Summary
Oriktade metabolomicsen ger en hypotes genererar ögonblicksbild av en metabolisk profil. Detta protokoll kommer att demonstrera extraktion och analys av metaboliter från celler, serum eller vävnad. En rad metaboliter undersöks med användning av flytande-flytande fas extraktion, mikroflöde ultraperformance vätskekromatografi / högupplösande masspektrometri (UPLC-HRMS) kopplad till differentiell analysprogram.
Abstract
Här presenterar vi ett arbetsflöde för att analysera de metaboliska profiler för biologiska prover av intresse även, celler, serum eller vävnad. Provet först separeras i polära och icke-polära fraktioner genom en vätske-vätske-fas extraktion, och renades partiellt för att underlätta nedströms analys. Både vattenhaltiga (polära metaboliter) och organiska (icke-polära metaboliter) faser av den initiala extraktionen behandlas för att kartlägga ett brett spektrum av metaboliter. Metaboliter åtskilda av olika vätskekromatografi metoder baserade på deras partition egenskaper. I denna metod, presenterar vi microflow ultra-prestanda (UP) LC-metoder, men protokollet är skalbart till högre flöden och lägre tryck. Introduktion till masspektrometer kan vara antingen genom allmänna eller förening optimerade källa förhållanden. Upptäckt av ett brett spektrum av joner sker i fullständig avsökning i både positiva och negativa läget över en bred m / z sortiment med hög upplösning på en nyligen calibrated instrument. Label-free differentialanalys utförs på bioinformatik plattformar. Tillämpningar av denna metod inkluderar metabolismväg screening, mätning av biomarkörer, och läkemedelsutveckling.
Introduction
På grund av de senaste tekniska framstegen inom HRMS, har oriktade, hypotes-genererande metabolomics tillvägagångssätt blir en möjlig metod för analys av komplexa prover. 1 Masspektrometrar kan 100.000 upplösning underlättar rutinmässig låg del per miljon (ppm) massa noggrannhet har blivit allmänt tillgängliga från flera leverantörer. 2,3 Denna massa noggrannhet möjliggör större specificitet och förtroende för en preliminär tilldelning av analyt identitet, isotopisk mönsterigenkänning, och addukt identifiering. 4 När den kombineras med en lämplig extraktion samt högpresterande LC eller UPLC, komplexa blandningar kan analyseras med ytterligare specificitet härrör från uppgifter uppehållstid. 5 UPLC besitter större kromatografisk effektivitet och möjliggör större känslighet, upplösning och analys tid att göra en större täckning av metabolomen möjligt. 6 De resulterande stora datamängder kan integreras i allaav multipel differentialanalys programvara och bryts för användbara mönster eller enskilda analyter av intresse. 7,8,9,10,11 Förmodade träffar initialt kan identifieras med hjälp av en kombination av toppdetektering algoritmer, exakt massa baserad kemisk formel förutsägelse, fragmentering förutsägelse, och kemisk databassökning. Detta tillvägagångssätt möjliggör prioritering av mål för tidskrävande komplett strukturell identifiering eller för utveckling av känsligare och mer specifik stabil isotoputspädning UPLC / valda eller flera reaktion övervakning / MS studier som är de nuvarande guldmyntfoten metoder för kvantifiering. 12
Den varierande naturen av biologiska prover har lett till optimering av utvinning protokoll för urin 13, 14 celler, serum 15 eller vävnad 16. Detta protokoll funktioner extraktioner för celler, serum och vävnad. I förekommande fall, har synpunkter och ytterligare referenser inkluderats för modifieringningar av förfarandet för att hantera införandet av stabila isotoper, eller för införande av särskilt instabila metaboliter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Provtagning från celler
- För en 10 cm platta av celler: samla 1,5 ml lyfts cellsuspensionen i media i en pre-märkt 10 ml glas centrifugrör. För vidhäftande linjer, bör cellerna lyftas med försiktig skrapning i 1,5 ml medium som hålls på is Valfritt:. Om interna standarder används, tillsätt en lämplig alikvot vid detta steg.
