Summary
Hier präsentieren wir eine Methode für die Lichtmikroskopie Analyse der Luftröhre Terminal Zellen in
Abstract
Zellform ist entscheidend für die Zellfunktion. Doch trotz der Bedeutung der Morphologie der Zellen, ist wenig darüber, wie einzelne Zellen erzeugen spezifische Formen bekannt. Drosophila tracheal Terminal Zellen haben sich zu einem mächtigen genetisches Modell zu identifizieren und erläutern die Rolle von Genen benötigt zur Erzeugung von zellulären Morphologie. Terminal-Zellen sind eine Komponente eines verzweigten röhrenförmigen Netzes, die Tracheen, dass Sauerstoff zu liefern inneren Geweben dient. Terminal-Zellen sind ein hervorragendes Modell für die Untersuchung von Fragen der Zelle Form, wie sie zwei unterschiedliche zelluläre Architekturen besitzen. Zuerst müssen Klemme Zellen eine aufwendige verzweigten Morphologie ähnlich komplexen Neuronen, zweitens Endzelle Zweige als dünne Rohre ausgebildet und enthalten eine membrangebundene intrazellulären Lumen. Quantitative Analyse von Zell-Terminal Zweig-Nummer, Branchenverband und einzelne Zweig Form kann verwendet werden, um Informationen über die Rolle von spezifischen genetischen mech liefernnismen in der Herstellung eines verzweigten Zelle. Analyse tube formation in diesen Zellen zeigen konservierten Mechanismen Tubulogenese gemeinsam mit anderen rohrförmigen Netzwerke wie das Wirbeltier Gefäßsystem. Wir beschreiben Techniken, die verwendet werden, um schnell zu beheben, Bild werden kann und zu analysieren und sowohl Verzweigungsmustern tube formation in Terminal Zellen in Drosophila-Larven. Diese Techniken können verwendet werden, um Zellen Terminal in Wildtyp-und mutierten Tiere, oder genetische Mosaike zu analysieren. Aufgrund der hohen Effizienz des Protokolls ist es auch gut für genetische, RNAi-oder Drogen-Bildschirme in der Drosophila Tracheensystem geeignet.
Introduction
Zellform ist entscheidend für die Funktion der einzelnen Zellen in einem Organismus, sowie Zellen, die als Teil eines Gewebes oder Organs. Wir verwenden Drosophila tracheal Terminal-Zellen, eine Komponente des Insekts Atmungsorgane, um die molekularen Mechanismen, die bei der Kontrolle zwei konservierte Arten von zellulären Morphologie teilnehmen zu untersuchen: Verzweigung und tube formation (lumenogenesis). Terminal-Zellen an den Spitzen eines Netzes von verzweigten Rohren angeordnet ist, daß Funktionen, um Sauerstoff zu inneren Gewebe 1 zu liefern und eine aufwendige verzweigten Morphologie, die auf einer FGF Signalweg, der durch lokale Sauerstoffgehalt im Zielgewebe 2 gesteuert abhängt. Terminal-Zelle Zweige sind dünne Röhren, mit einem gasgefüllten subzellulären Lumen, die durch jeden Zweig. Die unterschiedlichen zellulären Architekturen Terminal Zellen zusammen mit der Leichtigkeit, mit der genetischen Analyse in Drosophila durchgeführt werden kann, um diese Zellen ein ausgezeichnetes Modell foder die Untersuchung der zellulären Mechanismen Auswuchs, Verzweigung und intrazellulären tube formation. Terminal-Zellen haben ein nützliches Modell für das Verständnis einige der Signalwege, die zu verzweigten Zelldifferenzierung, Auswuchs und Reifung 2-4 bewiesen. Mit diesem System unvoreingenommene, haben uns genetischen Screens für Zellmorphogenese Mutanten durchgeführt, wodurch Einblicke in Mechanismen, die Zellform 5,6. Zum Beispiel haben diese Bildschirme enthüllt, dass ein bestimmtes RabGAP für Zytoskelett Polarität und Vesikeltransport in Lumenbildung und Positionierung 7 erforderlich ist; dass Integrin-vermittelte Adhäsion für Zweig Stabilität 8 gefordert wird, und dass die epithelialen PAR-Proteine regulieren Polarität polarisierter Membran Menschenhandel erforderlich sowohl für Verzweigung und Lumenbildung 9. Andere Studien in Terminal Zellen haben gezeigt, dass asymmetrische Aktin Akkumulation und