Summary
Burada, trakea terminali hücrelerinin ışık mikroskobu analizinde için bir yöntem mevcut
Abstract
Hücre şekli hücre fonksiyonu için önemlidir. Ancak, hücre morfolojisi önemi rağmen, biraz tek tek hücrelerin belirli şekiller oluşturmak konusunda bilinmektedir. Drosophila trakea terminali hücreleri hücresel morfoloji üretmek için gerekli genlerin rolleri belirlemek ve aydınlatmak için güçlü bir genetik model haline gelmiştir. Terminal hücreleri, kollara ayrılmış boru şebekesinin bir parçası, iç dokulara oksijen sağlamak için işlevler, trakeal sistemi vardır. Terminal hücreler iki ayrı cep mimarileri sahip olarak hücre şekli soruları araştırmak için mükemmel bir model vardır. İlk olarak, Terminal hücreleri karmaşık nöron benzer ayrıntılı bir dallı morfolojisi, var, ikinci terminal hücre dalları ince tüpler olarak oluşan ve bir membrana bağlı hücre içi lümen içerirler. Terminal hücre şube sayısı, şube kuruluş ve bireysel şube şekli, kantitatif analiz belirli genetik mekanizma rolü hakkında bilgi vermek için kullanılabilirDallı bir hücrenin yapımında anisms. Bu hücrelerde tüp oluşumu analizi gibi omurgalı damar gibi diğer boru ağlara ortak tubulogenesis bir korunmuş mekanizmaları, ortaya çıkarabilir. Burada hızlı bir şekilde, görüntü düzeltmek için kullanılabilecek teknikler tarif ve Drosophila larvaları içinde hem dallanma desen ve terminal hücrelerde tüp oluşumu analiz. Bu teknikler, yabani tip ve mutant hayvanlar ya da genetik mozaik terminal hücreleri analiz etmek için kullanılabilir. Bu nedenle protokolün yüksek verimlilik, aynı zamanda iyi genetik, RNAi tabanlı veya Drosophila trakeal sisteminde ilaç ekranlar için uygundur.
Introduction
Hücre şekil bir organizma içinde, tek tek hücrelerin fonksiyonu için kritik yanı sıra hücreler, bir doku ya da organın bir parçası olarak işlev gördüğü. Dallanma ve tüp oluşumu (lumenogenesis): Biz hücresel morfoloji iki korunmuş tür kontrol katılmak moleküler mekanizmalarının araştırılması Drosophila trakeal terminali hücreleri, böcek solunum sisteminin bir bileşeni kullanın. Terminal hücreleri dallı tüpler bir ağın ucunda yer aldığını iç doku 1 oksijen teslim ve hedef dokularda 2 içinde yerel oksijen seviyesi ile kontrol edilir bir FGF sinyal yolu bağlıdır ayrıntılı bir dallı morfolojisi için çalışır. Terminal hücre dalları her şube ile çalışan gaz ile dolu bir hücre içi lümen ile, ince tüpler vardır. Genetik analiz Drosophila yapılabilir hangi kolaylığı ile birlikte terminali hücrelerin farklı hücresel mimarileri, bu hücreler, mükemmel bir model F yapmakya da, hücresel akıbet mekanizmaları araştıran dallanma, ve hücre içi tüp oluşumu. Terminal hücreleri dallı hücre farklılaşması, akıbet ve olgunlaşma 2-4 giden sinyal yollarının bazıları anlamak için yararlı bir model kanıtlamıştır. Bu sistem tarafsız kullanarak, hücre morfolojilerinden mutantlar için ileri genetik ekranlar hücre şekli 5,6 kontrol mekanizmaları içine anlayışlar verimli, yapılmıştır. Integrin-aracılı yapışma şube istikrar 8 için gerekli olduğunu,, örneğin, bu ekranlar belirli bir RabGAP lümen oluşumu ve konumlandırma 7 iskelet kutup ve vezikül ticareti için gerekli olduğunu ortaya koymuştur ve bu epitel PAR-kutup proteinler gerekli polarize membran ticareti düzenleyen dallanma ve lümen oluşumu 9 her ikisi için de. Terminal hücrelerinde Diğer çalışmalar, asimetrik aktin birikimi ve mikrotübül organizasyonu hücre uzaması ve lumenogenesis için gerekli olduğunu göstermiştir Burada, biz hızla terminali