Kommentar: Släckning av cellulär metabolism är avgörande för vissa metaboliter. För analys av tidskänsliga metaboliter, bör förfaranden såsom kyla metanolextraktion övervägas. 17 - Tillsätt 6 ml kloroform (CHCI3) / metanol (CH3OH) (02:01, v / v) till varje av de 10 rören ml glasflaska innehåller proven. Ställ proverna i en shaker eller flera vortexer på låg hastighet under 30 minuter. Efter skakning, proverna centrifugeras med en låg acceleration / retardation inställning vid 1935 xg under 10 minuter vid 4 ° C för att fullständigt separera faserna.
Valfritt CHCI3, kan extraktioner ske med diklormetan (CH 2 Cl 2) 18,12. - Med hjälp av en lång stjälk Pasteur pipett, överför den organiska (botten) lager till ett nytt pre-märkt 10 ml glas centrifugrör. Fortsätt till 4.1.
- Överför den övre vattenhaltiga senare in i en ren plast 2 ml Eppendorf-rör. Indunsta provet under kvävgas. Fortsätt till 2.6.2 för vattenfas avsaltning eller fortsätta till 4,1 för direkt analys.
2. Provtagning från Serum
- Överför 20 pl serum i en plast 2 ml Eppendorf-rör Tillval:. Om interna standarder används, tillsätt en lämplig alikvot vid detta steg.
- Lägg 190 il CH 3 OH och skaka i 10 sekunder.
- Lägg 380 il CHCI3 och skaka i 10 sekunder.
- Lägg 120 pl av H2O för att inducera fasseparation. Vortex proverna för 10 sek och låt ekvilibrera vid rumstemperatur under 10min.
- Centrifugera proverna vid 8000 xg under 10 minuter vid 4 ° C för att separera faserna.
- Överför den undre organiska fasen i en ren plast 2 ml Eppendorf-rör. Fortsätt till 4.1.
- Överför den övre vattenhaltiga senare in i en ren plast 2 ml Eppendorf-rör. Indunsta provet under kvävgas.
- Återsuspendera provet i 200 ^ H 2 O. Syra eller bas reagens (0,1% Ättiksyra, myrsyra eller 0,1% ammoniumhydroxid) kan användas för att företrädesvis extrahera pH-känsliga metaboliter. Sonikera under 20 min på is för att återsuspendera provet helt.
- Aktivera de C18 spinnkolonner med 500 | il CH3OH.
- Jämvikta Spinnkolonnen med två tvättar med 500 pl H2O och sedan ladda provet. Om syra / bas reagenser används upprätthålla denna koncentration i tvätten steg.
- Tvätta med 500 | il H2O för att avsalta provet. Återigen, om syra / bas reagenser används bibehålla denna koncentration i tvättensteg.
- Eluera med två volymer av 200 | il 80% CH3OH i H2O till en i förväg märkt ren 2 ml Eppendorf-rör. Återigen, om syra / bas reagenser används upprätthålla denna koncentration i tvättstegen. Fortsätt till 4.1.
Tre. Provtagning från Tissue
- Beroende på vävnaden, använd mellan 10-100 mg av fryst vävnad. Lägg hela bit vävnad till en i förväg märkt 2 ml låg kvarhållning Eppendorf-rör med 1 ml PBS (1 M, pH 6,8) i ett isbad Valfritt:. Om interna standarder används, lägga till den i bufferten, före tillsats vävnaden.
- Homogenisera vävnaden i isen med en elektrisk vävnad kvarn för 30 sek i varje Eppendorf. Mellan prover, rengör vävnadskvarn i två separata rör innehållande CH3OH och H2O, respektive.
- Överför vävnadshomogenatet med en plastpipett till en pre-märkt 10 ml glas centrifugrör. Efter överföringen, skölj varje Eppendorf-rör2x med 1 ml CH3OH och tillsätt tvättningarna till vävnaden homogenatet i glasrör.
