En massespektrometre stand til 100.000 oppløsning tilrettelegge rutine lave delen per million (ppm) masse nøyaktighet har blitt allment tilgjengelig fra flere leverandører. 2,3 Denne massen nøyaktighet gir større spesifisitet og tillit i en foreløpig tildeling av analytt identitet, isotopiske mønstergjenkjenning, og adduct identifikasjon. 4 Når dette kombineres med en passende ekstraksjonsmetode og høy ytelse LC eller UPLC, komplekse blandinger kan analyseres med ekstra spesifisitet avledet fra oppholdstid data. 5 UPLC besitter større kromatografisk effektivitet og gir større følsomhet, oppløsning og analyse tid på å lage en større dekning av metabolome mulig. 6 De resulterende store datasett kan integreres i ethvertav multippel differensial analyse programvare og minelagt for nyttige mønstre eller individuelle analytter av interesse. 7,8,9,10,11 Antatte treff kan først identifisert ved hjelp av en kombinasjon av peak algoritmer, nøyaktig mass basert kjemiske formelen prediksjon, fragmentering prediksjon, og stoffkartoteket søk. Denne tilnærmingen gjør prioritering av målene for tidkrevende komplett strukturell identifikasjon eller for utvikling av mer sensitiv og mer spesifikk stabile isotoper fortynning UPLC / valgte eller flere reaksjon overvåking / MS studier som er dagens gullstandard metoder for kvantifisering. 12
Det varierende innholdet av biologiske prøver har ført til optimalisering av ekstraksjonsmetoder for urin 13, 14-celler, 15 serum, vev eller 16.. Denne protokollen har ekstraksjoner for celler, serum og vev. Der det er hensiktsmessig, har kommentarer og ytterligere referanser er inkludert for modificasjoner av prosedyren for å ta inkludering av stabile isotoper, eller for inkludering av spesielt ustabile metabolitter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vilkårlige metabolomikk tilbyr et kraftig verktøy for å undersøke endogene eller xenobiotic biotransformasjoner, eller fange en metabolsk profil fra et utvalg av interesse. Utgangen av teknikken skalaer med oppløsning og sensitivitet av teknologien som brukes for å separere og analysere prøven, evnen til å håndtere de store datasett som genereres, og evnen til å utvinne datasett for nyttig informasjon (f.eks nøyaktig masse databasesøk). Nylig har dette vært tilrettelagt av fremskritt i høy oppløs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkjenner støtte fra NIH tilskudd P30ES013508 og 5T32GM008076. Vi takker også Thermo Scientific for tilgang til SIEVE 2.0 og Drs. Eugene Ciccimaro og Mark Sanders av Thermo Scientific for nyttige diskusjoner.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
References
- Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation. Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).
- Makarov, A., Denisov, E., et al. Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer. Analytical Chemistry. 78 (7), 2113-2120 (2006).
- Timischl, B., Dettmer, K., Kaspar, H., Thieme, M., Oefner, P. J. Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics. Electrophoresis. 29 (10), 2203-2214 (2008).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. J. Chromatogr. A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data. BMC Bioinformatics. 6, 179 (2005).
- Wilson, I. D., Nicholson, J. K., et al. High resolution ultra performance liquid chromatography coupled to q-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. Journal of Proteome Research. 4 (2), 591-598 (2005).
- Benton, H. P., Wong, D. M., Trauger, S. A., Siuzdak, G. XCMS2: processing tandem mass spectrometry data for metabolite identification and structural characterization. Anal. Chem. 80 (16), 6382-6389 (2008).
- Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Smith, C. A., Want, E. J., O’Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
- Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data. Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).
- Gelhaus, S. L., Mesaros, A. C., Blair, I. A. Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (57), e3399 (2011).
- Want, E. J., Wilson, I. D., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLCGÇôMS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nature Protocols. 6 (8), 1241-1249 (2011).
- Dunn, W. B., Broadhurst, D., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
- Shaham, O., Slate, N. G., et al. A plasma signature of human mitochondrial disease revealed through metabolic profiling of spent media from cultured muscle cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (4), 1571-1575 (2010).
- Cequier-Saünchez, E., Rodriüguez, C., Ravelo, A. G., Zaürate, R. Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (12), 4297-4303 (2008).
- Keller, A., Eng, J., Zhang, N., Li, X. J., Aebersold, R. A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats. Mol. Syst. Biol. 1, (2005).
- Cleveland, W. S., Devlin, S. J. Locally weighted regression – an approach to regression-analysis by local fitting. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 596-610 (1988).
- Lange, E., Tautenhahn, R., Neumann, S., Gropl, C. Critical assessment of alignment procedures for LC-MS proteomics and metabolomics measurements. BMC Bioinformatics. 9 (1), 375 (2008).
- Tautenhahn, R., Bottcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9 (1), 504 (2008).
- Kuhl, C., Tautenhahn, R., Bottcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets. Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).
- Kanehisa, M., Goto, S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).
- Smith, C. A., O’Maille, G., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit. 27 (6), 747-751 (2005).
- Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules. Nucleic Acids Res. 37 Web Server, W623-W633 (2009).
- Wishart, D. S., Knox, C., et al. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic Acids Res. 37 Database, D603-D610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Folch, J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).
- Avery, M. J. Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).