hücre dallanma ve lümen oluşumu analizi için sağlam üçüncü evre Drosophila larvaları düzeltmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, aynı zamanda birinci ve ikinci instar hayvanlar üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu tekniğin anahtarı genetik doğrudan sağlam hayvanların larva manikür floresan proteini ifade tarafından etiketli terminali hücreleri görselleştirmek için yeteneğidir. Bu işlem bu antikor boyama gibi sonrası tespit manipülasyonlar,, hücreleri gözlemlemek için gerekli olmadığından, iyi genetik ya da ilaç tarama dahil olmak üzere, yüksek verimlilik analizi için uygundur. Floresan proteini ifade sitoplazma dolu dalların yapı ortaya koymaktadır. Tüp oluşumu paralel çevreleyen sıvı-dolgu ile tezat gazlı lümen, tanımlamak için aydınlık mikroskobu kullanarak izlenebilired dokular. Bu protokole dahil başka etiketlenmemiş hayvanlar floresan ile etiketlenmiş proteinleri homozigoz mutant terminali hücreleri üretmek için MARCM sistemi 11 esas genetik mozaik üretmek için bir yöntemdir. Terminal hücreler sadece nispeten geç gelişiminde onların kompleks yapıların ayrıntılı çünkü bu, gereklidir; genetik mozaikler önceki gelişiminde diğer dokularda gen gereksinimleri bypass için izin verir. . MARCM klon oluşturmak için, trakea burada tanımlanan nefes nefese trakeal-özel bir sürücü (btl) 12 kullanılarak etiketli Drosophila X kromozomu için protokoldür, diğer kromozomlar için, benzer bir prosedür olan kromozom uygun genetik reaktifler ile, kullanılabilir incelenmiştir. Burada, trakea bir sitoplazma lokalize GFP ifade etiketli, ancak prosedür gibi DsRed gibi diğer floresan proteinleri, ifade eşit derecede iyi çalışır. Ayrıca, nöronal şube modelleri 13 tanımlamak için geliştirilen yöntemlere dayalı, Terminal hücrelerde dallanma desen ve lümen oluşumu ölçmek için bir yöntem dahil ettik. Nicel verilerin bu tür seçici kesin dallanma veya lumenogenesis sürecinde genlerin rolü, hem de farklı mutantlar 9 arasında doğrudan karşılaştırmalar için izin kritik olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mozaik Üretimi
- Genetik Çapraz
w FRT 19A küvet: Gal80 FLP 122 / Y, Pak-GAL4, UAS-GFP (erkek) X * incelenecek mutant temsil * FRT 19A / Bal (kadın),. Not: Bu hayvanların uygun arkadaşı için izin verdiği, önce deneme için en az bir gün çapraz kurun. - Ön yatıyordu: Transferi çapraz Ortama yerleştirilen yaş maya hamur küçük bir smear ile uçmak-gıda şişeleri için. 25 ° C'de 1 saat boyunca girebilmesine izin verir
- Lay: öncesi yatıyordu şişe Transfer hayvanların yaş maya hamur küçük bir smear ile yeni bir flakon. 25 ° C'de 6 saat boyunca girebilmesine izin verir
- Transferi yetişkin geri depolama ve sonraki deneylerde kullanılmak üzere şişe önceden bırakmaya. Hemen ısı şok bir dolaşan su banyosunda 38 ° C'de 45 dakika, için 0-6 saat eski embriyoları içeren yatıyordu flakon. Not: gıda yüzeyinin tamamını doğrulamak için, su seviyesinin altında olmalıdırEmbriyolar uygun ısı şokuna.
- Üçüncü dönem larva dolaşmaya başlayıncaya kadar 4-5 gün boyunca 25 ° C'de ısı şok şişeleri inkübe edin.
2. Mozaik Hayvanlar için ekran
- Ince forseps kullanarak yavaşça flakon taraftan dolaşıp üçüncü evre larvaları almak ve küçük bir plastik plaka soğutulmuş% 100 gliserol içine yerleştirin.
- Floresan optik ile donatılmış yüksek büyütme-diseksiyon mikroskobu kullanılarak larva inceleyin. Floresan etiketli trakeal hücrelerinin mozaik ifade ile larva tanımlayın. Tipik haliyle, bu 10-20X büyütme ile yapılabilir.