- Tillsätt 4 ml av CHCI3 till vardera av de 10 rören ml glasflaska innehållande vävnadshomogenatet och CH3OH tvättar. Ställ proverna i en shaker eller flera vortexer på låg hastighet under 30 minuter.
- Efter skakning, centrifugera proverna med en låg acceleration / retardation inställning vid 1935 xg under 10 minuter för att helt separera faserna Valfritt:. För att undvika att använda kloroform, har extraktioner utvecklats med CH 2 Cl 2.
- Med hjälp av en lång stjälk Pasteur pipett, överför den organiska (botten) lager till ett nytt pre-märkt 10 ml glas centrifugrör. Fortsätt till 4.1.
- Med hjälp av en lång stjälk Pasteur pipett vattenskiktet till ett nytt pre-märkt 10 ml glas centrifugrör. Gå till 2.6.2 för avsaltning eller fortsätta till 4.1.
4. Resuspension och filtrering av prover för UPLC
- Avdunsta SAMPles under kvävgas.
- Rekonstituera torkades ner prover i en lämplig volym av utgångslösningen för önskad UPLC metoden (se tabell 1). 50-100 il är vanligtvis en önskvärd resuspension volym. Vortexa försiktigt och / eller pipettera provet upp och ned för att underlätta upplösning av analyterna.
- Överför provet till en 0,22 um nylonrör filter och snurra på upp till 14.000 xg tills provet har helt passerat genom filtret (~ 5 min). Kontrollera att det inte finns några synliga partiklar kvar i provet.
- Överför supernatanten av det filtrerade provet i en i förväg märkt UPLC injektionsflaska med insats. Cap flaskan, och skaka flaskan för att avlägsna eventuella bubblor från botten av provet flaskan. Placera provet i kyld autosampler (4-5 ° C).
Fem. UPLC Setup
- Använda mjukvara för styrning vätskekromatografen, skapa en körning för den organiska prov baserade av de villkor som anges i
- Låt UPLC att på lämpligt sätt uppnå jämvikt. Detta bör omfatta en fullständig priming av lösningsmedel innan du fäster en kolumn, och följa tillverkarens anvisningar för jämvikt volym av en ny kolumn (vanligtvis 3-5 kolonnvolymer). Upprätthålla en logg att starta mottryck för att diagnostisera problem i framtiden.
6. Masspektrometer Setup
- Använda programvara för högupplöst masspektrometer, skapa ett positivt tillstånd metod med de villkor som anges i tabell 2. Sedan använda samma villkor, skapa ett negativt läge metod Tillval:. Om en känd uppsättning målanalyter är av hög interest, optimera källan och optik betingelser med användning av den tunga märkt analog av dessa föreningar, och generera en metod med användning av dessa betingelser.
- Rengör och kalibrera instrumentet, upprätta en stabil sprej i spektrometern, och ge tid för kalibreringen lösningen på ett tillfredsställande sätt försvinna från källan och optik. Godtagbar stabilitet hos sprej bör ge en 3-5% RSD av intensitet över åtminstone 100 skanningar med injektion av kalibreringslösningen vid samma flödeshastighet som den LC metoden som används.
- Ställ in sekvensen för samtliga prover, ställa lämplig injektion volym, och köra en tom innan det första provet. Om övervältringseffekter eller matrix effekter mellan proverna misstänks, köra lämpliga ämnen / tvättar. Prover bör ställas i en randomiserad sätt med hjälp av en slumpgenerator och en nyckel för att undvika eventuella batch effekter införs genom analys.
Kommentar: Kvalitetskontroll prover inklusive stabila isotopen standarder eller analysmetoderna för sannolika mål kan varaoerhört värdefullt vid felsökning och säkerställa tillförlitliga, reproducerbara och giltiga resultat. En teknisk replikat av en standard enbart prov följt av en blankprovlösningen kan användas för att åtkomst avvikelse av signalintensitet och uppehållstid, samt överföring till blindprov. - Börja sekvens och övervakar regelbundet för problem däribland tryckvariationer, eller förlust av signalstyrka i hela loppet. Om allvarliga problem upptäcks, stoppa körningen, och upprepar från 6.2.
