Summary
여기, 우리는 기관 단자 세포의 광학 현미경 분석에 대한 방법을 제시
Abstract
세포의 모양은 세포 기능에 중요합니다. 그러나 세포 형태의 중요성에도 불구하고, 약간은 개별 세포가 특정 모양을 생성하는 방법에 대해 잘 알려져 있습니다. 초파리 기관 단자 세포는 세포의 형태학 생성에 필요한 유전자의 역할을 확인하고 해명 할 수있는 강력한 유전 적 모델이되고있다. 터미널 세포 분지 관 네트워크의 구성 요소, 내부 조직에 산소를 공급하는 기능하는 기관 시스템입니다. 터미널 세포들은이 두 가지 세포 구조를 가지고 같은 세포 형태의 질문 조사를위한 훌륭한 모델입니다. 첫째, 단말기 세포는 복잡한 신경 세포와 유사한 정교한 지형 형태를 가지고, 둘째, 단말기 세포의 가지 얇은 튜브로 형성 막 결합 세포 내강을 포함하고 있습니다. 터미널 셀 지점 번호, 지점 조직과 개인의 지사 형태의 정량 분석은 특정 유전자 기계화의 역할에 대한 정보를 제공하는 데 사용할 수 있습니다분기 셀의 제작에 anisms. 이러한 세포의 관 형성 분석은 척추 동물의 혈관과 같은 다른 관 네트워크에 공통 tubulogenesis의 보존 메커니즘을 밝힐 수 있습니다. 여기에서 우리는 빠르게 이미지를 수정하는 데 사용할 수있는 기술을 설명하고, 초파리 유충에서 모두 분기 패턴과 단말기 세포의 관 형성을 분석합니다. 이 기술은 야생형과 돌연변이 동물, 또는 유전 모자이크의 터미널 세포를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 때문에 프로토콜의 높은 효율, 그것은 또한뿐만 유전, RNAi의 기반 또는 초파리 기관 시스템의 마약 화면에 적합합니다.
Introduction
세포의 모양은 유기체 내의 개별 세포의 기능에 중요한뿐만 아니라, 세포 인 조직이나 기관의 일부로서 그 기능. 분기 및 튜브 형성 (lumenogenesis) : 우리는 세포 형태의 두 가지 보존 유형을 제어에 참여하는 분자 메커니즘을 조사하기 위해 초파리 기관 단자 세포, 곤충 호흡기 시스템의 구성 요소를 사용합니다. 터미널 세포는 분기 튜브 네트워크의 끝 위치되는 내부 조직 1에 산소를 전달하고 표적 조직 2에서 현지 산소 농도에 의해 제어되는 FGF 신호 전달 경로에 따라 정교한 지형 형태를 가지고하는 기능.에게 터미널 셀 분기 각 지점을 통해 실행 가스로 채워진 세포 내 루멘으로, 얇은 튜브입니다. 유전자 분석은 초파리에서 수행 할 수있는 용이성과 함께 단말기 세포의 독특한 세포 구조는,이 세포에게 훌륭한 모델 F을또는, 휴대 가지의 메커니즘을 조사 분기 및 세포 내 튜브를 형성합니다. 터미널 세포는 분기 세포 분화, 가지,과 성숙 2-4로 이어지는 신호 전달 경로의 일부를 이해하기위한 유용한 모델을 입증했다. 이 시스템은 공정한 사용하여, 세포 형태 형성의 돌연변이에 대한 앞으로 유전자 스크린은 세포의 모양 5,6를 제어 메커니즘에 대한 통찰력을 항복 수행되었다. 인테 매개 접착력을 가지 안정성 8을 위해 필요합니다; 예를 들어,이 화면은 특정 RabGAP가 루멘 형성과 포지셔닝 7 골격 극성 소포 인신 매매를 위해 필요하다는 것을 밝혀 그 상피 PAR 극성 단백질은 필요한 편광 막 인신 매매를 규제 분기 및 루멘 형성 9 모두. 단말기 세포에서 다른 연구는 비대칭 말라 축적과 미세 소관 조직 세포의 신장과 lumenogenesis 필요한 것으로 나타났습니다 여기, 우리는 신속하게 터미널 휴대 분기 및 루멘 형성의 분석을위한 본래 제 령 초파리의 애벌레를 해결하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 첫 번째와 두 번째 모두 탈피 동물에서 수행 할 수 있습니다. 