Summary
在这里，我们提出了一个方法气管终端细胞在光镜下分析
Abstract
细胞的形状是细胞功能的关键。然而，尽管细胞形态的重要性，很少有人了解单个细胞如何产生特定的形状。 果蝇气管码头细胞已经成为一个强大的遗传模型生成细胞形态识别和阐明基因的角色。终端细胞是支链的管状网络的一个组成部分，气管系统，内部组织提供氧气的功能。终端细胞是细胞形态的调查问题，因为他们拥有两个不同的蜂窝结构的一个很好的模型。首先，终端细胞有一个复杂的支链的形态，类似的复杂的神经元;第二端细胞分支形成为细管，并包含一种膜结合的细胞内管腔。定量分析终端小区内支路数，枝条组织和个人分支形状，可以用来提供特定的基因机甲的角色信息anisms在决策支电池。在这些细胞中的小管形成的分析可以揭示保守机制的体外小管到其他管状网络，如脊椎动物的血管。这里，我们描述的技术，可以用来迅速修复，图像，并分析两个分支模式和管在终端细胞内形成果蝇幼虫。这些技术可以用于分析终端细胞中野生型和突变型的动物或遗传马赛克。因为此协议的高效率，它也适用于遗传，RNAi为基础，或药物屏幕在果蝇气管系统。
Introduction
细胞的形状为单个细胞内的生物体中的功能是至关重要的，以及细胞，组织或器官的一部分功能。我们使用果蝇气管终末细胞，昆虫呼吸系统的一个组成部分，调查的分子机制，参与在控制两个保守类型的细胞形态：分支和管形成（lumenogenesis）。网络支管的前端位于终端细胞的功能来输送氧气的内部组织1，有一个复杂的支链的形态，取决于所控制的局部氧水平于靶组织2 FGF信号通路。端细胞分支细管，与一个充满气体的贯穿每个分支的亚细胞管腔。不同的蜂窝结构的终端单元，以及由在果蝇中，可以进行遗传分析的简易性，使这些细胞的优异的F型或调查机制的细胞生长，分支，和细胞内管形成。终末细胞的信号转导通路，导致支细胞分化的生长，成熟2-4了解一些已经证明一个有用的模型。使用该系统的公正，正向遗传筛选的细胞形态突变已被执行，控制细胞的形状5,6机制产生的见解。例如，这些屏幕显示，特定RabGAP的所需的细胞骨架的极性和管腔形成囊泡运输和定位7，整合素介导的粘附所需的分支稳定性8，该上皮细胞的PAR极性蛋白调节所需的偏振膜运输分支和管腔形成9。终末细胞的其他研究表明，非对称的肌动蛋白的积累和微管组织需要细胞伸长和lumenogenesis的 这里，我们描述的方法迅速修复分析端细胞分支和管腔形成完好的第三龄果蝇幼虫。此协议也可以进行第一和第二龄期的动物。这种技术的关键是客户终端可视化细胞的基因标记的荧光蛋白表达直接通过完整的动物的幼虫角质层。由于此过程不需要任何固定后的处理，如抗体染色，观察细胞，它是非常适合高通量分析，包括基因或药物筛选。荧光蛋白的表达揭示了细胞质充满分支的结构。管形成，可以并行使用明视场显微术，以确定充有气体的腔，它与周围的流体填充对比监测ED组织。 包括在此协议中的方法，用于产生根据MARCM系统11，以产生纯合突变终端另有未标记动物与荧光蛋白标记细胞的遗传马赛克。这是必要的，因为只有终端细胞阐述其复杂的结构发展相对较晚，要求在其他组织早在发展基因遗传马赛克允许旁路。要产生MARCM克隆，气管被标记为使用这里描述的气管专用驱动气喘吁吁（BTL）12。果蝇 X染色体的协议;其他染色体的相似的方法可以被使用，适当的染色体与遗传试剂审查。在此，气管的细胞质本地化GFP标记的表达，但该过程同样适用与其他荧光蛋白，红色荧光蛋白等的表达。 此外，我们还包括量化分支模式和管腔形成终末细胞的基础上发展为特征的神经元分支图案13的方法，一种方法。这种量化的数据可以识别基因的确切作用在的分支或lumenogenesis过程中，以及允许不同的突变体9之间的直接比较中是至关重要的。
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Protocol
1。马赛克代
- 遗传交叉
瓦特FRT 19A浴缸：多巴胺FLP 122 / Y; BTL-GAL4 UAS-GFP（男性）X * FRT 19A / BAL（女），其中*表示该突变体进行检查。注：建立交叉实验前至少一天，因为这使动物交配适当。 - 预产转让交叉飞食品用小药瓶放在媒体上的鲜酵母膏涂抹。允许打下1小时，在25°C
- 居士：从预产小瓶传送动物用小鲜酵母膏涂抹新鲜小瓶。允许打下6小时，在25°C
