Summary
यहाँ, हम सांस की नली टर्मिनल कोशिकाओं के प्रकाश माइक्रोस्कोपी विश्लेषण में के लिए एक विधि प्रस्तुत
Abstract
सेल आकार सेल समारोह के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, सेल आकारिकी के महत्व के बावजूद, छोटे व्यक्ति की कोशिकाओं के विशिष्ट आकार उत्पन्न कैसे के बारे में जाना जाता है. ड्रोसोफिला सांस की नली टर्मिनल कोशिकाओं सेलुलर morphologies पैदा करने के लिए आवश्यक जीन की भूमिका की पहचान करने और स्पष्ट करने के लिए एक शक्तिशाली आनुवंशिक मॉडल बन गए हैं. टर्मिनल कोशिकाओं एक branched ट्यूबलर नेटवर्क का एक घटक, आंतरिक ऊतकों को ऑक्सीजन की आपूर्ति के लिए कार्य करता है कि सांस की नली व्यवस्था कर रहे हैं. टर्मिनल कोशिकाओं वे दो अलग सेलुलर आर्किटेक्चर के अधिकारी के रूप में सेल आकार के सवालों की जांच के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल हैं. सबसे पहले, टर्मिनल कोशिकाओं जटिल न्यूरॉन्स के लिए इसी तरह की एक विस्तृत शाखायुक्त आकारिकी, है, दूसरा, टर्मिनल सेल शाखाओं पतली ट्यूब के रूप में गठन और एक झिल्ली ही सीमित इंट्रासेल्युलर लुमेन होते रहे हैं. टर्मिनल सेल शाखा संख्या, शाखा संगठन और व्यक्ति शाखा आकार, के मात्रात्मक विश्लेषण विशिष्ट आनुवंशिक यांत्रिक की भूमिका के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैएक branched सेल के निर्माण में anisms. इन कोशिकाओं में ट्यूब गठन के विश्लेषण से इस तरह कशेरुकी वाहिका संरचना के रूप में अन्य ट्यूबलर नेटवर्क के लिए आम tubulogenesis के संरक्षित तंत्र, प्रकट कर सकते हैं. यहाँ हम तेजी, छवि को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि तकनीक का वर्णन है, और ड्रोसोफिला लार्वा के भीतर दोनों शाखाओं में बंटी पैटर्न और टर्मिनल कोशिकाओं में ट्यूब गठन का विश्लेषण. इन तकनीकों में जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती पशुओं, या आनुवंशिक मोज़ाइक में टर्मिनल कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. क्योंकि इस प्रोटोकॉल की उच्च क्षमता की, यह भी अच्छी तरह से आनुवंशिक, आरएनएआई आधारित, या ड्रोसोफिला सांस की नली प्रणाली में दवा स्क्रीन के लिए अनुकूल है.
Introduction
सेल आकार एक जीव के भीतर व्यक्ति की कोशिकाओं के समारोह के लिए महत्वपूर्ण है, साथ ही कोशिकाओं है एक ऊतक या अंग के हिस्से के रूप में उस समारोह. शाखाओं में बंटी और ट्यूब गठन (lumenogenesis): हम सेलुलर आकारिकी की दो संरक्षित प्रकार नियंत्रित करने में भाग लेने कि आणविक तंत्र की जांच करने के लिए ड्रोसोफिला सांस की नली टर्मिनल कोशिकाओं, कीट श्वसन प्रणाली के एक घटक, का उपयोग करें. टर्मिनल कोशिकाओं शाखायुक्त ट्यूबों के एक नेटवर्क के सुझावों पर स्थित हैं कि आंतरिक ऊतकों 1 को ऑक्सीजन देने और लक्ष्य ऊतकों 2 के भीतर स्थानीय ऑक्सीजन के स्तर के द्वारा नियंत्रित किया जाता है कि एक FGF संकेतन मार्ग पर निर्भर करता है जो एक विस्तृत शाखायुक्त आकारिकी है के लिए काम करता है. टर्मिनल सेल शाखाओं प्रत्येक शाखा के माध्यम से चल रहे गैस से भरे subcellular लुमेन के साथ, पतली ट्यूब हैं. आनुवांशिक विश्लेषण ड्रोसोफिला में प्रदर्शन किया जा सकता है जिसके द्वारा आसानी के साथ टर्मिनल कोशिकाओं के विशिष्ट सेलुलर आर्किटेक्चर, इन कोशिकाओं को एक शानदार मॉडल च बनानाया, सेलुलर परिणाम के तंत्र की जांच शाखाओं, और intracellular ट्यूब गठन. टर्मिनल कोशिकाओं शाखायुक्त सेल भेदभाव, परिणाम, और परिपक्वता 2-4 करने के लिए अग्रणी संकेत दे रास्ते के कुछ समझने के लिए एक उपयोगी मॉडल