Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Undersøgelse af Published: July 9, 2013 doi: 10.3791/50496
Automatic Translation
1, 1
1Department of Human Genetics, University of Utah

Summary

Her præsenterer vi en metode til lysmikroskopi analyse af trakeale terminale celler

Abstract

Celleform er kritisk for cellefunktion. Men på trods af betydningen af cellemorfologi, er lidt om, hvordan de enkelte celler genererer specifikke former. Drosophila trakeale terminal cellerne er blevet en kraftfuld genetisk model til at identificere og belyse de roller gener, der kræves for at generere cellulære morfologi. Terminale celler er en del af et forgrenet rørformet net, trakeal system, der fungerer til at levere ilt til interne væv. Terminale celler er en fremragende model til undersøgelse spørgsmål celle form som de besidder to forskellige cellulære arkitekturer. Først terminale celler har en omfattende forgrenet morfologi, der ligner komplekse neuroner, for det andet er terminale celle filialer dannet som tynde rør og indeholder en membranbundet intracellulær lumen. Kvantitativ analyse af terminal celle filial nummer, brancheorganisation og individuel gren form, der kan bruges til at give oplysninger om den rolle, specifikke genetiske mechnismer i frembringelsen af ​​et forgrenet celle. Analyse af rør-dannelse i disse celler kan afsløre konserverede mekanismer tubulogenesis fælles for andre rørformede net, såsom hvirveldyr vaskulatur. Her beskriver vi teknikker, der kan bruges til hurtigt at fastsætte, billede og analysere både forgrenede mønstre og rør dannelse i terminal celler i Drosophila larver. Disse teknikker kan anvendes til at analysere terminale celler i vildtype-og mutant dyr, eller genetiske mosaikker. På grund af den høje effektivitet i denne protokol, er det også velegnet til genetiske, RNAi-baserede eller narkotika skærme i Drosophila luftrør system.

Introduction

Celleform er kritisk for funktionen af ​​de enkelte celler i en organisme, samt celler, der fungerer som en del af et væv eller organ. Vi bruger Drosophila trakeale terminal celler, en komponent af insekt åndedrætsorganerne, til at undersøge de molekylære mekanismer, der deltager i styring af to bevarede typer af cellulære morfologi: branching og rør dannelse (lumenogenesis). Terminal celler er placeret på spidsen af et netværk af forgrenede rør, der fungerer til at levere ilt til interne væv 1 og har en omfattende forgrenet morfologi, der er afhængig af en FGF signalvejen, der styres af lokale iltindhold inden målvæv 2. Terminal celle grene er tynde rør, med et gasfyldte subcellulære lumen løber gennem hver gren. De forskellige cellulære arkitekturer for terminal-celler, sammen med den lethed, hvormed genetisk analyse kan udføres i Drosophila, gør disse celler en fremragende model feller efterforske mekanismer cellulær udvækst forgrening, og intracellulære rørdannelse. Terminal celler har vist en nyttig model til at forstå nogle af de signalveje, der fører til forgrenede celledifferentiering, udvækst, og modning 2-4. Bruger dette system fordomsfri, har frem genetiske skærme til celle morfogenese mutanter blevet udført, giver indsigt i mekanismer, der styrer cellens form 5,6. For eksempel har disse skærme afsløret, at en specifik RabGAP er nødvendig for cytoskelet polaritet og vesikel handel i lumen dannelse og positionering 7, at integrin-medieret adhæsion er nødvendig for filial stabilitet 8, og at epitelial PAR-polaritet proteiner regulerer polariseret membran kræves handel for både forgrening og lumen dannelse 9.. Andre undersøgelser i terminal celler har vist, at asymmetriske actin ophobning og mikrotubulus organisation er nødvendig for celleforlængelse og lumenogenesis

Her beskriver vi en metode til hurtigt at fastsætte intakt tredje stadie Drosophila larver til analyse af terminal celle forgrening og lumen dannelse. Denne protokol kan også udføres på både første og andet stadium dyr. Nøglen til denne teknik er evnen til at visualisere terminale celler, der er genetisk mærket med fluorescerende protein ekspression direkte gennem larve kutikula af intakte dyr. Da denne procedure ikke kræver nogen post-fiksering manipulationer, såsom antistoffarvning, at observere cellerne, er det velegnet til high throughput analyse, herunder genetisk eller narkotika screening. Fluorescerende protein ekspression afslører strukturen af ​​de cytoplasmatisk-fyldte grene. Rørdannelse kan overvåges parallelt med lysfelt-mikroskopi til at identificere det gasfyldte hulrum, som står i kontrast til den omgivende væske-filled væv.