Organisation der Mikrotubuli für die Zell-Dehnung und lumenogenesis erforderlich Hier beschreiben wir ein Verfahren, um schnell beheben intakt dritten Larvenstadium Drosophila-Larven zur Analyse der Endzelle Verzweigung und Lumenbildung. Dieses Protokoll kann auch auf beide ersten und zweiten Larvenstadium Tieren durchgeführt. Der Schlüssel zu dieser Technik ist die Fähigkeit, Zellen, die gentechnisch Terminal durch fluoreszierende Protein-Expression direkt durch die Larvencuticula von intakten Tieren gekennzeichnet visualisieren. Da dieses Verfahren benötigt keine Postfixierung Manipulationen, wie z. B. Antikörper-Färbung, um die Zellen zu beobachten, ist es gut für das Hochdurchsatz-Analyse geeignet, einschließlich genetischer oder Wirkstoff-Screening. Fluorescent Protein-Expression zeigt die Struktur der zytoplasmatisch gefüllten Ästen. Rohr-Bildung kann in parallel mit Hellfeld den gasgefüllten Lumen, die mit der umgebenden Flüssigkeit zu füllen kontrastiert identifizieren überwacht werdened Gewebe. Inbegriffen in diesem Protokoll ist das Verfahren zur Erzeugung von genetischen Mosaiken an der MARCM System 11, um homozygote Mutante Terminal Zellen mit fluoreszierenden Proteinen in ansonsten unmarkierten Tieren markierten Produkten. Dies ist notwendig, da nur Zellen Terminal erarbeiten ihren komplexen Strukturen relativ spät in der Entwicklung; genetischen Mosaiken ermöglichen Bypass Gen Anforderungen in anderen Geweben früher in der Entwicklung. . Um MARCM Klone erzeugen, Luftröhre sind beschriftet mit der Tracheal-spezifische Treiber atemlos (BTL) 12 Beschrieben ist hier das Protokoll für die Drosophila X-Chromosom, bei anderen Chromosomen, ein ähnliches Verfahren verwendet, mit genetischen Reagenzien werden, die dem Chromosom ist untersucht. Hier werden Luftröhre durch Expression einer cytoplasmatisch lokalisierten GFP-markierten, aber das Verfahren funktioniert genauso gut mit der Expression anderer fluoreszierende Proteine wie DsRed. Darüber hinaus haben wir ein Verfahren zur Verzweigung Muster und Lumenbildung im Terminal Zellen quantifiziert, basierend auf Methoden zur Charakterisierung neuronalen Verzweigungsmustern 13 entwickelt enthalten. Diese Art von quantitativen Daten kann kritisch sein in der anspruchsvollen genaue Rolle von Genen bei der Verzweigung oder lumenogenesis Prozess, sowie die Möglichkeit für direkte Vergleiche zwischen verschiedenen Mutanten 9.
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Protocol
1. Mosaic-Generation
- Genetische Kreuz
w FRT 19A Badewanne: GAL80 FLP 122 / Y; BTL-GAL4, UAS-GFP (Männchen) X * FRT 19A / Bal (Frauen), wobei * für die Mutante untersucht werden. Hinweis: Richten Sie überqueren mindestens einen Tag vor dem Experiment, da dies ermöglicht Tiere angemessen zu paaren. - Pre-lay: Transfer Kreuz zu fliegen-Food-Fläschchen mit einem kleinen Abstrich frische Hefe Paste auf den Medien platziert. Man lässt 1 Stunde bei 25 ° C lag
- Lay: Transfer von Tieren vor der Verlegung in ein frisches Fläschchen Fläschchen mit einem kleinen Abstrich frische Hefe Paste. Lassen Sie für 6 Stunden bei 25 ° C lag
- Übertragen Erwachsenen zurück vor, lag Fläschchen für die Lagerung und den Einsatz in nachfolgenden Experimenten. Unmittelbar Hitzeschock die Laien Fläschchen mit 0-6 Stunden alte Embryonen für 45 min bei 38 ° C, in einem zirkulierenden Wasserbad. Hinweis: Die Oberfläche des Lebensmittels sollte unterhalb des Wasserspiegels, alle zu überprüfenEmbryonen werden entsprechend erwärmen schockiert.
- Inkubieren wärmegeschockt Fläschchen bei 25 ° C für 4-5 Tage bis zum dritten Larvenstadium beginnen zu wandern.
2. Schirm für Mosaic Tiere
- Mit feinen Pinzette vorsichtig holen wandernden dritten Larvenstadium von den Seiten des Fläschchens und legen Sie sie in ein gekühltes 100% Glycerin in einem kleinen Kunststoff-Platte.
