Summary
Aqui, apresentamos um método para análise de microscopia de luz das células terminais traqueal em
Abstract
Forma celular é crítico para a função celular. No entanto, apesar da importância da morfologia celular, pouco é conhecido sobre as células individuais como gerar formas específicas. Células terminais traqueais Drosophila tornaram-se um modelo genético poderosa para identificar e elucidar os papéis dos genes necessários para a geração de morfologias celulares. Células de terminais são um componente de uma rede tubular ramificada, o sistema traqueal que funciona de modo a fornecer oxigénio aos tecidos internos. Células de terminais são um excelente modelo para investigar questões de forma da célula que possuam duas arquitecturas celulares distintas. Primeiro, as células terminais têm uma morfologia ramificado elaborado, semelhante aos neurónios complexos, em segundo lugar, os ramos celulares terminais são formadas como tubos finos e contêm um lúmen ligada à membrana intracelular. A análise quantitativa do número de células ramo terminal, organização ramo e forma ramo individual, pode ser usado para fornecer informações sobre o papel do mecanismo genético específicomos na confecção de uma célula ramificada. Análise de formação de tubos nestas células pode revelar os mecanismos conservadas do tubulogenesis comuns a outras redes tubulares, tais como a vasculatura vertebrado. Aqui, descrevem técnicas que podem ser usadas para corrigir rapidamente, imagem e analisar os padrões de ramificação e em células de formação de tubo de terminal dentro larvas de Drosophila. Estas técnicas podem ser utilizadas para analisar as células terminais em animais de tipo selvagem e mutante, ou mosaicos genéticos. Devido à elevada eficiência deste protocolo, é também adequada para genético, baseado RNAi, ou telas da droga no sistema de Drosophila traqueal.
Introduction
Forma celular é crítico para a função das células individuais dentro de um organismo, bem como células que funcionam como parte de um tecido ou órgão. Nós usamos células terminais de Drosophila traqueais, um componente do sistema respiratório de insetos, para investigar os mecanismos moleculares que participam no controle de dois tipos conservados de morfologia celular: Desvios e formação do tubo (lumenogenesis). Células terminais estão localizadas nas pontas de uma rede de tubos ramificados que funciona para fornecer oxigénio aos tecidos internos 1 e têm uma morfologia ramificado elaborado, que depende de uma via de sinalização do FGF, que é controlado por níveis de oxigénio dentro dos tecidos locais-alvo 2. Ramos terminais celulares são tubos finos, com cheias de gás lúmen subcelulares que atravessam cada ramo. As arquitecturas celulares distintas de células de terminal, juntamente com a facilidade através da qual a análise genética pode ser realizada em Drosophila, tornar essas células um modelo excelente fou investigar os mecanismos de crescimento celular, a ramificação, e a formação do tubo intracelular. Células Terminal provaram um modelo útil para compreender algumas das vias de sinalização que levam à diferenciação de células ramificadas, conseqüência, e maturação 2-4. Usando este sistema imparcial, telas para a frente genéticos para mutantes morfogênese celular foram realizados, gerando insights sobre os mecanismos que controlam a forma da célula 5,6. Por exemplo, estas telas tenham revelado que um RabGAP específico é necessário para a polaridade do citoesqueleto e o tráfico de vesículas na formação de lúmen e de posicionamento 7, que a adesão mediada pela integrina é necessária para a estabilidade do ramo 8, e que as proteínas de PAR-polaridade epiteliais regular tráfico membrana polarizado necessário tanto para a ramificação e formação de lúmen 9. Outros estudos em células de terminais têm mostrado que a acumulação de actina assimétrica e organização de microtúbulos é necessária para o alongamento das células e lumenogenesis Aqui, descrevemos um método para corrigir rapidamente as larvas Drosophila terceiro instar intacto para análise de células ramificação terminal e formação de lúmen. Este protocolo pode também ser efectuada em ambos os primeiro e segundo instar animais. A chave para esta técnica é a capacidade de visualizar as células terminais que estão geneticamente marcadas através da expressão da proteína fluorescente directamente através da cutícula larval de animais intactos. Uma vez que este procedimento não requer quaisquer manipulações pós-fixação, tais como a coloração do anticorpo, para observar as células, que é bem adequado à análise de alto rendimento, incluindo o rastreio genético ou fármaco. A expressão da proteína fluorescente que revela a estrutura dos ramos cheias de citoplasma. Formação do tubo pode ser controlado em paralelo utilizando microscopia de campo claro para identificar o lúmen cheio de gás, o que contrasta com o ambiente fluido enchatecidos ed. Incluído neste protocolo é o método para a geração de mosaicos genéticos baseados no sistema MARCM 11, para produzir as células terminais mutantes homozigotos marcadas com proteínas fluorescentes em animais unlabeled contrário. Isto é necessário, uma vez que as células terminais só elaborar suas estruturas complexas relativamente tarde no desenvolvimento; mosaicos genéticos permitem a derivação de requisitos de genes em outros tecidos anteriores em desenvolvimento. . Gerar clones MARCM, traquéia são rotulados usando o driver específico-traqueal sem fôlego (BTL) 12 aqui descrito é o protocolo para o cromossomo X Drosophila, por outros cromossomos, um procedimento semelhante pode ser usado, com reagentes genético apropriado para o cromossoma ser examinados. Aqui, a traqueia são rotulados por expressão de uma GFP citoplasmaticamente localizada, mas o procedimento funciona igualmente bem com a expressão de outras proteínas fluorescentes, tais como DsRed. Além disso, nós incluímos um método para quantificar os padrões de ramificação e formação de lúmen em células de terminais, com base em métodos desenvolvidos para a caracterização de padrões de ramificação neuronal 13. Este tipo de dados quantitativos pode ser crítico para discernir o papel exacto de genes no processo de ramificação ou lumenogenesis, bem como permitindo comparações directas entre diferentes mutantes 9.
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Protocol
1. Geração de Mosaico
- Cruzamento genético
w FRT 19A banheira: GAL80 FLP 122 / Y; Btl-GAL4, UAS-GFP (do sexo masculino) X * FRT 19A / Bal (fêmeas), onde * representa o mutante para ser examinado. Nota: Configurar atravessar pelo menos um dia antes da experiência, pois isso permite que os animais se acasalar adequadamente. - Pré-lay: Cruz transferência para frascos voar alimentares com uma pequena mancha de pasta de fermento fresco colocado na mídia. Permitir fixar durante 1 hora a 25 ° C.
- Lay: animais de Transferência de pré-configuração frasco para um novo frasco com uma pequena mancha de pasta de fermento fresco. Permitir a deitar por 6 h a 25 ° C.
- Adultos de transferência de volta ao frasco pré-configuração para armazenamento e uso em experimentos posteriores. Imediatamente choque de calor do frasco contendo leigo 0-6 hr embriões velhos durante 45 min a 38 ° C, num banho de água circulante. Nota: A superfície do alimento deve estar abaixo do nível de água para verificar todosembriões são adequadamente aquecer chocado.
- Incubar calor frascos chocou a 25 ° C por 4-5 dias até larvas de terceiro instar começar a vagar.
2. Tela para Mosaico Animais
- Usando fórceps finos escolher cuidadosamente errante larvas de terceiro instar a partir dos lados do frasco e colocá-los em refrigeradas glicerol 100% numa pequena placa de plástico.
- Examinar larvas usando um microscópio de alta ampliação de dissecação equipado com óptica fluorescentes. Identificar larvas com expressão mosaico de células de traquéia fluorescente etiquetado. Tipicamente, isto pode ser feito em 10-20X de ampliação.
3. Fixação de calor
- Utilizando uma pinça fina escolher cuidadosamente os animais mosaico fora do prato e coloque em uma gota de fresco 100% de glicerol em um mm branco vidro lâmina de microscópio 75x25x1. Nota: vários animais podem ser colocados na gota (Figura 1A).
Os animais também podem ser colocados numa gota de glicerol sobre uma lamela directamente,mas cuidado deve ser tomado durante a fixação (passo 3.2), já que os animais vão aquecer muito rapidamente e pode tornar-se mais fixo. - Lugar lâmina de vidro para 70 ° C em bloco de calor até que os animais só parar de se mover, não mais do que 20 segundos para um slide, e 10 seg para uma lamela (Figura 1B). Animais vão torcer inicialmente, mas parar e tornar-se rígida e alongada, uma vez morto. Nota: A exposição prolongada ao calor pode danificar ramos terminais e lúmens, bem como fazer o sinal GFP fraca e difusa. Para a máxima eficiência recomenda-se que o bloco de calor no mesmo quarto que os microscópios.
- Usando fórceps finos orientar cuidadosamente todas as larvas na gota num único sentido, de tal modo que todas as larvas do slide são orientados paralelamente uns aos outros (Figura 1C).
- Suavemente colocar uma tampa de vidro de micro 18x18mm no topo das larvas (ou a lamela invertido sobre uma lâmina de vidro) e evitar a formação de bolhas (Figura 1D). Nota: lamela pode não estar exatamenteplana sobre larvas, isto não é um problema.
- Larvas de Imagem dentro de 30 min. Células terminais fixas de calor irá degradar o sinal de GFP e irá tornar-se muito difusa.