7. Differential Analysis
- Två arbetsflöden presenteras för detta protokoll. Det första är genom sikt 2.0, proprietary etikett-fri differentiell analys programvara som säljs av Thermo Fisher. Den andra arbetsflödet är genom XCMS Online, en fri plattform genom Scripps Research Institute. 11 Innan differentialanalys, manuellt kontrollera tics eller titta på filtrerade kromatogram för någon känd förening i provet för att säkerställa reproducerbarhet av körningaroch insprutning / UPLC / sprej stabilitet under alla proven.
- SIKT
- Överför. Rådatafiler från masspektrometer till hårddisken på den arbetsstation där sikten installerad. (OBS: kör sikt med data som lagras på en ansluten nätverksenhet eller USB-port enheten är inte tillrådligt eftersom det kan begränsa hastigheten på analysen.)
- Open SIEVE, och börja ett nytt experiment.
- Ladda lämpliga filer i såll.
- Tilldela jämförelsegrupper och välja en enda referens fil för att möjliggöra sikt för att generera parametrarna för analys.
- Följ anvisningarna och justera alla parametrar per kraven i varje enskilt experiment. Det är ofta lämpligt att börja med stränga parametrar och sedan gå tillbaka och lossa de parametrar som mer generösa inställningar kan förlänga analys tid.
- Lägg i rätt addukt lista för positiva eller negativa läget i parametrarna.
- XCMS Online
- Konvertera filertill en acceptabel format för XCMS Online. I vårt fall, omvandlar vi mzXML format. 19
- Öppna XCMS Online, och skapa jobb.
- Ladda upp och namnge datamängder. Endast två datamängder (t.ex. kontroll vs Behandling) kan laddas upp som XCMS fristående begränsas till head-to-head jämförelser.
- Välj önskade inställningar från rullgardinsmenyn. Förifylld parametrar är tillgängliga för olika instrument uppställningar, och dessa kan modifieras ytterligare för experimentella behov. I vårt fall använder vi den HPLC-Orbi2 inställningar.
- Skicka in och bekräfta jobb.
- Data Analysis
- För SIEVE och XCMS en lista med ramar och funktioner, respektive, kommer att befolkas när analysen är klar. Se till att LC anpassningen överlagrar eventuella landmärke toppar. Om någon av den icke-justerade LC körningar visar stora avvikelser i landmärke toppar detta kan tyda på ett problem med provet.
Valfritt: För sil om interna standarder används, lokaliseramotsvarande topp gruppen och normalisera den valda ramen. För XCMS on-line, kan normalisering ske i ett kalkylblad efter export. - Plotta data från variationskoefficienten (CV) inom ett liknande prov population (t.ex. kontrollprov). Alla stora CV-värden kan indikera ett problem med ett eller flera prov. Sortera listan utifrån önskade egenskaper (t.ex. p-värde <0,05, faldig förändring> 1,5, låg standardavvikelse inom en koncern, etc).
- Undersök varje topp för lämplig topp anpassning mellan grupper, toppintegrering, Gauss toppform, signalstyrka, isotoper och addukt uppdrag.
- Exportera data som önskas för vidare analys eller för att generera riktade massa listor för bekräftelse och MS n experiment.