3. Isı Fixation
- Ince forseps kullanarak dikkatli bir 75x25x1 mm beyaz cam mikroskop lamı üzerine taze% 100 gliserol bir damla çanak ve yer mozaik hayvanlar ortaya çıkarmak. Not: birden fazla hayvan damla (Şekil 1A) yerleştirilebilir.
Hayvanlar ayrıca, doğrudan doğruya, bir lamel üzerine gliserol bir damla yerleştirilebilirhayvanların çok hızlı bir şekilde ısı ve aşırı sabit olabilir gibi ama bakım, sabitleme (adım 3.2) sırasında alınmalıdır. - Hayvanlar kadar 70 ° C ısı bloğu üzerine yerleştirin cam slayt sadece bir kapak kayma (Şekil 1B) için bir slayt, ve 10 saniye, en fazla 20 saniye hareket durdurmak. Hayvanlar ilk sıyrılmak olacak ama durdurmak ve sert ve uzun bir kez ölü olmak. Not: ısıya gereğinden fazla maruz kalma hem de GFP sinyal loş ve yaygın yapmak gibi terminali şube ve lümen zarar verir. Optimum verimlilik için bu mikroskoplar aynı odada ısı bloğu olması tavsiye edilir.
- Ince forseps kullanarak dikkatli bir şekilde yönlendirmek slayt tüm larvaları birbirine (Şekil 1C) paralel bulunmaktadır böyle tek yönde açılan tüm larvaları,.
- Yavaşça larva üst (veya bir cam slayt üzerine lamel ters) bir 18x18mm mikro cam kapak yerleştirin ve şekillendirme kabarcıklar (Şekil 1D) kaçının. Not: lamel tam olarak yalan değillarvaları üzerinde olabildiğince düz, bu bir sorun değildir.
- 30 dakika içinde görüntü larvaları. Isı sabit terminal hücreleri düşer ve GFP sinyal çok yaygın olacak.
4. Trakeal Terminal Hücre In vivo Görüntüleme
- Bir bileşik stereomikroskopta sahnede slayt yerleştirin. 5X amacı hayvanın sırt yüzeyi (Şekil 1F) üzerinde posterior anterior çalışan iki paralel dorsal gövdeleri bulun kullanma. Doğrudan iki dorsal gövdeleri arasındaki iki dorsal terminali hücreleri, bulun. Bu analiz için uygun segmentinde belirlemenize yardımcı olur.
- Bir kez odaklı, görüntü istenen terminali hücrelere hayvanlar döndürün. Bunu yapmak için, dikkatle forseps yavaşça lamel altında larvaları (Şekil 1E ve 1G) haddeleme, larvaların uzun eksenine dik olan kenarında lamel itin.
- Uygun Terminal hücrelerin seçilmesi tutarlı sonuçlar için önemlidirve mutantlar arasında karşılaştırmalar. Vücut yağ dalı (FB) terminali hücreleri kolayca orta hatta lateral dorsal gövde, bitişik bulunmaktadır. Yanal Grup G terminali hücreleri (LG) kolayca bulunabilir ve ventral orta hat (Şekil 1 H) sadece yanal yer almaktadır. Not: En ön (Tr1) ve posterior (TR10) segmentlerinde terminali hücrenin düzenleme diğer kesimlerinden farklı. Biz sadece segmentleri Tr2-TR9 terminal hücreleri analiz. Sırt terminali hücreleri diğer trakea terminali hücreleri daha kalıplaşmış dallanma desen var. Bu ek, olmayan hücre özerk sinyalleri bağlı olabilir ve analiz dahil etmek karar verirken bu düşünülmelidir.
- Ilgi bir terminal hücre tespit edildikten sonra, istenen büyütme kullanarak bir görüntü yakalamak, genellikle 10X veya 20X (Şekil 2A) en iyisidir. Not: Değişken dallanma desen nedeniyle, birçok şube ve mümkün olduğu kadar şube ipuçları içermektedir görüntü yakalamak için deneyin.
- Sahne hareket ettirmeden, floresan kapatın ve aynı hücre ve odak düzlemi (Şekil 2B) bir aydınlık görüntü yakalamak için iletilen ışık açın. Lümen koyu terminal hücre alanı içinde zıt olarak görünür olacaktır. Terminal hücre şube ve lümen ölçmek planlıyor ise, her bir terminal hücrenin birden fazla odak düzlemleri birden fazla resim toplamak.
5. ImageJ kullanarak Terminal Hücre morfolojisi analizi ve miktar tayini
- ImageJ (kullanarak floresan ve aydınlık görüntüleri açın http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) NeuronJ plug-in ( http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ ).
- "Ekle iz" aracını kullanarak el ile tüm terminali hücrenin şube ve lümen iz.
- "Etiket iz" aracını kullanarak, yeniden adlandırma ve riz belirli bir atama içinde her satırı atamak ecolor.
- "İlgili parametreler" seçeneğini kullanarak, 6-10 piksel Çizgi genişliğini ayarlamak (bileşik mikroskop bağlı dijital kameradan elde edilen 512x512 görüntüler için. Yüksek veya daha düşük çözünürlüklü kameralar için, piksel genişliği uygun ölçeklenebilir olmalıdır), tüm kullanarak diğer varsayılan ayarları, ve "Tamam" seçin. Sonra bir görüntü çekmek için "anlık olun" aracını kullanın. Seçin, orijinal ile yan yana gösterilebilir iz bir anlık almak için "iz çizin".
- "Ölçü iz" aracını seçin ve izleme tipi (ölçmek için şube adım 5.3 'de atanan belirli belirtme dayalı yani) seçin. Sonra, "RUN" tıklayın ardından "izleme ölçümleri göster" ve "Clear önceki ölçümleri". Bu ad, etiket, uzunluğu (piksel) ve görüntü için diğer verileri içeren bir tablo üretecek. Bu veriler daha sonra daha ileri istatistiksel bir Microsoft Excel elektronik tablosu olarak kaydedilebiliranalizi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sonuçlar Şekil 2'de gösterilmiştir. Ve şube her geçen gaz ile dolu bir hücre içi lümen (aydınlık mikroskobu ile görüntülendi, B); Tek bir yan grubu (LG) Terminal hücre geniş hücre içi dallanma (A GFP ile görünür) gösterir. Bu görüntüler, bölüm 1 ve 2'de tarif edilen MARCM sistemi kullanılarak oluşturulan bir mozaik L3 larva toplandı ve ısı sabit ve görüntülü olarak bölüm 3 ve 4 'te tarif edilmiştir. Paneller C & D A & B Paneller gösterilen görüntülerin sırasıyla şube olarak bölüm 5'te tanımlanmış bir NeuronJ oluşturulan iz, ve lümen göstermek E & F bir larva vücut yağ (FB) şube yerini göstermek Bölüm 3 ve 4 de tarif edildiği gibi görüntüleme için hazırlanmıştır. Bu örnekte, hayvanın bir mozaik değildir, ve GFP tüm trakeal sisteminde ifade edilir unutmayın. Paneller G ve H çok uzun bir süre için sabit ısı bir GFP etiketli terminali hücre bir örnek göstermektedir. GFP dalı, (G) yayılırs bozuldu ve lümen bölümlerini gaz artık doldurulur, böylece aydınlık görüntü tatili gibi görünen.
Şekil 1. Terminal hücre Larva hazırlanması ve kimlik. Bir cam slayt üzerinde% 100 gliserol bir damla (A) Yer larva. (B) Çoklu larvaları ısı sabitleme için yerleştirilebilir. (C) ısı sabitleme sonra, birbirine paralel larva düzenlemek ve dik slayt uzun eksenine. (D) larvaları üzerinde yeri cam kapak. (E) dikkatle hayvanlar rulo forseps ile cam kapak itin, larva reorient için. (F) GFP ile Yabani tip Üçüncü dönem larva boyunca ifade trakeal sistemi. Eşleştirilmiş dorsal gövdeleri (DT) inci üzerinde görülebilire sırt tarafında. (G) ventral yüzü haddeleme tekniği sonra aynı larva şimdi yukarı bakacak. iki üçüncü evre trakea hemisegments (bir hemisegment gri vurgulanır) yanal görüş (H) Diyagram. Circles yan grubu (LG) ve vücut yağ (FB) biz kantitatif için kullanmak terminali hücreleri gösterir. Kesikli çizgiler rutin ölçmek yok trakeal sisteminin diğer dalları temsil eder. Bir larva segmentinde trakea şube tam açıklaması için, Ref 1'e bakınız.
Şekil 2. Temsilcisi görüntüleri. (AD) Mozaik L3 larvaları MARCM tekniği (Bölüm 1) kullanılarak oluşturulur ve sabit ve bölümleri 2-4 protokolü kullanılarak görüntülendi. Tek bir LG terminali hücre wa dallanma desenis GFP (A) mozaik ifade ile görünür, gaz-dolu lümen aydınlık mikroskobu (B) ile görüntülendi. (C) NeuronJ (Bölüm 5) kullanılarak oluşturulan bir hücreyi, en dallanma desen izleme. (D) NeuronJ (protokol bölüm 5) kullanılarak oluşturulan B hücre gaz dolu lümen arasında Takip. (E, F) bir vücut yağ (FB) terminali hücre (kırmızı daire ile vurgulanan) bölümleri 2-4 protokol tarafından hazırlanan larva trakeal sistemi (E) ve aydınlık mikroskobu (F) boyunca GFP ifade tarafından görüntülendi. Örnek çok uzun bir süre boyunca ısıtıldığı zaman elde edilen sabitleme eserleri (G, H) Örnek. GFP yaygın ve küçük dalları (G) bozulmuş var. Lümen alanları da artık (H ok) hava dolu görünür. Ölçek çubuğu: 100 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan ısı sabitleme tekniği görüntüleme Drosophila larva trakeal terminali hücreleri için hızlı ve kullanışlı bir araçtır. Burada, dallanma ve yabani tip hücrelerin lümen desen incelemek için bu tekniği kullanın. Nefes nefese trakeal özel organizatörü tarafından tahrik GFP, ifade Trakeal hücreleri ısı sabitleme sonra larva manikür ile kolayca görüntülenebilir. Hem de hava dolu lümeninin gibi tek tek terminal hücreler, belirli bir desen dallanma hızlı bir şekilde görüntülenmiştir ve bu yöntemi kullanarak ölçülebilir. Bu teknik aynı zamanda birinci ve ikinci instar larvaları üzerinde gerçekleştirilebilir. Ancak, bakım floresan proteini ifadesi olarak, küçük hayvanlar sabitleme alınmalıdır kolaylıkla bozulabilmektedir.
Burada gösterilen yöntemde, böylece tek bir nefes borusu hücreleri olarak ifade GFP ile mozaik hayvanların bir analiz tarif eder. Bununla birlikte, aynı teknikler numbe altında nefes borusu hücreleri analizi için de geçerlidirdeneysel manipülasyonlar r. Örneğin, hayvanlarda hangi gen ekspresyonu, RNAi transgenlerin veya değiştirilmiş proteinlerin ekspresyonu ile trakeal sistemi boyunca ya da ayrı ayrı hücrelerde moleküler yaklaşımlar ile değiştirilmiş olan, aynı zamanda bu yaklaşım ile incelenebilir. Bu tür ilaçlar veya hipoksi 2,14 gibi N-terminali hücre gelişimini etkileyen genetik olmayan tedaviler, aynı zamanda, bu yöntemler kullanılarak karakterize edilebilir. Bu son durumda, bir Drosophila stok yapısal desen dallanma görselleştirmek için kendi trakeal sistem boyunca GFP veya başka bir floresan proteini ifade ile başlamak gereklidir. Gaz doldurma floresan protein ifadesinin bağımsız olarak kontrol edilebilir.
Burada, biz sadece trakeal sistemi etiketlemek için kullanılan etiketsiz (sitoplazma yerelleştirilmiş) GFP örneklerini göstermektedir. Ancak, burada açıklanan yöntemler, DsRed diğer yerel floresan proteinleri, hem de profesyonel floresan tespit edilmesi için de uygundurmodifiye edilmiş proteinlerin spesifik hücre içi yapılara lokalize edilmesi. Örneğin, aktin: GFP veya tübülin: GFP füzyon trakeal iskeletinin 10 görselleştirmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Biz el yazması yapılan yorumlar için Gillian Stanfield teşekkür ederim. TAJ NIH NIGMS Utah Genetik Eğitim Grant T32-GM007464 Üniversitesi tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
References
- Manning, G., Krasnow, M. A.
- Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF. Cell. 99 (2), 211-220 (1999).
- Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis. Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).
- Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation. PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).
- Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system. PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).
- Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila. Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).
- Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth. Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).
- Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization. Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).
- Jones, T. A., Metzstein, M. M. A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster. Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).
- Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila. Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).
- Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting. Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).