Inkluderet i denne protokol er den metode til at generere genetiske mosaikker er baseret på MARCM systemet 11 til at producere homozygote mutant terminal celler mærket med fluorescerende proteiner i ellers umærkede dyr. Dette er nødvendigt, fordi terminal celler kun udarbejde deres komplekse strukturer relativt sent i udviklingen, genetiske mosaikker tillader bypass af gen krav i andre væv tidligere i udviklingen. . For at generere MARCM kloner er luftrøret mærkes ved hjælp af trakeal-specifikke driver forpustet (BTL) 12. Beskrevet her er protokollen for Drosophila X-kromosomet, for andre kromosomer, kan en tilsvarende procedure anvendes, med genetiske reagenser hensigtsmæssigt at kromosomet bliver undersøgt. Her er luftrøret mærket ved ekspression af et cytoplasmatisk lokaliseret GFP, men proceduren virker lige godt med ekspression af andre fluorescerende proteiner, såsom DsRed.

Derudover har vi inkluderet en metode til at kvantificere forgrenede mønstre og lumen dannelse i terminal celler, baseret på metoder udviklet til at karakterisere neuronale gren mønstre 13. Denne form for kvantitative data kan være kritisk i kræsne den præcise rolle af gener i forgrening eller lumenogenesis proces, samt giver mulighed for direkte sammenligninger mellem forskellige mutanter 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Mosaic Generation

  1. Genetisk Cross
    w FRT 19A tub: GAL80 FLP 122 / Y, Btl-GAL4, UAS-GFP (hanner) X * FRT 19A / Bal (hunner), hvor * repræsenterer mutanten skal undersøges. Bemærk: Opsætning krydser mindst én dag før eksperimentere, da dette giver dyrene til at parre korrekt.
  2. Pre-lay: Transfer cross at flyve-food hætteglas med en lille udstrygning af frisk gær pasta placeres på mediet. Tillad at lægge i 1 time ved 25 ° C.
  3. Lay: Overfør dyr fra pre-lægge hætteglasset til et frisk hætteglas med en lille udstrygning af frisk gær pasta. Tillad at lægge i 6 timer ved 25 ° C.
  4. Overfør voksne tilbage til pre-lægge hætteglasset til opbevaring og brug i de efterfølgende eksperimenter. Umiddelbart varmechok lay hætteglas indeholdende 0-6 hr gamle embryoner i 45 minutter ved 38 ° C, i et cirkulerende vandbad. Bemærk: Overfladen på fødevarer bør være under vandoverfladen for at efterprøve alleembryoner passende varme chokeret.
  5. Inkuber varmechok hætteglas ved 25 ° C i 4-5 dage, indtil tredje stadie larver begynder at vandre.

2.. Screen for Mosaic Animals

  1. Hjælp af fine tænger forsigtigt pick vandrer tredje stadie larver fra siderne af hætteglasset og placere dem i kølede 100% glycerol i en lille plastplade.
  2. Undersøg larver ved hjælp af en stor forstørrelse-dissektionsmikroskop udstyret med fluorescerende optik. Identificere larver med mosaik ekspression af fluorescensmærkede luftrøret celler. Typisk kan dette gøres ved 10-20X forstørrelse.