- För SIEVE och XCMS en lista med ramar och funktioner, respektive, kommer att befolkas när analysen är klar. Se till att LC anpassningen överlagrar eventuella landmärke toppar. Om någon av den icke-justerade LC körningar visar stora avvikelser i landmärke toppar detta kan tyda på ett problem med provet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De presenterade resultaten visar utvalda data från en 6-timmars behandling av SH-SY5Y glioblastomceller med bekämpningsmedel och mitokondriella komplexet jag inhibitor rotenon. För korthets skull är endast den organiska fasen positiva moddata presenteras. Proverna bearbetades och analyserades enligt beskrivningen ovan (figur 1, tabell 1, tabell 2) och laddades på två plattformar differentialanalys för etikett-fri kvantifiering, sikt och XCMS nätet. Även ett stort antal träffar (Figur 2, Figur 3) identifieras genom de två program som används för differentialanalys dessa funktioner inkluderar sannolika artefakter, dåligt integrerade toppar och andra funktioner av tvivelaktig analytiskt värde. Detta kan bedömas genom screening av träffar för lämplig signal intensitet, låg variation mellan prover från samma grupp, bakgrundshalter och goda kromatografiska former topp (figur 3).
För att demonstrera downstream bekräftelse av första hits, isolerar vi en funktion med en massa motsvarande vår behandling förening rotenon inom 3 ppm (Figur 3, Figur 4). Vi bekräftar identiteten av denna analyt med UPLC-HR/tandem masspektrometri (MS / MS) i vårt urval och den rena föreningen (Figur 5). Vi identifierar också en differentiellt riklig funktion reduceras i den behandlade gruppen rotenon, preliminärt identifierad som D-pantetin genom Exakt massa databassökning (Figur 3).
Figur 1. Allmänt Experimental Outline för provberedning och analys av Microspray UPLC-HRMS. En allmän beskrivning av provberedning, inklusive frivilliga införandet av interna standarder och protein eller fett / protein innehållsanalys. Fasseparation, vätskekromatografi, och analys med olika ion lägen i masspektrometer beskrivs.
Tabell 1. UPLC villkor. Allmänt och sammansatta optimerade UPLC villkor. För organiska fasen 1, konstant flödeshastighet av 1,8 | il / min genom en Waters nanoACQUITY C18 BEH130 kolonn förvaras i en varmare vid 35 ° C användes. Lösningsmedel A: 99,5% water/0.5% acetonitril med 0,1% myrsyra, Lösningsmedel B: 98% acetonitril / 2% vatten med 0,1% myrsyra För organiska fasen 2, konstant flödeshastighet av 3,4 | il / min genom en Acentis Express C8-kolonn förvaras i en varmare vid 35 ° C användes. Lösningsmedel A: 40% water/20% acetonitril med 0,1% myrsyra och 10 mM ammoniumformiat, Lösningsmedel B: 90% isopropanol/10% acetonitril med 0,1% myrsyra och 10 mM ammoniumformiat För den vattenhaltiga fasen, konstant flödeshastighet av 1,2 μ l / min genom en Waters nanoACQUITY C18 BEH130 kolonn förvaras i en varmare vid 35 ° C användes. Lösningsmedel A: 95% vatten / 5% metanol med 0,1% ammoniumhydroxid, Lösningsmedel B: 95% metanol / 5% vatten med 0,1% ammoniumhydroxid.
Figur 2. Spegel Plot Genererad med XCMS. En spegel diagram som visar differentiellt riklig funktioner som detekteras och kvantifieras genom XCMS nätet från den organiska fasen positiva sättet UPLC-MS-analys. Varje punkt representerar en distinkt "-funktionen." Gröna prickar är funktioner rikligare (större integrerat område) i kontrollgruppen, medan röda prickar är mer rikligt i behandlingen. Öka storleken på pricken indikerar ökande omfattningen av faldig förändring mellan grupperna, och intensiteten i färgen indikerar en minskande p-värde med ökande färgmättnad.