- Untersuchen Larven mit einer hohen Vergrößerung-Binokular mit fluoreszierenden Optik ausgestattet. Identifizieren Larven mit Mosaik-Expression von fluoreszenzmarkierten trachealen Zellen. Typischerweise kann dies in 10-20-facher Vergrößerung durchgeführt werden.
3. Wärmefixierung
- Mit feinen Pinzette sorgfältig auswählen Mosaik Tiere aus der Schale und in einem Tropfen frisch 100% Glycerin auf einem 75x25x1 mm Weißglas Objektträger. Hinweis: mehrere Tiere können in der Dropdown (Abbildung 1A) platziert werden.
Tiere können auch in einem Tropfen Glycerin direkt auf einem Deckglas platziert werden,aber es muss während der Fixierung (Schritt 3.2) genommen werden, da die Tiere sehr schnell erwärmen wird und kann sich über-fixed. - Platz Glasträger auf 70 ° C Heizblock bis die Tiere einfach nicht mehr bewegen, nicht mehr als 20 Sekunden für eine Folie, und 10 sec für ein Deckglas (Abbildung 1B). Tiere zappeln zunächst aber stoppen und steif und längliche einmal tot ist. Hinweis: überlange Wärmeeinwirkung wird Endästen und Lumen sowie um das GFP-Signal schwach und diffus beschädigen. Für eine optimale Effizienz empfiehlt es sich, um die Wärme-Block im selben Raum wie die Mikroskope haben.
- Mit feinen Pinzette vorsichtig orientieren alle Larven im Drop in eine einzige Richtung, so dass alle Larven auf der Folie parallel zueinander (Fig. 1c).
- Sanft legen eine micro 18x18mm Deckglas auf der Oberseite der Larven (oder invertieren das Deckglas auf einen Glasträger) und Bildung von Blasen zu vermeiden (Abbildung 1D). Hinweis: Deckglas kann nicht genau liegenflach über Larven, ist dies kein Problem.
- Bild Larven innerhalb von 30 min. Wärme Festanschlusses Zellen abgebaut wird und GFP-Signal wird sehr diffus.
4. In vivo Imaging von Tracheal Terminal-Cells
- Legen Sie gleiten auf der Bühne einer Verbindung Stereomikroskop. Mit einem Ziel 5X lokalisieren die beiden parallelen Leitungen ausgeführt dorsal von anterior auf der dorsalen Fläche des Tieres (1F) posterior. Suchen Sie die beiden dorsalen Terminal Zellen, direkt zwischen den beiden dorsalen Stämme. Dies hilft bei der Identifizierung der entsprechenden Segment für die Analyse.
- Einmal ausgerichtet, drehen die Tiere Bild gewünschte Terminal Zellen. Um dies zu tun, sorgfältig schieben das Deckglas auf dem Rand mit der Zange senkrecht zur Längsachse der Larven, langsam rollen die Larven unter dem Deckglas (1E und 1G).
- Die Auswahl der richtigen Terminal Zellen ist entscheidend für konsistente Ergebnisseund Vergleiche zwischen den Mutanten. Die Fettkörper Zweig (FB) Terminalzellen sind leicht zu finden neben dem dorsalen Stamm, lateral der Mittellinie. Die seitlichen Gruppe G Terminal Zellen (LG) sind leicht zu finden und befindet sich nur lateral der ventralen Mittellinie (Abbildung 1H). Hinweis: in den vorderen (Tr1) und posterioren (Tr10) die Anordnung der Segmente Terminal Zelle ist abweichend von anderen Segmenten. Wir analysieren nur Terminal Zellen in Segmente Tr2-Tr9. Dorsal Terminal Zellen haben eine stereotype Verzweigungsmuster als andere tracheal Terminal Zellen. Dies kann auf zusätzliche, nicht-Zell-autonome Signale ab, und dies sollte bei der Entscheidung, ob sie in der Analyse erweitert werden.
- Sobald ein Terminal Zelle von Interesse identifiziert worden ist, ein Bild aufzunehmen mit der gewünschten Vergrößerung; typischerweise 10X oder 20X besten ist (Abbildung 2A). Hinweis: Aufgrund der variablen Verzweigung Muster, versuchen Sie, so viele Bilder, die Äste und Zweigspitzen wie möglich zu erfassen sind.