이 기술의 핵심 유전자 직접 그대로 동물의 애벌레 표피를 통해 형광 단백질 식으로 표시되어 단자 세포를 시각화 할 수있는 기능입니다. 이 절차와 같은 항체 염색으로 사후 고정 조작은, 세포를 관찰 할 필요가 없기 때문에, 그것은 잘 유전자 또는 약물 검사를 포함하여, 높은 처리량 분석에 적합합니다. 형광 단백질의 발현은 cytoplasmically 채워진 가지의 구조를 보여준다. 관 형성은 병렬 주변의 유체은 - 채우기와 대조 가스 채워진 루멘을 식별하는 브라이트 현미경을 사용하여 모니터링 할 수 있습니다ED 조직. 이 프로토콜에 포함 달리 레이블이 동물에 형광 단백질로 표시된 동형 접합체 돌연변이 단자 세포를 생산하는 MARCM 시스템 11에 따라 유전 모자이크를 생성하는 방법입니다. 단말기 세포는 비교적 늦게 개발에서의 복잡한 구조를 정교 때문에 이것은 필요하다, 유전 모자이크 이전에 개발에 다른 조직의 유전자 요구 사항을 우회 할 수 있습니다. . MARCM 클론을 생성하는 기관이 여기에 설명 숨 기관 - 특정 드라이버 (BTL) 12를 사용하여 표시하는 것은 초파리의 X 염색체를위한 프로토콜이며, 다른 염색체에 대해 유사한 절차가되는 염색체에 적합한 유전자 시약과 함께 사용할 수 있습니다 하였다. 여기에, 기관은 cytoplasmically 지역화 된 GFP의 발현에 의해 표시되지만, 절차는는 DsRed 다른 형광 단백질의 발현과 동일하게 작동합니다. 또한, 우리는 신경 가지 패턴 13 특성화 개발 방법에 따라 단말기 세포에서 분기 패턴과 루멘 형성을 정량화하는 방법을 포함했다. 정량적 데이터의이 종류는 안목 정확한 분기 또는 lumenogenesis 과정에서 유전자의 역할뿐만 아니라, 다른 돌연변이 9 사이의 직접 비교를 허용에 중요 할 수 있습니다.
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Protocol
1. 모자이크 생성
- 유전 크로스
W FRT 19A 욕조 : GAL80 FLP 122 / Y, BTL-GAL4, UAS - GFP (남성) X *는 검사 할 돌연변이를 나타냅니다 * FRT 19A / 발 (여성). 참고 :이 동물들이 적절하게 짝짓기를 할 수로, 사전 실험 적어도 하루를 건너 설정합니다. - 사전 평신도 : 전송 크로스 미디어에 배치 신선한 효모 붙여 넣기의 작은 얼룩을 가진 비행 식품 유리 병에. 25 ℃에서 1 시간 동안 누워 허용
- 레이아웃 : 사전 누워 병에서 전송 동물을 신선한 효모 붙여 넣기의 작은 얼룩과 신선한 유리 병. 25 ℃에서 6 시간 동안 누워 허용
- 이전 성인은 다시 저장 및 다음 실험에 사용하기 위해 병을 사전에 배치합니다. 즉시 열 충격 순환 물 목욕 38 ° C에서 45 분, 대한 0-6 시간 이전 배아를 포함하는 평신도 병. 참고 : 음식의 표면은 모두를 확인하기 위해 물 수준 이하이어야한다배아는 적절한 충격을 열 수 있습니다.
- 세 번째 instar의 유충이 방황하기 시작 때까지 4 ~ 5 일 25 ° C에서 열 충격 튜브를 품어.
2. 모자이크 동물을위한 화면
- 미세 집게를 사용하여 부드럽게 병의 측면에서 방황하는 세 번째 instar의 유충을 선택하고 작은 플라스틱 접시에 냉장 100 % 글리세롤에 배치합니다.
- 형광 광학 탑재 한 고배율 해부 현미경을 사용하여 유충을 검사합니다. 찬란 분류 기관 세포의 모자이크 식으로 애벌레를 식별합니다. 일반적으로이 10-20X 배율에서 수행 할 수 있습니다.