साबित कर दिया है. इस प्रणाली निष्पक्ष प्रयोग, सेल morphogenesis म्यूटेंट के लिए आगे आनुवंशिक स्क्रीन सेल आकार 5,6 नियंत्रित तंत्र में अंतर्दृष्टि उपज प्रदर्शन किया गया है. इंटीग्रिन की मध्यस्थता आसंजन शाखा स्थिरता 8 के लिए आवश्यक है कि, उदाहरण के लिए, इन स्क्रीन एक विशिष्ट RabGAP लुमेन गठन और पोजीशनिंग 7 में cytoskeletal polarity और पुटिका तस्करी के लिए आवश्यक है कि पता चला है और कि उपकला बराबर ध्रुवता प्रोटीन की आवश्यकता ध्रुवीकृत झिल्ली तस्करी को विनियमित शाखाओं में बंटी और लुमेन गठन 9 दोनों के लिए. टर्मिनल कोशिकाओं में अन्य अध्ययनों असममित actin के संचय और microtubule संगठन सेल बढ़ाव और lumenogenesis के लिए आवश्यक है कि पता चला है यहाँ, हम तेजी से टर्मिनल सेल शाखाओं में बंटी और लुमेन गठन के विश्लेषण के लिए बरकरार तीसरे instar ड्रोसोफिला लार्वा को ठीक करने के लिए एक विधि का वर्णन है. इस प्रोटोकॉल भी पहले और दूसरे दोनों instar जानवरों पर किया जा सकता है. इस तकनीक की कुंजी आनुवंशिक सीधे बरकरार जानवरों का लार्वा छल्ली के माध्यम से फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित कर रहे हैं कि टर्मिनल कोशिकाओं कल्पना करने की क्षमता है. इस प्रक्रिया ऐसी एंटीबॉडी धुंधला के रूप में किसी भी पद के निर्धारण जोड़तोड़, कोशिकाओं का पालन करने की आवश्यकता नहीं है, यह अच्छी तरह से आनुवंशिक या दवा स्क्रीनिंग सहित, उच्च throughput विश्लेषण के लिए अनुकूल है. फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति cytoplasmically से भरे शाखाओं की संरचना का पता चलता है. ट्यूब गठन के समानांतर आसपास के तरल पदार्थ भरने के साथ विरोधाभासों जो गैस से भरे लुमेन, की पहचान करने के लिए brightfield माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर में नजर रखी जा सकतीएड ऊतकों. इस प्रोटोकॉल में शामिल अन्यथा unlabeled पशुओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल समयुग्मक उत्परिवर्ती टर्मिनल कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए MARCM प्रणाली 11 के आधार पर आनुवंशिक मोज़ाइक पैदा करने के लिए विधि है. टर्मिनल कोशिकाओं केवल अपेक्षाकृत देर से विकास में उनके जटिल संरचनाओं प्रकाश डालेंगे, क्योंकि यह आवश्यक है, आनुवंशिक मोज़ाइक पहले के विकास में अन्य ऊतकों में जीन आवश्यकताओं के बाईपास के लिए अनुमति देते हैं. . MARCM क्लोन उत्पन्न करने के लिए, श्वासनली यहाँ वर्णित बेदम सांस की नली विशेष ड्राइवर (BTL) 12 का उपयोग कर चिह्नित कर रहे हैं ड्रोसोफिला एक्स गुणसूत्र के लिए प्रोटोकॉल है, दूसरे क्रोमोसोम के लिए, एक इसी तरह की प्रक्रिया की जा रही गुणसूत्र के लिए उपयुक्त आनुवंशिक अभिकर्मकों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है जांच की. इधर, श्वासनली एक cytoplasmically स्थानीयकृत GFP की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित कर रहे हैं, लेकिन प्रक्रिया ऐसी dsRed के रूप में अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के साथ समान रूप से अच्छी तरह से काम करता है. इसके अतिरिक्त, हम न्यूरोनल शाखा पैटर्न 13 निस्र्पक के लिए विकसित की विधियों पर आधारित है, टर्मिनल कोशिकाओं में शाखाओं में बंटी पैटर्न और लुमेन गठन यों के लिए एक विधि को शामिल किया है. मात्रात्मक डेटा के इस तरह समझदार सटीक शाखाओं या lumenogenesis प्रक्रिया में जीन की भूमिका, साथ ही विभिन्न म्यूटेंट 9 के बीच प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देने में महत्वपूर्ण हो सकता है.