3.. Varmefiksering

  1. Brug fine tænger forsigtigt pick mosaik dyr ud af skålen og anbringes i en dråbe af frisk 100% glycerol på en 75x25x1 mm hvidt glas objektglas. Bemærk: flere dyr kan placeres i drop (figur 1A).
    Dyr kan også placeres i en dråbe glycerol direkte på et dækglas,men man skal være opmærksom under fiksering (trin 3.2), da dyrene vil varme meget hurtigt og kan blive over-faste.
  2. Placer glasplade på 70 ° C varmeblok, indtil dyrene bare stoppe bevæger sig, ikke mere end 20 sek til et dias, og 10 sekunder for en dækglas (figur 1B). Dyrene vil vride første omgang, men stoppe op og blive stive og aflange engang døde. Bemærk: pruttes udsættelse for varme vil skade terminal grene og lumen samt gøre GFP-signalet dim og diffus. For optimal effektivitet anbefales det at have varmeblok i samme rum som mikroskoper.
  3. Hjælp af fine tænger omhyggeligt orientere alle larver i drop i en enkelt retning, således at al larver på objektglasset er orienteret parallelt med hinanden (figur 1C).
  4. Forsigtigt placere en 18x18mm micro dækglas på toppen af larver (eller invertsukker dækglasset på en glasplade), og Undgå dannelse af bobler (figur 1D). Bemærk: dækglas må ikke ligge nøjagtigtfladt larver, er dette ikke et problem.
  5. Billede larver inden for 30 min. Heat fast terminal celler vil nedbrydes og GFP-signalet bliver meget diffus.

4.. In vivo Imaging af luftrør Terminal Cells

  1. Placer slide på scenen af ​​et sammensat stereomikroskop. Ved hjælp af en 5X objektiv lokalisere de to parallelle dorsale trunke løber fra anterior til posterior på den dorsale overflade af dyret (figur 1F). Find de to dorsale terminal celler, direkte mellem de to dorsale badebukser. Dette hjælper med at identificere den rette segment til analyse.
  2. Når orienteret, rotere dyrene til billede ønskede stik celler. At gøre dette, skubbes den dækglasset på kanten med pincet vinkelret på den lange akse af larverne, langsomt rullende larverne under dækglasset (fig. 1E og 1G).
  3. Valg af passende terminal celler er afgørende for ensartede resultaterog sammenligninger mellem mutanter. Den fede krop gren (FB) terminal celler findes let ved siden af ​​dorsale stammen, lateral med midterlinjen. De laterale gruppe G terminal celler (LG) findes nemt og er placeret lige sideværts af den ventrale midterlinie (figur 1H). Bemærk: I de mest forreste (Tr1) og posterior (TR10) segmenter arrangementet af terminal celle er forskellige fra andre segmenter. Vi har kun analyserer terminal celler segmenter Tr2-TR9. Dorsal terminal celler har et mere stereotypt forgrenede mønster end andre trakeale terminal celler. Det kan afhænge af yderligere, ikke-celle selvstændige signaler, og det bør overvejes, når det besluttes, om at medtage dem i analysen.
  4. Når en terminal celle af interesse er blevet identificeret, tage et billede ved hjælp af den ønskede forstørrelse, typisk 10X eller 20X er bedst (figur 2A). NB: På grund af variable forgrening mønstre, forsøger at indfange billeder, der indeholder så mange filialer og filialer tips som muligt.
  5. Uden at flytte scenen, sluk fluorescens og tænde det lys til at fange en brightfield billede af den samme celle og fokusplan (figur 2B). Hulrummet vil være visualiseret som mørk kontrast i den terminale celle rum. Hvis planlægning på kvantificere terminal celle grene og lumen, indsamle flere billeder i multiple brændpunktsflader af hver terminal celle.