- 传输成人预先打好小瓶在随后的实验中储存和使用。立即热休克裁员小瓶含0-6小时的胚胎在38°C，45分钟一个循环水浴。注：食物表面应低于水位，以验证所有胚胎适当加热震惊。
- 孵育4-5天，直到三龄幼虫开始徘徊在25°C热休克小瓶。
2。屏幕马赛克动物
- 用细镊子轻轻一挑游荡第三龄幼虫从小瓶的两侧，并将它们放置在一个小塑料板进入冷冻100％的甘油。
- 使用高倍率解剖显微镜配备荧光光学检查幼虫。识别幼虫与镶嵌表达荧光标记的气管细胞。通常情况下，这是可以做到在10-20X的放大倍率。
3。热固
- 用细镊子仔细挑选马赛克动物的菜和地方上75x25x1毫米白玻璃显微镜幻灯片一滴新鲜的100％的甘油。注意：多个动物可以被放置在下拉式菜单（ 图1A）。
动物也可直接到盖玻片上，放置在甘油下降但必须谨慎采取固定期间（步骤3.2），动物将加热速度非常快，可以成为超过固定。 - 70°C加热块，直到动物放置玻片上停止移动，盖玻片的幻灯片和10秒（ 图1B）不超过20秒。动物会蠕动，但最初停止，并变得僵硬和拉长一旦死了。注：热暴露过长会损坏终端分支机构和流明以及GFP信号暗淡和弥漫。为了获得最佳的效率，建议有作为显微镜在同一房间内的热块。
- 用细镊子小心地定位在一个单一方向的下降，所有的幼虫在所有的幼虫在幻灯片上方向平行（ 图1C）。
- 轻轻这里的18X18MM微玻璃盖之上幼虫（或翻转到载玻片盖玻片），避免形成气泡（ 图1D）。注：盖玻片可能不在完全相同平超过幼虫，这是没有问题的。
- 图片幼虫在30分钟内。热量固定端子细胞会降低的GFP信号会变得非常漫反射。
4，气管终端细胞活体成像
- 将舞台上的一个复合体视显微镜幻灯片。使用5X的目标定位运行从前侧到后侧的动物（ 图1F）的背侧表面上的两个平行的背中继线。找到两个背终末细胞，这两者之间直接背树干。这有助于确定适当的分部分析。
- 一旦为本，旋转图像所需的终端细胞动物。要做到这一点，小心地推盖玻片的边缘钳垂直于长轴的幼虫，，慢慢滚动幼虫盖玻片下方（ 图1E和1G）。
- 一致的结果，选择适当的终端细胞是关键和突变体之间的比较。肥胖的身体支（FB）终端细胞很容易被发现背躯干，正中线旁开相邻。横向G终端细胞（LG），很容易被发现，且位于腹中线外侧（ 图1H）。注：终端单元安排在最前（TR1）和后段（TR10）是发散的，从其他分部。我们只分析终末段TR2-TR9。背终末细胞比其他气管终端细胞有千篇一律的分枝格局。这可能依赖于额外的非细胞自主的信号，并决定是否将它们包含在分析时，应考虑。
- 一旦一个终端单元利息已被确定使用所需的放大倍率，拍摄图像，通常10X或20X是最好的（ 图2A）。注：因变量的分支模式，试图捕捉到的图像，包括尽可能为许多分支和分支提示。
- 没有移动舞台，关闭打开的透射光荧光和明场图像捕捉相同的细胞和焦平面（ 图2B）。管腔内将可视化对比黑暗的终端内的细胞空间。如果规划量化终端细胞分支机构和流明，在多个焦平面每个终端单元采集多个图像。
5。终端细胞形态分析和定量使用ImageJ
- 打开使用插件NeuronJ（ http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ ） ImageJ的（ http://rsb.info.nih.gov/ij/ ）的荧光灯和明图像。
- 使用“添加描”工具中，手动跟踪整个终端单元的树枝和管腔。
- 使用“标签描”工具，重命名和recolor在跟踪一个特定的指定给每个行。
- 使用“设置参数”工具，从6-10像素（512×512得到的图像由数码相机连接到的化合物显微镜调整线宽，更高或更低的分辨率的相机，应适当缩放的像素宽度），使用的所有其他默认设置，并选择“确定”。然后使用“快照”工具拍摄影像。选择“画踪”的跟踪可以显示并排侧与原快照。
- 选择“测量描”工具并选择跟踪类型（ 即分支机构来衡量的基础上分配的具体名称，在步骤5.3）。接着，选择“显示追查测量”和“清除以前的测量”，然后点击“运行”。这将产生一个电子表格中包含的名称，标签的长度（以像素为单位），和其它数据，用于图像。然后，这些数据可以被保存为Microsoft Excel电子表格，进一步的统计的分析。
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Representative Results
结果示于图2。一个单一的横向组（LG）终端细胞显示了广泛的亚分支（可视化通过GFP，A）和一个充满气体的亚细胞腔贯穿每个分支（明视场显微镜可视化; B）。收集这些图像的马赛克L3幼虫，使用的MARCM第1＆2中所述的系统，产生固定的热成像，第3及4中所描述的。 C及D面板显示E及F一个NeuronJ生成的跟踪，如在第5条，树枝和管腔，分别为A和B的面板显示的图像显示的位置在幼虫的脂肪体（FB）分支成像准备中所描述的第3及4。请注意，在这个例子中，动物是没有马赛克，在整个气管系统和GFP表达。 G和H面板显示一个例子，一个GFP标记的终端细胞热固定的时间太长了。 GFP是弥漫性（G），支链s有打破流明的部分不再充满气体，从而出现在明场图像休息。
图1。幼虫准备和识别终端细胞（A）100％的甘油滴在玻片上，将幼虫（B），可以放置多个幼虫热固定（C）热定型后，组织幼虫相互平行（D）（E）将玻璃盖超过幼虫。重新调整幼虫，，玻璃盖用钳子小心地推滚动物。（F）第三龄幼虫野生型GFP表达整个垂直于长轴的幻灯片。气管系统。配对背裤（DT）是个上可见ê背侧（G）相同的幼虫后轧制技术与腹侧朝上。（H）图侧视两个三龄的气管hemisegments（一hemisegment以灰色突出显示）。圆圈表示横向组（LG）和脂肪体（FB）的终末细胞，我们使用定量。虚线代表我们不经常定量气管系统的其他分支。幼虫段气管分支的完整描述，请参阅参考文献1。
图2。 （AD） 的代表图像。马赛克L3幼虫产生使用的MARCM技术（第1节），使用的协议，第2-4固定和成像。分枝格局的一个单一的LG端子细胞娃小号可视化由镶嵌表达GFP（A）充气腔用明视场显微镜（B）可视化。 （C）跟踪的细胞，产生使用NeuronJ（第5）的分枝格局。 （D）跟踪充气腔在B细胞产生使用NeuronJ（协议第5节）。 （E，F）脂肪体（FB）终端细胞（突出红色圆圈）用GFP表达整个气管系统（E）和明显微镜（F）准备由协议第2-4幼虫。 （G，H）例样品加热时间过长时，得到的固定工件。 GFP是弥漫型和小树枝已退化（G）。管腔的领域也不再出现充满空气的（箭头H中）。比例尺：100微米。
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Discussion
这里描述的热固定技术是一种快速，方便的工具，成像果蝇幼虫气管终末细胞。在这里，我们使用这种技术来研究野生型细胞分支和流明模式。气管细胞表达GFP，气管特异性启动子气喘吁吁驱动，可以很容易地可视化，通过热固定后的幼虫角质层。的具体的分支型态的单独终端细胞，以及那些充满空气的腔，可快速可视化，并使用这个方法测量。这种技术也可以进行第一和第二龄幼虫。然而，必须注意在固定较小的动物，可以作为荧光蛋白表达很容易被打乱。
在这里给出的方法中，我们描述一个马赛克动物在单一的气管细胞中表达了绿色荧光蛋白（GFP）的分析。然而，相同的技术是适用于气管细胞分析numbe下R实验操作。比如，动物基因表达被改变的分子生物学方法，在整个气管系统或单个细胞中的RNAi转基因或修饰的蛋白质的表达，也可以使用这种方法检查。非遗传影响终端细胞的发育，如药物或缺氧2,14的治疗，也可使用这些方法，其特征在于。在后一种情况下，有必要从果蝇股票组成型表达GFP或另一个荧光蛋白在其整个气管系统，以可视化的分支型态。填充气体可以被检查，无论荧光蛋白的表达。
在这里，我们只显示未标记的（细胞质本地化）GFP被用来标记气管系统的例子。然而，这里描述的方法也适合于检测其他的固有荧光蛋白，红色荧光蛋白等，以及荧光亲蛋白已被修改特定的亚细胞结构进行本地化。例如，肌动蛋白：绿色荧光蛋白或微管蛋白：GFP融合可用于可视化在气管细胞骨架10。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
我们感谢阿娇斯坦菲尔德对稿件的意见。 TAJ支持犹他州遗传学培训格兰特T32 GM007464从NIH NIGMS大学中。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
References
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