Figur 3. Analyt Peaks. Kromatogram som visar den organiska fasen positiva jonmod UPLC-MS-analys. A) rättad (linje) Total ion ström (TIC) från SIEVE 2.0. B) som utvinns jonkromatogram för funktionen preliminärt identifierats som D-pantethine genom XCMS. C ) Extraherat jonkromatogram för funktionen senare identifierades som rotenone från såll. D) XIC för funktionen senare identifierades som rotenone från SIEVE normaliserad till TIC. Klicka här för att visa en större bild .
pg "/>
Figur 4. . Databas Sökresultat Databas träffar för A) Människa Metabolome Database ( http://www.hmdb.ca ) och B) ChemSpider / KEGG (via SIEVE) (ChemSpider ensam kan också användas - http://www.chemspider.com ) med Exakt massa bestämningar för de funktioner som visas i figurerna 3B, 3C och 3D motsvarande joner med m / z 555,2516 och 395,1481 baserat på identifieringen av dessa joner som [MH] + arter. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 5. HR / MS / MS Structural Bekräftelse. Bekräftelse av identifiering av den funktion som motsvarar den jon vid 395.1481 m / z med en retentionstid av 23,22 min som rotenon baserad på UPLC-MS/MS jämförelse med en kommersiell standard med A) liknande retentionstid och B) samma m / z (395.1481, ~ 0 ppm fel) med nästan identiska fragmentering. Klicka här för att visa en större bild .
| Masspektrometri Parameter | Inställning | Kommentera |
| Källa | ESI | Michrom CaptiveSpray |
| Ion Modell | Positiv eller negativ | |
| Metod Längd | Variabel (~ 40-60 min) | |
| Upplösning | 60,000-100,000 | |
| Spray (kV) | 1,75 | |
| Tube Lens (V) | 130 | Målföreningen Dependent |
| Kapillär Temperatur (° C) | 250 | Kan förkorta livslängden för munstycke |
| Kapillär Spänning (V) | 50 | Målföreningen Dependent |
| Datatyp | Centroid | (För Profil uppgifter, se diskussion) |
Tabell 2. MS inställningar. Allmänt och sammansatta optimerade massa inställningar spektrometer används för LTQ XL-Orbitrap med en Michrom Thermo Advance fångenskap sprej ESI källa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oriktade metabolomicsen erbjuder ett kraftfullt verktyg för att undersöka endogena eller xenobiotiska biotransformationer, eller fånga en metabolisk profil från ett prov av intresse. Utgången av tekniken skalor med upplösning och känslighet för den teknik som används för att separera och analysera provet, förmågan att hantera de genererade stora datamängder, och förmågan att bryta dataset för användbar information (t.ex. korrekta massan databassökning). Nyligen har detta underlättas av framsteg inom höga spektrometrar upplösning massa, och hög-eller ultra-performance vätskekromatografi. Differential analysprogram har behandlat analys flaskhals, och kan åstadkomma toppdetektering justering för skift retentionstid filtrering, och statistisk analys med hög genomströmning. 20,21,22 Val av rätt informatik rörledningen bör omfatta överväganden om uppgifter centroiding algoritmer, toppdetektering, toppintegrering, alignment, förmåga att integrera MS / MS-data, och förmåga att hantera isotoper eller addukter. 23 Val av lämpliga cheminformatics databaser bör också övervägas. att heltäckande identifiera föreningar och integrera 24,25,26,27 Den nuvarande otillräckliga någon särskild databas Exakt massa data, MS / MS-data, eller LC data förblir ett stort problem i området.
Arbetsflödet presenteras här integrerar vätske-vätske-extraktion, mikro-flöde vätskekromatografi, och högupplösande masspektrometri med två olika programvaror differentialanalys plattformar visats i en cellkultur behandlingsmodell. Dessutom är utvinning protokoll anges för serum och vävnader, eftersom de kan fungera som användbara prover för liknande analys.
Fastän vilken som helst metod som används för oriktade metabolomics bör optimeras för repeterbarhet, stabila UPLC förhållanden, och källa stabilitet, är en viss variation oundvikligt. Både sikt och XCMS allow korrigering för retention tidsförskjutning, men särskild uppmärksamhet bör ägnas åt att säkerställa att de parametrar som i experimentet är tillräckliga för att korrigera variation. Dessutom, kan stabil isotop märkt intern standard (s) enkelt integreras i denna procedur för att reducera artefakter och inter-prov variation orsakas av skillnader i urvalet extraktioner eller LC-MS-analys. 12 Som med all känslig LC-MS-metoden, är det viktigt att använda reagenser av hög renhetsgrad, och se till att den provberedning avlägsnar oönskade partiklar eller aggregat. Artefakter kan genereras av den normala variationen i föroreningar, och det kan vara önskvärt att bekräfta att förmodade hits är inte i själva verket överallt föroreningar från utvinning eller analysprocessen.