5.. Analyse og kvantificering af Terminal Cellemorfologien Brug ImageJ

  1. Åbn lysstofrør og lysfelt billeder ved hjælp af ImageJ ( http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) plug-in NeuronJ ( http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ ).
  2. Brug af "Add tracings" værktøj, spore manuelt grene og lumen hele terminalen cellen.
  3. Brug af "Label tracings" værktøj, omdøbe og reColor at tildele hver linje i Spore en specifik betegnelse.
  4. Brug af "Set parametrene" værktøj, linjebredden justeres 6-10 pixels (til 512x512 billeder stammer fra digitalkameraet tilsluttet sammensat mikroskop. For højere eller lavere opløsning kameraer, bør Pixelbredden skaleres passende), ved hjælp af alle andre standardindstillinger, og vælg "OK". Brug derefter "Make snapshot" værktøj til at tage et billede. Vælg "Tegn trace" for at få et øjebliksbillede af spor, der kan vises side om side med originalen.
  5. Vælg "Measure tracings" værktøj, og vælg sporing type (dvs. som grene til på grundlag af den konkrete betegnelser tildelt i trin 5.3). Dernæst skal du vælge "Display tracing målinger" og "Ryd tidligere målinger" og derefter klikke på "Kør". Dette vil give et regneark, der indeholder navnet, etiket, længde (i pixel), og andre data for billedet. Disse data kan derefter gemmes som en Microsoft Excel-regneark til yderligere statistiskanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultater er vist i figur 2.. En enkelt lateral gruppe (LG) terminal celle viser omfattende subcellulære forgrening (visualiseret ved GFP, A) og en gasfyldt subcellulære lumen løber gennem hver af de erhvervsgrene (visualiseret ved brightfield mikroskopi, B). Disse billeder blev indsamlet fra en mosaik L3 larve, der genereres ved hjælp af MARCM er beskrevet i § § 1 og 2, og varme fast og afbildet som beskrevet i afsnit 3 & 4. Paneler C & D viser en NeuronJ genereret spor, som beskrevet i afsnit 5, af grenene og lumen henholdsvis de billeder, der vises i A & B. Paneler E & F viser placeringen af ​​fedt kroppen (FB) filial i en larve forberedt til billedbehandling, som beskrevet i afsnit 3 & 4. Bemærk, at i dette eksempel, at dyret ikke er en mosaik, og GFP udtrykkes i hele luftrør systemet. Paneler G og H viser et eksempel på en GFP-mærket terminal celle, der var varme fastsat for lang tid. GFP er diffus (G), branches har brudt ned, og dele af lumen ikke længere gasfyldte, og dermed optræder som pauser i brightfield billedet.

Figur 1
Figur 1. Larver forberedelse og identifikation af terminale celler. (A) Placer larve i en dråbe af 100% glycerol på en glasplade. (B) Flere larver kan placeres varmefiksering. (C) Efter varmefiksering, organisere larver parallelt med hinanden og vinkelret på den lange akse af diaset. (D) Sted cover glas over larver. (E) At nyorientere larver, skub forsigtigt dækglas med en pincet til at rulle dyrene. (F) Wild-typen tredje stadie larve med GFP udtrykt i hele trakeal systemet. De parrede dorsale kufferter (DT) er synlige på the dorsalsiden. (G) Den samme larve efter rullende teknik med den ventrale side nu opad. (H) Diagram over lateral billede af to tredje stadiums trakeale hemisegments (en hemisegment er fremhævet i gråt). Cirkler angiver lateral gruppe (LG) og fedt kroppen (FB) terminal celler, som vi bruger til kvantificering. Stiplede linjer repræsenterer andre grene af trakeal system, som vi ikke rutinemæssigt kvantificere. For en fuldstændig beskrivelse af de trakeale filialer i en larve segment, se Ref 1..