4. Imagem in vivo de células terminais traqueais
- Coloque deslize no palco de um microscópio estereoscópico composto. Usando um objetivo 5X localizar os dois troncos dorsal paralelas que correm de anterior para posterior na superfície dorsal do animal (Figura 1F). Localize as duas células terminais dorsal, diretamente entre os dois troncos dorsal. Isso ajuda a identificar o segmento apropriado para análise.
- Uma vez orientada, rodar os animais para as células da imagem de terminais desejados. Para fazer isso, empurrar cuidadosamente a lamela na extremidade com a pinça perpendicular ao eixo longo das larvas, rolando lentamente as larvas sob a lamela (Figuras 1E e 1G).
- Selecionando as células terminais apropriados é fundamental para resultados consistentese as comparações entre os mutantes. Células terminais do ramo de gordura corporal (FB) são facilmente encontrados junto ao tronco dorsal, lateral à linha média. As células do Grupo G terminais laterais (LG) são facilmente encontradas e estão localizadas imediatamente lateral da linha média ventral (Figura 1H). Nota: nos (TR10) segmentos mais anteriores (Tr1) e posterior o arranjo de célula terminal é divergente de outros segmentos. Nós só analisar as células terminais em segmentos Tr2-TR9. Células terminais dorsais têm um padrão de ramificação mais estereotipados do que outras células do terminal da traquéia. Isto pode depender de sinais autónomas adicionais, não-celulares, e isso deve ser considerado quando se decide se a incluí-los na análise.
- Uma vez que uma célula de terminal de interesse tiver sido identificado, a captura de uma imagem utilizando a ampliação desejada; tipicamente 10X ou 20X é melhor (Figura 2A). Nota: devido a padrões de ramificação variáveis, tentar capturar imagens que incluem como muitos ramos e dicas ramo como possível.
- Sem mover o palco, desligue a fluorescência e acender a luz transmitida para capturar uma imagem de campo claro da mesma célula e plano focal (Figura 2B). O lúmen será visualizado como escura contrastante dentro do espaço celular terminal. Se planejando quantificar ramos terminais celulares e lúmens, recolher várias imagens em múltiplos planos focais de cada célula terminal.
5. Análise e Quantificação da morfologia celular Terminal Usando ImageJ
- Abra as imagens fluorescentes e brightfield usando o ImageJ ( http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) plug-in NeuronJ ( http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ ).
- Usando o "Add traçados" ferramenta, traçar manualmente os ramos e lúmen da célula do terminal inteiro.
- Usando a ferramenta "Etiqueta traçados", renomear e reColor atribuir a cada linha dentro do trace uma designação específica.
- Usando a ferramenta "Definir parâmetros", ajustar a largura da linha 6-10 pixels (512x512 para imagens obtidas a partir da câmera digital conectada ao microscópio composto. Para câmaras maior ou menor resolução, a largura de pixel deve ser dimensionado de forma adequada), utilizando todos outras configurações padrão e clique em "OK". Em seguida, use a ferramenta "Faça snapshot" para tirar uma foto. Escolha "Draw trace" para obter um instantâneo do traço que pode ser mostrado, lado a lado com o original.
- Selecione a ferramenta "Measure traçados" e selecione o tipo de rastreamento (ou seja, que se ramifica para medir com base nas designações específicas atribuídas no passo 5.3). Em seguida, selecione "Mostrar medições de rastreamento" e "Limpar medições anteriores" e clique em "Executar". Isto produzirá uma folha de cálculo que contém o nome, a etiqueta, o comprimento (em pixels), e outros dados para a imagem. Estes dados podem ser salvos como uma planilha do Microsoft Excel para posterior estatísticaanálise.
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Representative Results
Os resultados são mostrados na Figura 2. Um grupo lateral, único (LG) célula do terminal mostra extensa ramificação subcelular (visualizado por GFP; A) e um cheios de gás lúmen subcelulares que atravessa cada um dos ramos (visualizadas por microscopia de campo claro, B). Estas imagens foram coletadas a partir de um mosaico L3 larva, gerado através do sistema MARCM descritos nas seções 1 e 2, eo calor fixa e fotografada, conforme descrito nas seções 3 e 4. Painéis C e D mostram um traço NeuronJ gerado, conforme descrito no capítulo 5, dos ramos e na luz, respectivamente, as imagens mostradas em A & B. Painéis E & F mostram a localização da gordura corporal (BF) filial em uma larva preparado para imagiologia como descrito nas secções 3 e 4. Note-se que, neste exemplo, o animal não é um mosaico, e GFP é expresso em todo o sistema traqueal. Os painéis G e H mostra um exemplo de um terminal de células de GFP marcada com que o calor foi fixado para um tempo demasiado longo. GFP é difuso (G), Branches ter quebrado para baixo e porções de lumens não são mais cheio de gás, aparecendo assim como quebras na imagem brightfield em.