- Ohne sich zu bewegen auf die Bühne, schalten Sie die Fluoreszenz und schalten Sie den Durchlicht Hellfeld, ein Bild von der gleichen Zelle und Bildebene (2B) zu erfassen. Das Lumen wird man sich als dunkel abgesetzte innerhalb des Terminals Zellraum. Wenn die Planung auf quantifizieren Endzelle Filialen und Lumen, sammeln mehrere Bilder in verschiedenen Fokusebenen jedem Endgerät Zelle.
5. Analyse und Quantifizierung des Terminal Zellmorphologie mit ImageJ
- Öffnen Sie die Leuchtstoff-und Hellfeld Bilder mit dem ImageJ ( http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) Plug-in NeuronJ ( http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ ).
- Mit dem "Add-Kurs" Werkzeug manuell verfolgen die Zweige und das Lumen des gesamten Terminal Zelle.
- Mit dem "Label-Kurven"-Werkzeug, umbenennen und recolor um jede Zeile in der Spur eine spezifische Bezeichnung zuordnen.
- Mit dem "Set Parameter"-Werkzeug, stellen Sie die Linienbreite 6-10 Pixel (für 512x512 Bilder von der Digitalkamera mit dem zusammengesetzten Mikroskop erhalten. Für höhere oder niedrigere Auflösung Kameras, die Pixel-Breite sollte entsprechend skaliert werden), mit allen anderen Standardeinstellungen, und wählen Sie "OK". Dann nutzen Sie die "Make Momentaufnahme" Werkzeug, um ein Bild aufzunehmen. Wählen Sie "Zeichnen Spur", um eine Momentaufnahme der Spur, die Side-by-side gezeigt kann mit dem originalen werden erhalten.
- Wählen Sie das "Measure Kurven"-Werkzeug und wählen Sie das Tracing-Typ (dh, die Zweige zu messen über die spezifischen Bezeichnungen in Schritt 5.3 zugewiesen basierend). Als nächstes wählen Sie "Display Tracing Messungen" und "Clear früheren Messungen", dann auf "Ausführen". Dies erzeugt eine Tabelle, die den Namen, Label, Länge (in Pixeln) und andere Daten für das Bild enthält. Diese Daten können dann als Microsoft Excel-Tabelle zur weiteren statistischen gespeichert werdenAnalyse.
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Representative Results
Die Ergebnisse sind in Abbildung 2 dargestellt. Eine einzelne seitliche Gruppe (LG) Endzelle umfaßende subzellulären Verzweigung (visualisiert GFP, A) und einem gasgefüllten subzellulären Lumen, die durch jeden der Zweige (visualisiert Hellfeld; B). Diese Bilder wurden von einem Mosaik L3 Larve gesammelt, unter Verwendung der MARCM System in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben, und Wärme fixiert und abgebildet wird, wie in den Abschnitten 3 und 4 beschrieben. Panels C & D zeigen eine NeuronJ erzeugten Spur, wie in Abschnitt 5 beschrieben, von den Zweigen und das Lumen bzw. der Bilder in A & B. Panels gezeigt E & F zeigen die Lage der fetten Körper (FB) Niederlassung in einer Larve vorbereitet für Bildgebung in den Abschnitten 3 und 4 beschrieben. Man beachte, dass in diesem Beispiel das Tier ein Mosaik und GFP wird während des gesamten Tracheensystem ausgedrückt. Panels G und H zeigen ein Beispiel eines GFP-markierten Terminal Zelle, die Wärme für eine zu lange Zeit fixiert war. GFP ist diffus (G), branches haben abgebaut und Teile der Lumen sind nicht mehr Gas gefüllt, so erscheinen als Brüche im Hellfeld Bild.
Abbildung 1. Larven Herstellung und Identifizierung von Terminal-Zellen. (A) Ort Larve in einem Tropfen 100% Glycerin, bezogen auf einen Objektträger. (B) Mehrere Larven für Hitzefixier platziert werden. (C) Nach der thermischen Fixierung anzuordnen Larven parallel zueinander und senkrecht zur Längsachse des Schiebers. (D) Ort Deckglas über Larven. (E) Zu umorientieren Larven vorsichtig schieben Deckglas mit einer Pinzette, um die Tiere zu rollen. (F) Wild-Typ dritten Larvenstadium mit GFP ganzen Ausdruck die Tracheen. Die gepaarten dorsal Stämme (DT) sind sichtbar auf the Rückenseite. (G) Das gleiche Larve nach dem Walzen-Technik mit der Bauchseite nach oben jetzt. (H) Schematische Darstellung der Seitenansicht von zwei dritten Larvenstadium tracheal hemisegments (ein hemisegment ist grau hinterlegt). Kreise zeigen laterale Gruppe (LG) und fetten Körper (FB) Terminal Zellen, die wir für die Quantifizierung. Gestrichelte Linien repräsentieren anderen Zweigen der Tracheen, die wir nicht routinemäßig zu quantifizieren. Für eine vollständige Beschreibung der Luftröhre Niederlassungen in einem Larvenstadium Segment zu Ref 1 beziehen.