Figur 2
Figur 2. Repræsentative billeder. (AD) Mosaic L3 larver blev genereret ved hjælp af MARCM teknik (afsnit 1), og fast og filmede med protokollen i § § 2-4. Forgrening mønster af en enkelt LG terminal celle was visualiseres ved mosaik udtryk af GFP (A), de gasfyldte lumen visualiseret med lysfelt mikroskopi (B). (C) Sporing af forgrening mønster af cellen i A, genereres ved hjælp NeuronJ (afsnit 5). (D) Sporing af de gasfyldte lumen af ​​cellen i B, genereret med NeuronJ (protokol afsnit 5). (E, F) Et fedt kroppen (FB) terminal celle (fremhævet af den røde cirkel) visualiseres ved GFP udtryk over hele trakeal systemet (E) og lysfelt mikroskopi (F) i en larve udarbejdet af protokollen i § § 2-4. (G, H) Eksempel på fiksering artefakter opnået, når prøven opvarmes i en for lang periode. GFP er diffus og mindre afdelinger har nedbrudt (G). Områder i lumen også vises ikke længere luftfyldte (pilen H). Scale bar: 100 um.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Varmen fiksering teknikken beskrevet her er en hurtig og praktisk værktøj til billedbehandling Drosophila larver trakeale terminal celler. Her bruger vi denne teknik til at undersøge forgrening og lumen mønster af vildtypeceller. Trakeal celler, der udtrykker GFP, drevet af luftrør specifik promotor forpustet, kan nemt visualiseres gennem larve kutikula efter varmefiksering. De specifikke forgrening mønstre af individuelle terminal celler, såvel som de af luftfyldte hulrum, kan være hurtigt visualiseres og måles ved hjælp af denne metode. Denne teknik kan også udføres på både første og andet stadium larver. Dog skal man være opmærksom på fastsættelsen mindre dyr, som fluorescerende protein udtryk kan nemt blive afbrudt.

I fremgangsmåden vist her, beskriver vi en analyse af mosaik dyr med GFP udtrykt i enkelte luftrør celler. Men de samme teknikker kan anvendes til analyse af luftrøret celler under en number af eksperimentelle manipulationer. For eksempel, genekspression dyr, som er blevet ændret ved hjælp af molekylære metoder, gennem luftrør system eller i individuelle celler ved ekspression af RNAi transgener eller modificerede proteiner, kan også undersøges med denne fremgangsmåde. Non-genetiske behandlinger, som påvirker terminal celle udvikling, såsom narkotika eller hypoxi 2,14, kan også karakteriseres ved hjælp af disse metoder. I sidstnævnte tilfælde er det nødvendigt at starte med en Drosophila bestand konstitutivt udtrykker GFP eller andet fluorescerende protein i hele sit luftrør system for at visualisere forgrening mønstre. Gas-påfyldning kan undersøges uafhængigt af fluorescerende protein udtryk.

Her viser vi kun eksempler på ukodet (cytoplasmatisk lokaliseret) GFP bruges til mærkning af trakeal system. De metoder, der er beskrevet her, er også egnede til påvisning af andre native fluorescerende proteiner, såsom DsRed, samt fluorescerende proproteiner, som er blevet modificeret til at være lokaliseret til bestemte subcellulære strukturer. For eksempel actin: GFP eller tubulin: kan GFP-fusioner kan bruges til at visualisere luftrør cytoskeleton 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Gillian Stanfield for kommentarer til manuskriptet. TAJ er støttet af University of Utah Genetik Training Grant T32-GM007464 fra NIH NIGMS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Student Dumont #5 forceps Fine Scientific Tools 91150-20
Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) Leica MZ16
AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) Carl Zeiss Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE
100% Glycerol BioExpress M152-4L
Fly stock Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A
Fly stock Genotype: y w FRT19A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manning, G., Krasnow, M. A. Development of the Drosophila Tracheal System. The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).
  2. Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF. Cell. 99 (2), 211-220 (1999).
  3. Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis. Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).
  4. Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation. PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).
  5. Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system. PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).
  6. Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila. Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).
  7. Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth. Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).
  8. Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization. Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).
  9. Jones, T. A., Metzstein, M. M. A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster. Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).
  10. Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).
  11. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  12. Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila. Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).
  13. Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
  14. Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting. Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).

Tags

Developmental Biology Genetik Molekylærbiologisk Institut cellebiologi biokemi biofysik bioteknologi cellestrukturer epitelceller Mikroskopi fasekontrastmikroskopi fluorescensmikroskopi genetik (dyr og planter) dyr biologi dyremodeller åndedrætssystemet luftrør terminal celle intakt dyr larver cellemorfologi Drosophila fluorescens forgrening lumen frugt flue dyremodel
Undersøgelse af<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver luftrør Terminal Cells ved lysmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jones, T. A., Metzstein, M. M.… More

Jones, T. A., Metzstein, M. M. Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy. J. Vis. Exp. (77), e50496, doi:10.3791/50496 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter