Undersökning av Published: July 9, 2013 doi: 10.3791/50496

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Tiffani A Jones¹, Mark M. Metzstein¹

¹Department of Human Genetics, University of Utah

Summary

Här presenterar vi en metod för ljusmikroskop analys av luftstrupen terminal celler i

Abstract

Cell form är kritisk för cellfunktion. Trots vikten av cellens morfologi, är lite känt om hur enskilda celler skapar specifika former. Drosophila luftrör terminal celler har blivit en kraftfull genetisk modell för att identifiera och belysa de roller gener som krävs för att generera cellulära morfologier. Terminal-celler är en del av en grenad rörformigt nät, trakeal system som fungerar för att tillföra syre till inre vävnader. Terminal celler är en utmärkt modell för att undersöka frågor av cellform som de besitter två distinkta cellulära arkitekturer. Först, terminal-celler har en utarbetad förgrenad morfologi, liknande komplexa neuroner, för det andra är terminala cell grenar formade som tunna rör och innehåller en membranbundna intracellulära lumen. Kvantitativ analys av terminal cell gren nummer, branschorganisation och individuell gren form, kan användas för att ge information om vilken roll specifika genetiska mechnismer i skapandet av en förgrenad cell. Analys av rörbildning i dessa celler kan avslöja konserverade mekanismer för tubulogenesis gemensamma för andra rörformiga nät, såsom ryggradsdjuret vaskulaturen. Här beskriver vi metoder som kan användas för att snabbt fixa, bild, och analysera både förgrening mönster och rörbildning i terminal celler i Drosophila larver. Dessa tekniker kan användas för att analysera terminala celler i vildtyp och mutanta djur, eller genetiska mosaiker. På grund av den höga effektiviteten i detta protokoll, är det också väl lämpad för genetisk, RNAi-baserade, eller skärmar drog i Drosophila trakeal systemet.

Introduction

Cell form är avgörande för funktionen hos individuella celler inom en organism, liksom även celler som fungerar som en del av en vävnad eller ett organ. Vi använder Drosophila luftrör terminal celler, en komponent av insekten andningsorganen, för att undersöka de molekylära mekanismer som deltar i styrning av två bevarade typer av cellulär morfologi: förgrening och rörbildning (lumenogenesis). Terminal celler är placerade på spetsarna av ett nätverk av förgrenade rör som fungerar för att leverera syre till inre vävnader ¹ och har en utarbetad grenade morfologi som beror på en FGF signalväg som styrs av lokala syrenivåer inom målvävnader ^2. Terminal cell grenar är tunna rör, med en gasfylld subcellulära lumen som löper genom varje gren. De distinkta cellulära arkitekturer av terminal-celler, tillsammans med den lätthet med vilken genetisk analys kan utföras i Drosophila, gör dessa celler en utmärkt modell feller undersöka mekanismer för cellulär utväxt, förgrening, och intracellulär rörbildning. Terminal celler har visat sig vara en användbar modell för att förstå några av de signalvägar som leder till förgrenad cell differentiering, utväxt, och mognad ^2-4. Med detta system objektiv, har framåt genetiska skärmar för mutanter cell morphogenesis utförts, vilket ger insikter i mekanismer som styr cellens form ^5,6. Till exempel har dessa skärmar avslöjade att en specifik RabGAP krävs för cytoskelettala polaritet och vesikel handel med lumen bildning och positionering ^7, att integrin-medierad adhesion krävs för gren stabilitet ^8, och att epiteliala PAR-polaritet proteinerna reglerar polariserad membran trafficking krävs för både förgrening och lumen formation ^9. Andra studier i terminal celler har visat att asymmetrisk aktin anhopning och mikrotubuli organisation krävs för cellförlängning och lumenogenesis

Här beskriver vi en metod för att snabbt fastställa intakt tredje instar Drosophila larver för analys av terminal cell förgrening och lumen formation. Detta protokoll kan också utföras på både första och andra instar djur. Nyckeln till denna teknik är förmågan att visualisera terminala celler som är genetiskt märkta av fluorescerande protein expression direkt genom larver nagelband av intakta djur. Eftersom detta förfarande inte kräver några post-fixering manipulationer, såsom antikroppar färgning, för att observera cellerna, det är väl lämpad för hög genomströmning analys, inklusive genetisk eller drog screening. Fluorescerande proteinuttryck avslöjar strukturen för cytoplasmatiskt-fyllda grenar. Tube formation kan övervakas parallellt med användning brightfield mikroskop för att hitta den gasfyllda lumen, som kontrasterar med den omgivande fluiden-filled vävnader.

Inkluderat i detta protokoll är metoden för att generera genetiska mosaiker baserade på MARCM systemet ^11, för att producera homozygota mutanta terminala celler märkta med fluorescerande proteiner i annars omärkta djur. Detta är nödvändigt, eftersom terminal celler endast utarbeta sina komplexa strukturer relativt sent i utvecklingen, genetiska mosaiker möjliggör förbikoppling av genen krav i andra vävnader tidigare i utvecklingen. . Att generera marcm kloner, är luftstrupe märkta med trakeal-drivrutin andfådd (BTL) ¹² Beskrivs här är protokollet för Drosophila X-kromosom, för andra kromosomer, kan ett liknande förfarande användas, med genetiska reagens lämpligt till kromosomen är undersökas. Här används luftstrupe märkt genom uttryck av en cytoplasmatiskt lokaliserad GFP, men förfarandet fungerar lika bra med uttrycket av andra fluorescerande proteiner, såsom DsRed.

Dessutom har vi inkluderat en metod för att kvantifiera förgrening mönster och lumen bildning i terminal celler, bygger på metoder som utvecklats för att karakterisera neuronala gren mönster ^13. Denna typ av kvantitativa data kan vara avgörande för kräsna den exakta rollen av gener i förgreningen eller lumenogenesis process, samt möjliggör direkta jämförelser mellan olika mutanter ^9.

Protocol

Ett. Mosaik Generation

1. Genetisk Cross
   w FRT ^19A tub: GAL80 FLP ¹²² / Y, Btl-GAL4, UAS-GFP (hanar) X * FRT ^19A / Bal (honor), där * representerar den mutanten som skall undersökas. Obs: Ställ in passerar minst en dag före experimentet, eftersom detta gör att djuren att para lämpligt.
2. Pre-lay: Transfer kors att flyga-mat injektionsflaskor med en liten smutsfläck färsk jäst pasta placeras på mediet. Tillåt att lägga under 1 timme vid 25 ° C.
3. Lay: Överför djur från pre-lägga flaskan till en ny flaska med en liten smutsfläck färsk jäst pasta. Tillåt att lägga under 6 h vid 25 ° C.
4. Överför vuxna tillbaka till pre-lägga flaskan för lagring och användning i efterföljande experiment. Omedelbart värmechock lay flaska innehållande 0-6 h gamla embryon i 45 min vid 38 ° C, i ett cirkulerande vattenbad. Anm: Ytan på maten bör vara under vattennivån för att kontrollera allaembryon värma lämpligt chockade.
5. Inkubera värmechockas flaskor vid 25 ° C under 4-5 dagar tills tredje instar larver börja vandra.

2. Skärm för Mosaic Djur

1. Med fin pincett försiktigt plocka vandrande tredje stadiet larver från sidorna av flaskan och placera dem i kyld 100% glycerol i en liten plastplatta.
2. Undersök larver med hjälp av en hög förstoring-dissekera mikroskop utrustat med fluorescerande optik. Identifiera larver med mosaik uttryck av fluorescerande celler i luftstrupen. Typiskt kan detta göras vid 10-20X förstoring.

Tre. Heat Fixering

1. Med fin pincett försiktigt plocka mosaik djur ur skålen och häll i en droppe av färsk 100% glycerol på 75x25x1 mm vitt glas objektglas. Obs: flera djur kan placeras i drop (Figur 1A).
   Djur kan också placeras i en droppe glycerol direkt på ett täckglas,men man måste vara försiktig vid fixering (steg 3.2), eftersom djuren värmer mycket snabbt och kan bli över-fixerad.
2. Placera glasskiva på 70 ° C värme blocket tills djuren stannar bara flytta, inte mer än 20 sekunder för en bild, och 10 sek för ett täckglas (Figur 1B). Djur kommer slingra initialt men stanna upp och blir stela och avlånga gång dött. Obs: lång exponering för värme skadar terminala grenar och lumen samt göra GFP signalen dim och diffus. För optimal effektivitet är det rekommenderat att ha värmen blocket i samma rum som mikroskop.
3. Med fin pincett noggrant orientera alla larver i droppen i en enda riktning, så att alla larver på objektglaset är orienterade parallellt med varandra (Figur 1C).
4. Placera försiktigt en 18x18mm mikro skyddsglas ovanpå larver (eller invertera täckglas på en glasskiva) och undvika bildande bubblor (figur 1D). Obs: täckglas får inte ligga exaktplant över larver, är detta inte ett problem.
5. Bild larver inom 30 min. Heat fast terminal celler bryts ner och GFP-signalen kommer att bli mycket diffus.

4. In vivo avbildning av Trakealtuber Terminal Cells

1. Placera bilden på scenen av en förening stereomikroskop. Med hjälp av en 5X objektiv lokalisera de två parallella dorsala trunkar som löper från anterior till posterior på den dorsala ytan av djuret (figur 1F). Lokalisera de två dorsala terminala celler, direkt mellan de två dorsala stammar. Detta hjälper till att identifiera lämpligt segment för analys.
2. När orienterade, rotera djuren till bilden önskade terminal celler. För att göra detta, tryck försiktigt täckglas på kanten med pincett vinkelrätt mot den långa axeln av larverna, sakta rulla larverna under täckglas (figur 1E och 1G).
3. Välja lämpliga terminala celler är avgörande för konsekventa resultatoch jämförelser mellan mutanter. Fettet kroppen filial (FB) terminala celler är lätt att hitta intill rygg bålen, sidled med mittlinjen. De laterala grupp G terminal celler (LG) är lätt att hitta och ligger precis sidled av den ventrala mittlinjen (figur 1H). Anm: i de mest anterior (Tr1) och bakre (TR10) segment arrangemanget av terminalen cell är divergent från andra segment. Vi analyserar endast terminala celler i segment Tr2-TR9. Dorsal terminala celler har en mer stereotypt förgrening mönster än andra trakeala terminala celler. Detta kan bero på ytterligare, icke-cell autonoma signaler, och detta bör beaktas vid beslut om att inkludera dem i analysen.
4. När en terminal cell av intresse har identifierats, ta en bild med önskad förstoring, typiskt 10X eller 20X är bäst (Figur 2A). Obs: På grund av varierande förgrening mönster, försöka fånga bilder med så många grenar och tips filial som möjligt.
5. Utan att flytta scenen, stäng av fluorescens och slå på den överförda ljuset att fånga en brightfield bild av samma cell och fokalplan (Figur 2B). Den lumen kommer att visualiseras som mörkt kontrasterande i terminalen cellutrymme. Om planerar att kvantifiera grenar terminal cell och lumen, samla flera bilder i flera fokalplan hos varje terminal cell.

Fem. Analys och kvantifiering av Terminal cellmorfologin Använda ImageJ

1. Öppna de fluorescerande och ljusfält bilder med ImageJ ( http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) plug-in NeuronJ ( http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ ).
2. Använda "Add spårningar" verktyget manuellt spåra grenar och lumen av hela terminalen cellen.
3. Använda "Label tracings" verktyg, byta namn och reColor att tilldela varje rad i spåret en särskild beteckning.
4. Använda "Set parametrarna" verktyg, justera linjebredd 6-10 pixlar (för 512x512 bilderna från digitalkameran ansluts till det sammansatta mikroskopet. För högre eller lägre upplösning kameror, bör pixelbredd skalas lämpligt), med hjälp av alla andra standardinställningar och välj "OK". Använd sedan "Gör ögonblicksbild" verktyg för att ta en bild. Välj "Rita spår" för att få en ögonblicksbild av spår som kan visas sida vid sida med originalet.
5. Välj "Mät tracings" verktyget och välj spåra typ (dvs. vilka grenar att mäta utifrån de specifika beteckningar som tilldelats i steg 5.3). Nästa, välj "Display spåra mätningar" och "Rensa tidigare mätningar" klicka sedan på "RUN". Detta kommer att producera ett kalkylblad som innehåller namn, etikett, längd (i pixlar), och andra data för bilden. Dessa data kan sedan sparas som ett Microsoft Excel-kalkylblad för vidare statistiskanalys.

Representative Results

Resultaten visas i figur 2. En enskild sido-grupp (LG) terminal cell visar omfattande subcellulär förgrening (visualiseras genom GFP, A) och en gasfylld subcellulära lumen löper genom varje gren (visualiseras genom brightfield mikroskopi, B). Dessa bilder togs från en mosaik L3 larv, skapas med hjälp av MARCM system som beskrivs i avsnitt 1 och 2, och värme fast och avbildas, som beskrivs i avsnitt 3 och 4. Paneler C & D visar en NeuronJ genererade spår, som beskrivs i avsnitt 5, i grenarna och lumen respektive av de bilder som visas i A & B. Paneler E & F visar placeringen av fett kroppen (FB) filial i en larv förberedd för avbildning som beskrivs i avsnitt 3 och 4. Notera att i detta exempel, är djuret inte en mosaik, och GFP uttrycks genom hela trakeal systemet. Paneler G och H visar ett exempel på en GFP-märkt terminal cell som var värme fastställts för en alltför lång tid. GFP är diffus (G), branches har brutit ner och delar av lumen är inte längre gasfyllda, vilket uppträder som avbrott i brightfield bilden.

Figur 1. Larver förberedelse och identifiering av terminal celler. (A) Placera larv i en droppe av 100% glycerol på en glasskiva. (B) Flera larver kan placeras för värmefixering. (C) Efter värmefixering, organisera larver parallellt med varandra och vinkelrätt mot den långa axeln av bilden. (D) Placera täckglas över larver. (E) För att omorientera larver, tryck försiktigt täckglas med pincett för att rulla djuren. (F) Vild-typ tredje stadiet larv med GFP uttrycktes under trakeal systemet. De parade rygg trunkar (DT) är synliga på the ryggsidan. (G) Samma larv efter rullande tekniken med den ventrala sidan vänd nu uppåt. (H) Diagram av lateral vy av två tredje-instar luftrör hemisegments (en hemisegment markeras i grått). Cirklarna anger lateral grupp (LG) och fett kroppen (FB) terminal celler som vi använder för kvantifiering. Streckade linjer representerar andra grenar av trakeal-systemet som vi inte rutinmässigt kvantifiera. För en fullständig beskrivning av de luftrör filialer i en larver segment, se Ref ^1.

Figur 2. Representativa bilder. (AD) var Mosaic L3 larver som genereras med hjälp av MARCM tekniken (avsnitt 1) och fast och avbildas med protokollet i avsnitten 2-4. Den förgrening mönster av en enda LG terminal cell was visualiseras genom mosaik uttryck av GFP (A), de gasfyllda hålrum visualiseras med brightfield mikroskopi (B). (C) Spårning av förgrening mönster av cellen i A, genereras med NeuronJ (avsnitt 5). (D) Spårning av gasfyllda hålrum i cellen i B, genererade med hjälp NeuronJ (protokoll avsnitt 5). (E, F) En fet kropp (FB) terminal cell (markerad med röd cirkel) visualiseras genom GFP uttryck i hela luftstrupen systemet (E) och brightfield mikroskopi (F) i en larv som utarbetats av protokollet i avsnitten 2-4. (G, H) Exempel på fixering artefakter erhållna när provet upphettas för en alltför lång period. GFP är diffus och små grenar ha degraderat (G). Områden i lumen också visas inte längre luftfyllda (pilen i H). Scale bar: 100 um.

Discussion

Värmen fixering teknik som beskrivs här är en snabb och praktiskt verktyg för att avbilda Drosophila larver luftrör terminal celler. Här använder vi denna teknik för att undersöka förgrening och lumen mönster av vildtypceller. Luftrör celler som uttrycker GFP, driven av luftrör promotor andfådd, kan lätt visualiseras genom larver nagelbanden efter värme fixering. De särskilda förgrening mönster av enskilda terminal celler, liksom de av luftfyllda hålrum, kan vara snabbt visualiseras och mätas med denna metod. Denna teknik kan också utföras på både första och andra instar larver. Emellertid måste man vid fastställandet mindre djur, som fluorescerande protein uttryck kan lätt störas.

I metoden som visas här, beskriver vi en analys av mosaik djur med GFP uttryck i enskilda celler i luftstrupen. Men samma tekniker är tillämpbara på analyser av celler i luftstrupen under ett number av experimentella manipulationer. Till exempel, djur hos vilka genuttryck har ändrats av molekylära metoder, hela trakeal systemet eller i enskilda celler genom uttryck av RNAi transgener eller modifierade proteiner, kan också undersökas med denna metod. Icke-genetiska behandlingar som påverkar utvecklingen terminal cell, såsom läkemedel eller hypoxi ^2,14, kan också karakteriseras med hjälp av dessa metoder. I dessa senare fall är det nödvändigt att börja med en Drosophila lager konstitutivt uttrycker GFP eller annan fluorescerande protein hela dess trakeal systemet för att visualisera förgrening mönster. Gas-fyllning kan prövas oberoende av fluorescerande protein uttryck.

Här visar vi bara exempel på otaggade (cytoplasmatiskt lokaliserad) GFP används för att märka trakeal systemet. Men de metoder som beskrivs här är också lämplig för detektering av andra inhemska fluorescerande proteiner, såsom DsRed samt fluorescerande proproteiner som har modifierats för att vara lokaliserade till specifika subcellulära strukturer. Exempelvis aktin: GFP eller tubulin: kan GFP-fusionerna användas för att visualisera den trakeala cytoskelettet ^10.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Student Dumont #5 forceps	Fine Scientific Tools	91150-20
Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent)	Leica	MZ16
AxioImager M1 compound microscope (or equivalent)	Carl Zeiss		Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE
100% Glycerol	BioExpress	M152-4L
Fly stock			Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A
Fly stock			Genotype: y w FRT19A