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Protocol
1. मोजाइक पीढ़ी
- जेनेटिक क्रॉस
डब्ल्यू FRT 19A टब: GAL80 FLP 122 / वाई, BTL-GAL4, यूएएस GFP (पुरुष) एक्स * जांच की जा उत्परिवर्ती का प्रतिनिधित्व करता है जहां * FRT 19A / बल (महिलाओं),. नोट: यह पशुओं के उचित दोस्त के लिए अनुमति देता है, के रूप में पहले प्रयोग करने के लिए कम से कम एक दिन पार सेट करें. - पूर्व जब्री: स्थानांतरण पार मीडिया पर रखा ताजा खमीर पेस्ट का एक छोटा सा धब्बा के साथ उड़ान भरने से खाद्य शीशियों को. 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए रखना करने की अनुमति दें
- लेटाओ: पूर्व रखना शीशी से स्थानांतरण जानवरों ताजा खमीर पेस्ट का एक छोटा सा धब्बा के साथ एक ताजा शीशी. 25 डिग्री सेल्सियस से कम 6 घंटे के लिए रखना करने की अनुमति दें
- स्थानांतरण वयस्कों वापस भंडारण और बाद के प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए शीशी पूर्व रखना. इसके तत्काल बाद गर्मी झटका एक परिसंचारी पानी के स्नान में 38 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए 0-6 घंटे पुराने भ्रूण से युक्त करना शीशी. नोट: भोजन की सतह सभी को सत्यापित करने के लिए पानी के स्तर से नीचे होना चाहिएभ्रूण उचित हैरान गर्मी कर रहे हैं.
- तीसरे instar लार्वा को भटकना शुरू तक 4-5 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी हैरान शीशियों सेते हैं.
2. मोजाइक पशु के लिए स्क्रीन
- ठीक संदंश का प्रयोग धीरे शीशी की तरफ से भटक तीसरे instar लार्वा लेने के लिए और एक छोटे से प्लास्टिक की प्लेट में ठंडा 100% ग्लिसरॉल में उन्हें जगह है.
- फ्लोरोसेंट प्रकाशिकी के साथ सुसज्जित एक उच्च बढ़ाई विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग लार्वा की जांच करना. Fluorescently लेबल सांस की नली कोशिकाओं की पच्चीकारी अभिव्यक्ति के साथ लार्वा को पहचानें. आमतौर पर, यह 10-20X बढ़ाई जा सकती है.
3. हीट फिक्सेशन
- ठीक संदंश का प्रयोग सावधानी से एक 75x25x1 मिमी सफेद गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर ताजा 100% ग्लिसरॉल की एक बूंद में पकवान और जगह की पच्चीकारी जानवरों बाहर ले. नोट: कई जानवरों ड्रॉप (चित्रा 1 ए) में रखा जा सकता है.
