Oriktade Metabolomics från biologiska källor Använda Ultraperformance vätskekromatografi-högupplösande masspektrometri (UPLC-HRMS)
Summary
Oriktade metabolomicsen ger en hypotes genererar ögonblicksbild av en metabolisk profil. Detta protokoll kommer att demonstrera extraktion och analys av metaboliter från celler, serum eller vävnad. En rad metaboliter undersöks med användning av flytande-flytande fas extraktion, mikroflöde ultraperformance vätskekromatografi / högupplösande masspektrometri (UPLC-HRMS) kopplad till differentiell analysprogram.
Abstract
Här presenterar vi ett arbetsflöde för att analysera de metaboliska profiler för biologiska prover av intresse även, celler, serum eller vävnad. Provet först separeras i polära och icke-polära fraktioner genom en vätske-vätske-fas extraktion, och renades partiellt för att underlätta nedströms analys. Både vattenhaltiga (polära metaboliter) och organiska (icke-polära metaboliter) faser av den initiala extraktionen behandlas för att kartlägga ett brett spektrum av metaboliter. Metaboliter åtskilda av olika vätskekromatografi metoder baserade på deras partition egenskaper. I denna metod, presenterar vi microflow ultra-prestanda (UP) LC-metoder, men protokollet är skalbart till högre flöden och lägre tryck. Introduktion till masspektrometer kan vara antingen genom allmänna eller förening optimerade källa förhållanden. Upptäckt av ett brett spektrum av joner sker i fullständig avsökning i både positiva och negativa läget över en bred m / z sortiment med hög upplösning på en nyligen calibrated instrument. Label-free differentialanalys utförs på bioinformatik plattformar. Tillämpningar av denna metod inkluderar metabolismväg screening, mätning av biomarkörer, och läkemedelsutveckling.
Introduction
På grund av de senaste tekniska framstegen inom HRMS, har oriktade, hypotes-genererande metabolomics tillvägagångssätt blir en möjlig metod för analys av komplexa prover. 1 Masspektrometrar kan 100.000 upplösning underlättar rutinmässig låg del per miljon (ppm) massa noggrannhet har blivit allmänt tillgängliga från flera leverantörer. 2,3 Denna massa noggrannhet möjliggör större specificitet och förtroende för en preliminär tilldelning av analyt identitet, isotopisk mönsterigenkänning, och addukt identifiering. 4 När den kombineras med en lämplig extraktion samt högpresterande LC eller UPLC, komplexa blandningar kan analyseras med ytterligare specificitet härrör från uppgifter uppehållstid. 5 UPLC besitter större kromatografisk effektivitet och möjliggör större känslighet, upplösning och analys tid att göra en större täckning av metabolomen möjligt. 6 De resulterande stora datamängder kan integreras i allaav multipel differentialanalys programvara och bryts för användbara mönster eller enskilda analyter av intresse. 7,8,9,10,11 Förmodade träffar initialt kan identifieras med hjälp av en kombination av toppdetektering algoritmer, exakt massa baserad kemisk formel förutsägelse, fragmentering förutsägelse, och kemisk databassökning. Detta tillvägagångssätt möjliggör prioritering av mål för tidskrävande komplett strukturell identifiering eller för utveckling av känsligare och mer specifik stabil isotoputspädning UPLC / valda eller flera reaktion övervakning / MS studier som är de nuvarande guldmyntfoten metoder för kvantifiering. 12
Den varierande naturen av biologiska prover har lett till optimering av utvinning protokoll för urin 13, 14 celler, serum 15 eller vävnad 16. Detta protokoll funktioner extraktioner för celler, serum och vävnad. I förekommande fall, har synpunkter och ytterligare referenser inkluderats för modifieringningar av förfarandet för att hantera införandet av stabila isotoper, eller för införande av särskilt instabila metaboliter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oriktade metabolomicsen erbjuder ett kraftfullt verktyg för att undersöka endogena eller xenobiotiska biotransformationer, eller fånga en metabolisk profil från ett prov av intresse. Utgången av tekniken skalor med upplösning och känslighet för den teknik som används för att separera och analysera provet, förmågan att hantera de genererade stora datamängder, och förmågan att bryta dataset för användbar information (t.ex. korrekta massan databassökning). Nyligen har detta underlättas av framst…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner stöd av NIH bidrag P30ES013508 och 5T32GM008076. Vi tackar även Thermo Scientific för tillträde till SIEVE 2.0 och Dr. Eugene Ciccimaro och Mark Sanders av Thermo Scientific för nyttiga diskussioner.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
References
- Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation. Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).
- Makarov, A., Denisov, E., et al. Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer. Analytical Chemistry. 78 (7), 2113-2120 (2006).
- Timischl, B., Dettmer, K., Kaspar, H., Thieme, M., Oefner, P. J. Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics. Electrophoresis. 29 (10), 2203-2214 (2008).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. J. Chromatogr. A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).
- Katajamaa, M., Oresic, M. Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data. BMC Bioinformatics. 6, 179 (2005).
- Wilson, I. D., Nicholson, J. K., et al. High resolution ultra performance liquid chromatography coupled to q-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. Journal of Proteome Research. 4 (2), 591-598 (2005).
- Benton, H. P., Wong, D. M., Trauger, S. A., Siuzdak, G. XCMS2: processing tandem mass spectrometry data for metabolite identification and structural characterization. Anal. Chem. 80 (16), 6382-6389 (2008).
- Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Smith, C. A., Want, E. J., O’Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
- Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data. Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).
- Gelhaus, S. L., Mesaros, A. C., Blair, I. A. Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (57), e3399 (2011).
- Want, E. J., Wilson, I. D., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLCGÇôMS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nature Protocols. 6 (8), 1241-1249 (2011).
- Dunn, W. B., Broadhurst, D., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
- Shaham, O., Slate, N. G., et al. A plasma signature of human mitochondrial disease revealed through metabolic profiling of spent media from cultured muscle cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (4), 1571-1575 (2010).
- Cequier-Saünchez, E., Rodriüguez, C., Ravelo, A. G., Zaürate, R. Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (12), 4297-4303 (2008).
- Keller, A., Eng, J., Zhang, N., Li, X. J., Aebersold, R. A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats. Mol. Syst. Biol. 1, (2005).
- Cleveland, W. S., Devlin, S. J. Locally weighted regression – an approach to regression-analysis by local fitting. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 596-610 (1988).
- Lange, E., Tautenhahn, R., Neumann, S., Gropl, C. Critical assessment of alignment procedures for LC-MS proteomics and metabolomics measurements. BMC Bioinformatics. 9 (1), 375 (2008).
- Tautenhahn, R., Bottcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9 (1), 504 (2008).
- Kuhl, C., Tautenhahn, R., Bottcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets. Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).
- Kanehisa, M., Goto, S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).
- Smith, C. A., O’Maille, G., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit. 27 (6), 747-751 (2005).
- Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules. Nucleic Acids Res. 37 Web Server, W623-W633 (2009).
- Wishart, D. S., Knox, C., et al. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic Acids Res. 37 Database, D603-D610 (2009).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Folch, J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).
- Avery, M. J. Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).