Slutligen, trots att metoden är märkt som "oriktade" eller "objektiva" metabolomicsen, detta är en partiell missvisande. Den typ av extraktion, separation och analys kommer att gynna metaboliter med vissa karakteristiskatics inklusive stabilitet under extraktion, interaktion med stationära och mobila faser under separationen, och jonisering vid källan av masspektrometer. 28,29,30 Beroende på tillgängliga instrument, kan detta förfarande anpassas till olika extraktioner, flödeshastigheter, LC tryck , jonkällor eller masspektrometrar. Därför har vi inkluderat anteckningar i förfarandet där vissa villkor kan optimeras utifrån allmänna kunskaper eller interna standarder representerar en klass av molekyler av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi erkänner stöd av NIH bidrag P30ES013508 och 5T32GM008076. Vi tackar även Thermo Scientific för tillträde till SIEVE 2.0 och Dr. Eugene Ciccimaro och Mark Sanders av Thermo Scientific för nyttiga diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
References
- Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation. Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).
- Makarov, A., Denisov, E., et al. Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer. Analytical Chemistry. 78 (7), 2113-2120 (2006).
- Timischl, B., Dettmer, K., Kaspar, H., Thieme, M., Oefner, P. J. Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics. Electrophoresis. 29 (10), 2203-2214 (2008).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. J. Chromatogr. A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data. BMC Bioinformatics. 6, 179 (2005).
- Wilson, I. D., Nicholson, J. K., et al. High resolution ultra performance liquid chromatography coupled to q-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. Journal of Proteome Research. 4 (2), 591-598 (2005).
- Benton, H. P., Wong, D. M., Trauger, S. A., Siuzdak, G. XCMS2: processing tandem mass spectrometry data for metabolite identification and structural characterization. Anal. Chem. 80 (16), 6382-6389 (2008).
- Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
- Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data. Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).
- Gelhaus, S. L., Mesaros, A. C., Blair, I. A. Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (57), e3399 (2011).
- Want, E. J., Wilson, I. D., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLCGÇôMS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nature Protocols. 6 (8), 1241-1249 (2011).
- Dunn, W. B., Broadhurst, D., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
- Shaham, O., Slate, N. G., et al. A plasma signature of human mitochondrial disease revealed through metabolic profiling of spent media from cultured muscle cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (4), 1571-1575 (2010).
- Cequier-Saünchez, E., Rodriüguez, C., Ravelo, A. G., Zaürate, R. Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (12), 4297-4303 (2008).
- Keller, A., Eng, J., Zhang, N., Li, X. J., Aebersold, R. A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats. Mol. Syst. Biol. 1, (2005).
- Cleveland, W. S., Devlin, S. J. Locally weighted regression - an approach to regression-analysis by local fitting. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 596-610 (1988).
- Lange, E., Tautenhahn, R., Neumann, S., Gropl, C. Critical assessment of alignment procedures for LC-MS proteomics and metabolomics measurements. BMC Bioinformatics. 9 (1), 375 (2008).
- Tautenhahn, R., Bottcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9 (1), 504 (2008).
- Kuhl, C., Tautenhahn, R., Bottcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets. Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).
- Kanehisa, M., Goto, S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).
- Smith, C. A., O'Maille, G., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit. 27 (6), 747-751 (2005).
- Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules. Nucleic Acids Res. 37 Web Server, W623-W633 (2009).
- Wishart, D. S., Knox, C., et al. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic Acids Res. 37 Database, D603-D610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Folch, J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).
- Avery, M. J. Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).