पशु भी सीधे एक coverslip पर ग्लिसरॉल की एक बूंद में रखा जा सकता हैजानवरों बहुत जल्दी गर्मी होगी और अधिक निश्चित बन सकता है लेकिन जैसा कि देखभाल, निर्धारण (3.2 कदम) के दौरान लिया जाना चाहिए. - जानवरों तक 70 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक पर जगह कांच स्लाइड सिर्फ एक कवर पर्ची (चित्रा 1 बी) के लिए एक स्लाइड, और 10 सेकंड के लिए, कोई 20 से अधिक सेकंड के चलते बंद. पशु शुरू में लोटना होगा लेकिन बंद करो और कठोर और लम्बी एक बार मृत हो जाते हैं. नोट: गर्मी के लिए लंबा प्रदर्शन के साथ ही GFP संकेत मंद और फैलाना बनाने के रूप में टर्मिनल शाखाओं और lumens नुकसान होगा. इष्टतम दक्षता के लिए यह सूक्ष्मदर्शी के रूप में एक ही कमरे में गर्मी ब्लॉक की सिफारिश की है.
- ठीक संदंश का प्रयोग सावधानी से पूरबी स्लाइड पर सभी लार्वा एक दूसरे (चित्रा 1C) के लिए उन्मुख समानांतर हैं कि इस तरह के एक ही दिशा में ड्रॉप में सभी लार्वा,.
- धीरे लार्वा के शीर्ष (या एक गिलास स्लाइड पर coverslip के पलटना) पर एक 18x18mm सूक्ष्म कांच कवर जगह और बनाने बुलबुले (चित्रा -1) से बचें. नोट: coverslip के बिल्कुल झूठ नहीं हो सकतालार्वा से अधिक फ्लैट, यह एक समस्या नहीं है.
- 30 मिनट के भीतर छवि लार्वा. हीट निश्चित टर्मिनल कोशिकाओं को नीचा दिखाना होगा और GFP संकेत बहुत फैलाना हो जाएगा.
4. Tracheal टर्मिनल प्रकोष्ठों के vivo इमेजिंग में
- एक यौगिक stereomicroscope के मंच पर स्लाइड रखें. एक 5X उद्देश्य जानवर की पृष्ठीय सतह (चित्रा 1F) पर पीछे तक पूर्वकाल से चल रहे दो समानांतर पृष्ठीय चड्डी का पता लगाने का उपयोग करना. सीधे दो पृष्ठीय चड्डी के बीच दो पृष्ठीय टर्मिनल कोशिकाओं, जानें. इस विश्लेषण के लिए उपयुक्त खंड की पहचान में मदद करता है.
- एक बार उन्मुख, छवि वांछित टर्मिनल कोशिकाओं के लिए पशुओं को घुमाएगी. ऐसा करने के लिए, ध्यान से संदंश धीरे coverslip के नीचे लार्वा (आंकड़े 1E और 1G) रोलिंग, लार्वा की लंबी अक्ष को सीधा के साथ किनारे पर coverslip धक्का.
- उचित टर्मिनल कोशिकाओं का चयन अनुरूप परिणाम के लिए महत्वपूर्ण हैऔर म्यूटेंट के बीच तुलना. वसा शरीर शाखा (एफबी) टर्मिनल कोशिकाओं को आसानी से midline के लिए पार्श्व पृष्ठीय ट्रंक के निकट पाए जाते हैं. पार्श्व समूह जी टर्मिनल कोशिकाओं (एलजी) आसानी से पाए जाते हैं और उदर midline (चित्रा 1H) की बस के पार्श्व में स्थित हैं. नोट: सबसे पूर्वकाल (TR1) और पीछे (TR10) क्षेत्रों में टर्मिनल सेल की व्यवस्था अन्य क्षेत्रों से भिन्न है. हम केवल क्षेत्रों TR2-Tr9 में टर्मिनल कोशिकाओं का विश्लेषण. पृष्ठीय टर्मिनल कोशिकाओं अन्य सांस की नली टर्मिनल कोशिकाओं की तुलना में एक अधिक टकसाली शाखाओं में बंटी पैटर्न है. इस अतिरिक्त, गैर सेल स्वायत्त संकेतों पर निर्भर हो सकता है, और विश्लेषण में उन्हें शामिल करने के लिए जब तय है कि इस पर विचार किया जाना चाहिए.