Figura 1. Larvas preparação e identificação de células terminais. (A) Local larva numa gota de 100% de glicerol numa lâmina de vidro. (B) larvas múltipla podem ser colocados para a fixação de calor. (C) Após fixação do calor, organizar larvas paralelos uns aos outros e perpendicular ao longo eixo do slide. (D) Colocar tampa de vidro sobre larvas. (E) Para reorientar larvas, empurre cuidadosamente tampa de vidro com uma pinça para rolar os animais. (F) do tipo selvagem terceiro larva instar com GFP expressa em todo o sistema traqueal. Os troncos dorsal emparelhados (DT) são visíveis no the do lado dorsal. (G) O mesmo larva após a técnica de rolamento com o lado ventral agora virada para cima. (H) Diagrama de visão lateral de duas hemisegments traqueais terceiro estádio (um hemisegmento é destacado em cinza). Círculos indicam grupo lateral (LG) e gordura corporal (FB), as células terminais que usamos para a quantificação. As linhas tracejadas representam os outros ramos do sistema traqueal que não costumam quantificar. Para uma descrição completa dos ramos traqueal em um segmento larval, consulte Ref 1.
Figura 2. Imagens representativas. (AD) larvas L3 Mosaic foram gerados usando a técnica MARCM (seção 1) e fixado e fotografada usando o protocolo nas seções 2-4. O padrão de ramificação de um único terminal de celular LG was visualizadas por expressão do mosaico da GFP (A), o lúmen cheios com gás visualizado com microscopia de campo claro (B). (C) Rastreamento do padrão de ramificação da célula A, gerada utilizando NeuronJ (seção 5). (D) Rastreamento da luz cheias de gás da célula B, gerados usando NeuronJ (seção de protocolo 5). (E, F) Um corpo (FB) da célula terminal de gordura (realçado pelo círculo vermelho) visualizadas por expressão da GFP em todo o sistema traqueal (E) e de microscopia de campo claro (F), em uma larva preparado pelo protocolo nas secções 2-4. (G, H) Exemplo de artefactos de fixação obtidos quando a amostra é aquecida durante um período demasiado longo. GFP é difuso e pequenos ramos têm degradado (G). Áreas de luz também não aparecem mais cheia de ar (seta H). Barra de escala: 100 mM.
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Discussion
A técnica de fixação calor aqui descrito é uma ferramenta rápida e conveniente para as células terminais traqueais imagem Drosophila larvas. Aqui, podemos utilizar esta técnica para examinar o padrão de ramificação e do lúmen de células do tipo selvagem. Células de traquéia expressando GFP, impulsionada pelo promotor específico traqueal fôlego, pode ser facilmente visualizado através da cutícula larval após a fixação de calor. Os padrões de ramificação específicos de células individuais do terminal, bem como as dos lúmen cheias de ar, pode ser rapidamente visualizados e medidos usando este método. Esta técnica também pode ser realizada em ambos os primeiro e segundo larvas. No entanto, é preciso ter cuidado na fixação de pequenos animais, como a expressão da proteína fluorescente pode ser facilmente interrompido.
No método mostrado aqui, descreve uma análise de animais mosaico com a GFP expressa em células individuais de traqueia. No entanto, as mesmas técnicas são aplicáveis a análise das células da traqueia sob uma number de manipulações experimentais. Por exemplo, animais em que a expressão do gene foi modificado por abordagens moleculares, em todo o sistema traqueal ou em células individuais, através da expressão de transgenes RNAi ou proteínas modificadas, também podem ser examinadas com esta abordagem. Os tratamentos não genéticos que afectam o desenvolvimento das células do terminal, tais como drogas ou hipóxia 2,14, também podem ser caracterizados utilizando estes métodos. Nestes últimos casos, é necessário partir de um estoque de Drosophila constitutivamente expressando GFP ou outra proteína fluorescente em todo o seu sistema traqueal de modo a visualizar os padrões de ramificação. Gás de preenchimento pode ser examinado, independentemente da expressão da proteína fluorescente.
Aqui, vamos apenas mostrar exemplos de untagged (citoplasmicamente localizada) GFP sendo usado para rotular o sistema traqueal. No entanto, os métodos aqui descritos também são adequados para a detecção de outras proteínas nativas fluorescentes, tais como DsRed, bem como pro fluorescenteproteínas que tenham sido modificadas para estar localizada a estruturas subcelulares específicos. Por exemplo, a actina: GFP ou tubulina: fusões de GFP pode ser utilizado para visualizar o citoesqueleto traqueal 10.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm concorrentes interesse financeiro.
Acknowledgments
Agradecemos Gillian Stanfield para comentários sobre o manuscrito. TAJ é apoiado pela Universidade de Utah Genetics Training Grant T32-GM007464 do NIH NIGMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
References
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