Abbildung 2. Repräsentative Bilder. (AD) Mosaic L3 Larven wurden unter Verwendung des MARCM Technik (Abschnitt 1) und fixiert und abgebildet unter Verwendung des Protokolls in den Abschnitten 4.2. Die Verzweigung Muster von einem einzigen Terminal LG Zelle was visualisiert Mosaik Expression von GFP (A), die gasgefüllten Lumen visualisiert Hellfeld (B). (C) Tracing der Verzweigung der Zelle in A, unter Verwendung NeuronJ (Abschnitt 5). (D) Tracing der gasgefüllten Lumen der Zelle in B, unter Verwendung NeuronJ (Protokoll Abschnitt 5). (E, F) Ein fetter Körper (FB) Terminal Zelle (markiert durch den roten Kreis) visualisiert durch GFP-Expression während der Tracheen (E) und Hellfeldmikroskopie (F) in einer Larve durch das Protokoll in die Abschnitte 2-4 hergestellt. (G, H) Beispiel Fixierung Artefakte erhalten wird, wenn die Probe für einen zu langen Zeitraum erhitzt wird. GFP ist diffus und kleine Äste müssen abgebaut (G). Stadtteile von Lumen auch nicht mehr angezeigt luftgefüllten (Pfeil in H). Maßstab: 100 um.
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Discussion
Die Wärmefixierung hier beschriebene Technik ist eine schnelle und bequemes Werkzeug für Imaging Drosophila Larven tracheal Terminal Zellen. Hier verwenden wir diese Technik, um die Verzweigung und Lumen Muster von Wildtyp-Zellen zu untersuchen. Tracheal-Zellen, die GFP durch die Luftröhre Promotor atemlos angetrieben, können leicht sichtbar durch die Larvencuticula nach Wärmefixierung. Die spezifischen Verzweigungsmustern einzelnen Terminal-Zellen, sowie die von den mit Luft gefüllten Hohlraum, kann schnell visualisiert und unter Verwendung dieses Verfahrens. Diese Technik kann auch auf beide ersten und zweiten Larvenstadium durchgeführt werden. Allerdings muss darauf bei der Festsetzung kleineren Tieren entnommen werden, der als fluoreszierende Protein-Expression kann leicht gestört werden.
In der hier gezeigte Verfahren beschreiben wir eine Analyse der Mosaik-Tiere mit GFP in einzelnen trachealen Zellen exprimiert. Jedoch sind die gleichen Techniken für die Analyse von Zellen unter einem Trachealtubus number experimentelle Manipulationen. Zum Beispiel Tiere, bei denen die Genexpression durch molekularbiologische Ansätze geändert worden ist, in der Tracheen oder in einzelnen Zellen durch die Expression von RNAi Transgene oder modifizierte Proteine, kann auch mit diesem Ansatz untersucht werden. Nicht-genetische Behandlungen, die Terminal-Zell-Entwicklung, wie Drogen oder Hypoxie 2,14 beeinflussen, kann auch dadurch mit diesen Methoden werden. In diesen letzteren Fällen ist es notwendig, mit einer Drosophila stock konstitutiv GFP oder andere fluoreszierende Protein während seiner Tracheensystem um visualisieren Verzweigungsmuster starten. Gas-Füllung kann unabhängig von fluoreszierenden Protein-Expression untersucht werden.
Hier zeigen wir nur Beispiele untagged (zytoplasmatisch lokalisierten) GFP eingesetzt, um die Luftröhre etikettieren. Jedoch sind die hier beschriebenen Verfahren auch zum Nachweis anderer nativen fluoreszierende Proteine wie DsRed sowie fluoreszierende Proteine geeignetProteine, die modifiziert wurden, um spezifische subzelluläre Strukturen lokalisiert werden. Zum Beispiel Actin: GFP oder Tubulin: GFP-Fusionen können verwendet werden, um die Luftröhre Zytoskelett 10 zu visualisieren.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanzielles Interesse haben.
Acknowledgments
Wir danken Gillian Stanfield für Kommentare zum Manuskript. TAJ wird von der University of Utah Genetics Ausbildungsförderung T32-GM007464 von NIH NIGMS unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
References
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