- ब्याज की एक टर्मिनल सेल की पहचान की गई है, एक बार वांछित बढ़ाई उपयोग कर एक छवि पर कब्जा, आमतौर पर 10X या 20X (2A चित्रा) सबसे अच्छा है. नोट: चर शाखाओं में बंटी पैटर्न की वजह से, के रूप में कई शाखाओं और संभव के रूप में शाखा सुझावों में शामिल है कि छवियों पर कब्जा करने की कोशिश.
- मंच चलती बिना, प्रतिदीप्ति बंद कर और एक ही सेल और फोकल हवाई जहाज़ (चित्रा 2 बी) के एक brightfield छवि पर कब्जा करने के लिए प्रेषित प्रकाश पर बारी. लुमेन अंधेरे में टर्मिनल सेल अंतरिक्ष के भीतर परस्पर विरोधी के रूप में देखे जा जाएगा. टर्मिनल सेल शाखाओं और lumens यों पर योजना बना रहा है, तो प्रत्येक टर्मिनल सेल के कई फोकल विमानों में कई छवियों को इकट्ठा.
5. ImageJ का उपयोग टर्मिनल सेल आकृति विज्ञान के विश्लेषण और मात्रा
- ImageJ (उपयोग कर फ्लोरोसेंट और brightfield छवियों को खोलें http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) NeuronJ प्लग में ( http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ ).
- "जोड़ें ट्रेसिंग" उपकरण का उपयोग, मैन्युअल पूरे टर्मिनल सेल की शाखाओं और लुमेन ट्रेस.
- "लेबल ट्रेसिंग" उपकरण का उपयोग करना, नाम बदलने और आरट्रेस एक विशिष्ट पद के भीतर प्रत्येक पंक्ति आवंटित करने के लिए ecolor.
- "सेट पैरामीटर" उपकरण का उपयोग, 6-10 पिक्सल से लाइन चौड़ाई समायोजित (यौगिक माइक्रोस्कोप से जुड़ा डिजिटल कैमरे से प्राप्त 512x512 छवियों के लिए. अधिक या कम संकल्प कैमरों के लिए, पिक्सेल चौड़ाई उचित रूप से बढ़ाया जाना चाहिए), सभी का उपयोग अन्य डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स, और "ठीक है" का चयन करें. फिर एक छवि लेने के लिए "स्नैपशॉट बनाएँ" उपकरण का उपयोग करें. चुनें मूल के साथ पक्ष द्वारा साइड दिखाया जा सकता है कि पता लगाने का एक स्नैपशॉट पाने के लिए "ट्रेस ड्रा".
- "उपाय ट्रेसिंग" उपकरण का चयन करें और पता लगाने के प्रकार (मापने के लिए शाखाओं कदम 5.3 में सौंपा विशिष्ट पदों के आधार पर जो IE) का चयन करें. अगला, "भागो" पर क्लिक करें और फिर चुनें "ट्रेसिंग माप प्रदर्शित करें" और "स्पष्ट पिछले माप". यह नाम, लेबल, लंबाई (पिक्सेल में), और छवि के लिए अन्य डेटा वाली एक स्प्रेडशीट का उत्पादन होगा. इस डाटा तो आगे सांख्यिकीय के लिए एक माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल स्प्रेडशीट के रूप में सहेजा जा सकता हैविश्लेषण.