3. 열 고정
- 미세 집게를 사용하여 조심스럽게 75x25x1 mm 흰색 유리 현미경 슬라이드에 신선한 100 % 글리세롤의 드롭 접시와 장소의 모자이크 동물을 선택하십시오. 참고 : 여러 동물 드롭 (그림 1A)에 배치 할 수 있습니다.
동물은 또한 직접 coverslip을에 글리세롤의 드롭 배치 할 수 있습니다동물이 매우 빠르게 열 것 이상 고정 될 수 있지만,주의, 고정 (단계 3.2) 동안주의해야합니다. - 동물까지 70 ° C 열 블록 위에 장소 유리 슬라이드은 커버 슬립 (그림 1B)에 대한 슬라이드, 10 초, 더 이상 20 초를 이동하지 중지합니다. 동물은 처음 몸부림되지만 중지하고 엄밀한 길게 한 번 죽은됩니다. 주 : 열까지 너무 긴 노출뿐만 아니라 GFP 신호가 희미하고 산만하게 같은 터미널 지점과 루멘 손상 될 수 있습니다. 최적의 효율성을 위해 그것을 현미경 같은 방에 열 블록을 가지고하는 것이 좋습니다.
- 미세 집게를 사용하여 조심스럽게 방향을 슬라이드에있는 모든 애벌레는 다른 (그림 1C)에 평행되는 등 한 방향에있는 드롭의 모든 애벌레.
- 부드럽게 애벌레의 상단 (또는 유리 슬라이드에 coverslip을 반전)에 18x18mm 마이크로 커버 유리를 배치하고 형성하는 거품을 (그림 1D)하지 마십시오. 참고 : coverslip을 정확하게 거짓말을하지 않을 수 있습니다유충에 평면이 문제가되지 않습니다.
- 30 분 안에 이미지 유충. 열 고정 터미널 세포가 저하되고 GFP 신호가 매우 확산 될 것입니다.
4. 기관 내 터미널 세포의 생체 내 이미징
- 복합 입체 현미경의 무대에 슬라이드를 놓습니다. 배 목적은 동물의 등쪽 표면 (그림 1 층)에서 후부 앞쪽에에서 실행되는 두 개의 병렬 지느러미 줄기를 찾아 사용. 직접 두 개의 지느러미 줄기 사이에 두 개의 지느러미 터미널 세포를 찾습니다. 이 분석을위한 적절한 세그먼트를 식별하는 데 도움이됩니다.
- 일단 지향, 이미지 원하는 단말기 세포에 동물을 돌립니다. 이 작업을 수행하려면 신중 집게 천천히 coverslip에 아래의 유충 (그림 1E 및 1G) 압연, 유충의 긴 축에 수직으로 가장자리에 coverslip을 밀어 넣습니다.
- 해당 단말기 셀을 선택하면 일관성있는 결과를 위해 중요합니다과 돌연변이 사이의 비교. 체지방 지점 (FB) 단자 세포는 쉽게 정중선 외측 등쪽 트렁크에 인접 발견된다. 측면 그룹 G 단자 세포 (LG)를 쉽게 찾을 수 있습니다 및 복부 정중선 (그림 1H)의 바로 옆에 위치하고 있습니다. 참고 : 대부분의 전방 (TR1)과 후방 (TR10) 세그먼트의 단자 세포의 배열이 다른 세그먼트에서 분기됩니다. 우리는 세그먼트 TR2-TR9에서 터미널 세포를 분석합니다. 등의 단말기 세포는 다른 기관 단자 세포보다 더 많은 박힌 분기 패턴이 있습니다. 이 추가 비 셀 자율적 인 신호에 따라 달라질 수 있습니다, 분석에 포함할지 여부를 결정할 때 고려되어야한다.
- 관심 단자 세포가 확인되면 원하는 배율을 사용하여 이미지를 캡처, 일반적으로 10 배 또는 20 배 (그림 2A) 최고입니다. 참고 : 변수 분기 패턴으로 인해, 많은 지점과 가능한 한 가지 팁을 포함 이미지를 캡처하려고.
- 스테이지를 이동하지 않고, 형광을 끄고 동일한 셀 및 초점면 (그림 2B)의 시야 이미지를 캡처하는 투과광의 전원을 켭니다. 루멘은 멍하니 단자 세포 공간에 대조로 보여 질 것입니다. 단말기 세포의 가지와 루멘의 양을 계획하는 경우, 각 터미널 셀의 다중 초점면에 여러 이미지를 수집합니다.