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Representative Results
परिणाम चित्रा 2 में दिखाया गया है. और शाखाओं में से प्रत्येक के माध्यम से चल रहे गैस से भरे subcellular लुमेन (brightfield माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना, बी), एक एकल पार्श्व समूह (एलजी) टर्मिनल सेल व्यापक subcellular शाखाओं में बंटी (ए GFP के द्वारा कल्पना) से पता चलता है. इन छवियों वर्गों 1 और 2 में वर्णित MARCM प्रणाली का उपयोग कर उत्पन्न, एक मोज़ेक L3 लार्वा से एकत्र, और गर्मी और तय imaged, के रूप में धारा 3 व 4 में वर्णित किया गया. पैनलों सी और डी ए और बी पैनलों में दिखाया छवियों के क्रमश शाखाओं के रूप में खंड 5 में वर्णित एक NeuronJ उत्पन्न ट्रेस, और लुमेन दिखाने ई और एफ एक लार्वा में वसा शरीर (एफबी) शाखा के स्थान दिखा धारा 3 व 4 में वर्णित के रूप में इमेजिंग के लिए तैयार है. इस उदाहरण में, जानवरों की एक मोज़ेक नहीं है, और GFP पूरे सांस की नली प्रणाली में व्यक्त किया है कि ध्यान दें. पैनलों जी और एच भी लंबे समय से एक समय के लिए तय की गर्मी थी कि एक GFP लेबल टर्मिनल सेल का एक उदाहरण दिखा. GFP branche, (जी) फैलाना हैएस टूट गए और lumens के अंश गैस नहीं रह भरी हैं, इस प्रकार brightfield छवि में टूट के रूप में दिखाई दे.
चित्रा 1. टर्मिनल कोशिकाओं के लार्वा तैयारी और पहचान. एक गिलास स्लाइड पर 100% ग्लिसरॉल की एक बूंद में (ए) प्लेस लार्वा. (बी) एकाधिक लार्वा गर्मी निर्धारण के लिए रखा जा सकता है. (सी) गर्मी निर्धारण के बाद, एक दूसरे के समानांतर लार्वा का आयोजन और सीधा स्लाइड की लंबी अक्ष के लिए. (डी) लार्वा ऊपर रखें कवर गिलास. (ई) को ध्यान से जानवरों के रोल करने के लिए संदंश के साथ कवर गिलास धक्का, लार्वा को नई दिशा करने के लिए. (एफ) GFP के साथ जंगली प्रकार तीसरे instar लार्वा के दौरान व्यक्त सांस की नली प्रणाली. बनती पृष्ठीय चड्डी (डीटी) वें पर दिखाई दे रहे हैंई पृष्ठीय पक्ष. (जी) उदर पक्ष के साथ रोलिंग तकनीक के बाद ही लार्वा अब ऊपर की ओर का सामना करना पड़. दो तीसरे instar सांस की नली hemisegments (एक hemisegment भूरे रंग में प्रकाश डाला है) के पार्श्व दृश्य के (एच) आरेख. सर्किलों पार्श्व समूह (एलजी) और वसा शरीर (एफबी) हम quantitation के लिए उपयोग जो टर्मिनल कोशिकाओं से संकेत मिलता है. धराशायी लाइनों हम नियमित quantitate नहीं है जो सांस की नली प्रणाली की अन्य शाखाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं. एक लार्वा खंड में सांस की नली शाखाओं का एक पूर्ण विवरण के लिए, रेफरी 1 को देखें.
चित्रा 2. प्रतिनिधि छवियाँ. (ई.) मोजाइक L3 लार्वा MARCM तकनीक (खंड 1) का उपयोग कर उत्पन्न होता है और तय हो गई और वर्गों 2-4 में प्रोटोकॉल का उपयोग imaged थे. एक एकल एलजी टर्मिनल सेल वा की शाखाओं में बंटी पैटर्नएस GFP (ए) के मोज़ेक अभिव्यक्ति द्वारा कल्पना, गैस से भरे लुमेन brightfield माइक्रोस्कोपी (बी) के साथ कल्पना. (सी) NeuronJ (धारा 5) का उपयोग कर उत्पन्न एक में सेल, की शाखाओं में बंटी पैटर्न का पता लगाने. (डी) NeuronJ (प्रोटोकॉल खंड 5) का उपयोग कर उत्पन्न बी में सेल की गैस से भरे लुमेन, की ट्रेसिंग. (ई, एफ) एक वसा शरीर (एफबी) टर्मिनल सेल (लाल वृत्त पर प्रकाश डाला द्वारा) वर्गों 2-4 में प्रोटोकॉल द्वारा तैयार एक लार्वा में सांस की नली प्रणाली (ई) और brightfield माइक्रोस्कोपी (एफ) के दौरान GFP अभिव्यक्ति द्वारा कल्पना. नमूना भी लंबी अवधि के लिए गर्म किया जाता है जब प्राप्त निर्धारण कलाकृतियों का (जी, एच) उदाहरण. GFP फैलाना है और छोटी शाखाओं (जी) अपमानित किया है. लुमेन के क्षेत्रों में भी नहीं रह गया (एच में तीर) हवा से भरे दिखाई देते हैं. स्केल पट्टी: 100 माइक्रोन.
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Discussion
यहाँ वर्णित गर्मी निर्धारण तकनीक इमेजिंग ड्रोसोफिला लार्वा सांस की नली टर्मिनल कोशिकाओं के लिए एक तेजी से और सुविधाजनक उपकरण है. यहाँ, हम शाखाओं और जंगली प्रकार की कोशिकाओं के लुमेन पैटर्न की जांच के लिए इस तकनीक का उपयोग करें. बेदम सांस की नली विशिष्ट प्रमोटर द्वारा संचालित GFP, व्यक्त सांस की नली कोशिकाओं गर्मी निर्धारण के बाद लार्वा छल्ली के माध्यम से आसानी से देखे जा सकते हैं. साथ ही हवा से भरे लुमेन के उन लोगों के रूप में व्यक्तिगत टर्मिनल कोशिकाओं, के विशिष्ट शाखाओं में बंटी पैटर्न जल्दी से देखे और इस पद्धति का उपयोग करके मापा जा सकता है. इस तकनीक को भी पहले और दूसरे दोनों instar लार्वा पर प्रदर्शन किया जा सकता है. हालाँकि, ध्यान फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति के रूप में, छोटे जानवरों फिक्सिंग में लिया जाना चाहिए आसानी से बाधित हो सकता है.
यहाँ दिखाया पद्धति में, हम एक सांस की नली की कोशिकाओं में व्यक्त GFP के साथ पच्चीकारी जानवरों के एक विश्लेषण का वर्णन. हालांकि, एक ही तकनीक का एक कट्टरपंथी घुड़दौड़ का घोड़ा के तहत सांस की नली की कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए लागू कर रहे हैंप्रयोगात्मक जोड़तोड़ के आर. उदाहरण के लिए, पशुओं में जो जीन अभिव्यक्ति, आरएनएआई transgenes या संशोधित प्रोटीन की अभिव्यक्ति से सांस की नली प्रणाली में या व्यक्ति की कोशिकाओं में, आणविक दृष्टिकोण से बदल दिया गया है भी इस दृष्टिकोण के साथ जांच की जा सकती. ऐसी दवाओं या हाइपोक्सिया 2,14 के रूप में टर्मिनल सेल विकास को प्रभावित करने वाले गैर आनुवंशिक उपचार, भी इन तरीकों का उपयोग कर विशेषता जा सकता है. इन बाद के मामलों में, यह एक ड्रोसोफिला स्टॉक अनिवार्यता पैटर्न शाखाओं में कल्पना करने के क्रम में अपनी सांस की नली प्रणाली में GFP या अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के साथ शुरू करने के लिए आवश्यक है. गैस भरने फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति की परवाह किए बिना जांच की जा सकती.
यहाँ, हम केवल सांस की नली प्रणाली लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा untagged (cytoplasmically स्थानीयकृत) GFP के उदाहरण दिखाते हैं. हालांकि, यहां वर्णित विधि ऐसे dsRed के रूप में अन्य देशी फ्लोरोसेंट प्रोटीन,, साथ ही फ्लोरोसेंट समर्थक का पता लगाने के लिए भी उपयुक्त हैंसंशोधित किया गया है जो teins विशिष्ट subcellular संरचनाओं को स्थानीकृत किया जाए. उदाहरण के लिए, actin: GFP या ट्यूबिलिन: GFP fusions के सांस की नली cytoskeleton 10 कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हित है कि घोषणा.
Acknowledgments
हम पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए गिलियन Stanfield धन्यवाद. ताज एनआईएच NIGMS से यूटा जेनेटिक्स प्रशिक्षण अनुदान T32-GM007464 विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
References
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