5. ImageJ에 사용 터미널 세포 형태의 분석 및 정량화
- ImageJ에 (사용하는 형광 및 명 시야 이미지를 열고 http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) NeuronJ 플러그인 ( http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/을 ).
- "추가 트레이싱"도구를 사용하여 수동으로 전체 단말기 세포의 가지와 루멘을 추적.
- "라벨 경시"도구를 사용하여, 이름 바꾸기 및 R추적 특정 지정 내의 각 행을 할당 할 ecolor.
- "파라미터 설정"도구를 사용하여 6-10 픽셀의 선 폭을 조정 (복합 현미경에 연결된 디지털 카메라에서 얻은 512x512 크기 이미지. 높거나 낮은 해상도의 카메라를 들어, 픽셀 너비가 적절히 조정되어야한다), 모두를 사용하여 다른 기본 설정 및 "OK"를 선택합니다. 다음 이미지를 촬영하기 위해 "스냅 샷 만들기"도구를 사용하십시오. 선택한 원본에 나란히 표시 할 수 있습니다 추적의 스냅 샷을 얻기 위해 "추적을 그립니다."
- "측정 표목"도구를 선택하고 추적 유형 (측정 지점 단계 5.3에서 할당 된 특정 지정에 따라 예)를 선택합니다. 다음, "실행"을 클릭하여 "추적 측정을 표시"하고 "지우기 이전 측정". 이 이름, 레이블, 길이 (픽셀), 이미지에 대한 다른 데이터를 포함하는 스프레드 시트를 생성합니다. 이 데이터는 또한 통계에 대한 Microsoft Excel 스프레드 시트로 저장할 수 있습니다분석.
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Representative Results
결과는 그림 2에 표시됩니다. 그리고 각 분기를 통해 실행 가스로 채워진 세포 내 루멘 (브라이트 현미경으로 시각, B) 하나의 측면 그룹 (LG) 단자 셀은 광범위한 세포 내 분기를 (GFP로 시각화)를 보여줍니다. 이러한 이미지는 섹션 1과 2에 설명 된 MARCM 시스템을 사용하여 생성, 모자이크 L3 유충에서 수집, 열은 고정 군데과 같은 섹션 3 및 4에 설명 하였다. 패널 C & D는 A & B. 패널에 표시된 이미지의 각각 분기 기준으로 5 장에서 설명 NeuronJ 생성 된 추적 및 루멘을 보여 E & F 애벌레 지방 몸 (FB) 지점의 위치를 보여줍니다 섹션 3 및 4에 설명 된대로 영상을 준비했습니다. 이 예에서, 동물 모자이크 아니며, GFP는 전체 기관 시스템을 통해 표현되어 있습니다. 패널 G와 H는 너무 긴 시간 동안 고정 열였다 GFP - 라벨 터미널 셀의 예를 보여줍니다. GFP는 BRANCHE, (G) 확산이다들로 세분화하고 루멘의 부분은 가스 더이상 가득 차 있으며, 따라서 브라이트 이미지의 중단으로 나타나는.
그림 1. 단말기 세포의 애벌레 준비 및 확인. 유리 슬라이드에 100 % 글리세롤 드롭 (A) 장소 유충. (B) 여러 유충이 열 고정을 위해 배치 될 수. (C) 열 고정 후, 서로 평행 유충을 구성 및 수직 슬라이드의 긴 축. (D) 유충에 놓으면 커버 유리. (E)주의 동물을 롤 집게와 커버 유리를 밀어 유충 방향을합니다. (F) GFP와 야생 타입의 세 번째 instar의 유충 전반에 걸쳐 표현 기관 시스템입니다. 쌍 지느러미 줄기 (DT)의 일에 볼 수 있습니다전자 등의 측면. (G) 복부 측면과 압연 기술 후 동일한 유충은 이제 위쪽을 향하도록. 두 번째 - 령 기관 hemisegments (한 hemisegment이 회색으로 강조 표시)의 측면 뷰 (H) 다이어그램입니다. 동그라미 측면 그룹 (LG)와 체지방 (FB) 우리는 정량에 사용 단말기 세포를 나타냅니다. 점선은 우리가 일상적으로 정량하지 않는 기관 시스템의 다른 지점을 나타냅니다. 애벌레 부문에서 기관 분기의 전체 설명은 참조 1을 참조하십시오.
그림 2. 대표 이미지. (AD) 모자이크 L3 유충은 MARCM 기술 (1 절)를 사용하여 생성 및 고정 섹션 2-4 프로토콜을 사용하여 몇 군데 있었다. 단일 LG 단말기 세포 워싱턴 분기 패턴들 GFP (A)의 모자이크 식으로 시각화, 가스 채워진 루멘 시야 현미경 (B)와 시각화. (C) NeuronJ을 (5 장)을 사용하여 생성에서 셀의 분기 패턴 추적. (D) NeuronJ을 (프로토콜 5 장)를 사용하여 생성 된 B 셀의 가스 채워진 루멘의 추적. (E, F) 체지방 (FB) 터미널 셀 (빨간색 원으로 강조) 섹션 2-4 프로토콜에 의해 제조 된 애벌레 기관 시스템 (E)와 브라이트 현미경 (F)를 통해 GFP 식으로 시각화. 샘플이 너무 오래 동안 가열 할 때 얻은 고정 아티팩트 (G, H) 예. GFP는 확산과 작은 가지 (G) 저하가 있습니다. 루멘의 영역도 더 이상 (H에서 화살표) 공기 채워진 표시되지 않습니다. 스케일 바 : 100 μm의.
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Discussion
여기에 설명 된 열 고정 기술은 이미징 Drosophila의 애벌레 기관 단자 세포에 대한 신속하고 편리한 도구입니다. 여기, 우리는 분기와 야생형 세포의 내강 패턴을 조사하기 위해이 기술을 사용합니다. 숨 기관 특이 적 프로모터에 의해 구동 GFP를, 표현 기관 세포는 열 고정 후 유충의 표피를 통해 쉽게 시각화 할 수 있습니다. 뿐만 아니라 공기 채워진 루멘의 그 같은 개별 단말기 세포의 특정 분기 패턴을 신속하게 시각화하고이 방법을 사용하여 측정 할 수 있습니다. 이 기술은 첫 번째와 두 번째 모두 instar의 유충에서 수행 할 수 있습니다. 그러나 치료는 형광 단백질의 표현으로, 작은 동물을 고정에주의해야 쉽게 중단 될 수 있습니다.
여기에 표시된 방법으로, 우리는 하나의 기관 세포에서 발현 GFP 모자이크 동물의 분석을 설명합니다. 그러나 동일한 기술 numbe를 아래 기관 세포의 분석에 적용실험 조작의 연구. 예를 들어, 동물있는 유전자 발현이의 RNAi 형질 전환 유전자 또는 수정 단백질의 발현에 의해 기관 시스템 전체 또는 개별 세포, 분자 방식으로 변경되었습니다 또한이 방법으로 검사 할 수 있습니다. 이러한 약물이나 저산소증 2,14으로 단말기 세포 발달에 영향을 미치는 비 - 유전자 치료는 이러한 방법을 사용하여 특성화 할 수 있습니다. 후자의 경우에, 그것은 초파리 재고가 구조적 패턴을 분기 시각화하기 위해 해당 기관 시스템을 통해 GFP 또는 다른 형광 단백질을 표현하는으로 시작하는 것이 필요하다. 가스 충전은 형광 단백질의 발현에 관계없이 검사 할 수 있습니다.
여기, 우리는 기관 시스템을 레이블로 사용되는 태그가없는 (cytoplasmically 지역화 된) GFP의 예를 보여줍니다. 그러나 여기에서 설명하는 방법은는 DsRed와 같은 다른 기본 형광 단백질뿐만 아니라, 형광 프로의 검출에도 적합수정 된 단백는 특정 세포 내 구조를 지역화 할 수 있습니다. 예를 들어, 말라 : GFP 또는 tubulin의 : GFP의 융합은 기관의 cytoskeleton 10을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 관심이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 원고에 대하여 코멘트를위한 질리안 스탠 필드 감사합니다. TAJ는 NIH의 NIGMS에서 유타 유전학 교육 그랜트 T32-GM007464의 대학에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
References
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