Summary
A continuación, presentamos un método para el análisis de microscopía de luz de las células traqueales de terminales
Abstract
La forma celular es crítica para la función celular. Sin embargo, a pesar de la importancia de la morfología de las células, se sabe poco sobre cómo las células individuales generan formas específicas. Células terminales traqueal de Drosophila se han convertido en un modelo genético de gran alcance para identificar y aclarar el papel de los genes necesarios para la generación de morfologías celulares. Células de terminales son un componente de una red tubular ramificada, el sistema traqueal que funciona para suministrar oxígeno a los tejidos internos. Células de terminales son un excelente modelo para la investigación de las cuestiones de forma de la célula, ya que poseen dos arquitecturas celulares distintos. En primer lugar, las células terminales tienen una morfología ramificada elaborada, similar a las neuronas complejas; segundo, ramas de células terminales se forman como tubos delgados y contienen un lumen intracelular unida a la membrana. El análisis cuantitativo del número de rama terminal de las células, la organización y la forma de rama rama individual, se puede utilizar para proporcionar información sobre el papel de los mecanismos genética específicamos en la fabricación de una célula ramificada. Análisis de la formación del tubo en estas células puede revelar los mecanismos conservadas de tubulogénesis comunes a otras redes tubulares, tales como la vasculatura del vertebrado. Aquí se describen las técnicas que se pueden utilizar para fijar rápidamente, imagen, y analizamos los dos patrones de ramificación y la formación del tubo en las células terminales dentro de las larvas de Drosophila. Estas técnicas se pueden utilizar para analizar las células terminales en los animales de tipo salvaje y mutante, o mosaicos genéticos. Debido a la alta eficiencia de este protocolo, también es muy adecuado para el genético, basado en RNAi, o pruebas de drogas en el sistema traqueal de Drosophila.
Introduction
La forma celular es crítica para la función de las células individuales dentro de un organismo, así como las células que funcionan como parte de un tejido u órgano. Utilizamos Drosophila células terminales traqueales, un componente del sistema respiratorio del insecto, para investigar los mecanismos moleculares que participan en el control de dos tipos conservadas de morfología celular: Bifurcaciones y formación del tubo (lumenogenesis). Células de terminales se encuentran en la punta de una red de tubos ramificados que funciona para suministrar oxígeno a los tejidos internos 1 y tienen una morfología ramificada elaborado que depende de una vía de señalización de FGF que es controlada por los niveles de oxígeno locales dentro de los tejidos de destino 2. Ramas de células de terminales son tubos delgados, con un llenas de gas lumen subcelulares se ejecutan a través de cada rama. Las arquitecturas celulares distintos de las células terminales, junto con la facilidad con la que el análisis genético puede llevarse a cabo en Drosophila, hacen que estas células un modelo excelente fo la investigación de los mecanismos de derivación celular, ramificación y formación del tubo intracelular. Células de terminales han demostrado ser un modelo útil para entender algunas de las vías de señalización que conducen a la diferenciación celular ramificado, carnosidad, y la maduración 2-4. El uso de este sistema imparcial, se han realizado las pantallas adelante genéticos para la morfogénesis de células mutantes, dando ideas sobre los mecanismos que controlan la forma celular 5,6. Por ejemplo, estas pantallas han puesto de manifiesto que es necesario un RabGAP específica para la polaridad del citoesqueleto y el tráfico de vesículas en la formación del lumen y de posicionamiento 7; que se requiere la adhesión mediada por la integrina para la estabilidad rama 8, y que las proteínas PAR-polaridad epiteliales regular el tráfico de membrana polarizada requerido tanto para la ramificación y la formación del lumen 9. Otros estudios realizados en células de terminales han demostrado que se requiere la acumulación de actina asimétrica y organización de los microtúbulos para la elongación celular y lumenogenesis A continuación, se describe un método para solucionar rápidamente intacta tercer estadio las larvas de Drosophila para el análisis de células ramificación terminal y la formación del lumen. Este protocolo también puede llevarse a cabo tanto en primero y segundo instar animales. La clave de esta técnica es la posibilidad de visualizar las células terminales que están etiquetados genéticamente mediante la expresión de la proteína fluorescente directamente a través de la cutícula larval de los animales intactos. Dado que este procedimiento no requiere ninguna manipulación posteriores a la fijación, tales como la tinción de anticuerpos, para observar las células, que es muy adecuado para análisis de alto rendimiento, incluyendo la investigación genética o drogas. Expresión de la proteína fluorescente revela la estructura de las ramas citoplásmicamente llenas. La formación de tubos se puede controlar en paralelo usando microscopía de campo claro para identificar el lumen lleno de gas, lo que contrasta con el entorno de fluido llenetejidos ed. Incluido en este protocolo es el método para la generación de mosaicos genéticos basados en el sistema MARCM 11, para producir células mutantes homocigotos terminales marcadas con proteínas fluorescentes en animales no marcados de otro modo. Esto es necesario, ya que las células terminales sólo elaboran sus estructuras complejas relativamente tarde en el desarrollo; mosaicos genéticos permiten la derivación de los requisitos de genes en anteriores en el desarrollo de otros tejidos. . Para generar clones MARCM, la tráquea se etiquetan con el controlador específico de respiración traqueal (BTL) 12 describe aquí es el protocolo para el cromosoma X de Drosophila; para otros cromosomas, un procedimiento similar se puede utilizar, con reactivos genéticos apropiados para el cromosoma ser examinado. Aquí, la tráquea se etiquetan mediante la expresión de una GFP citoplasmática localizada, pero el procedimiento funciona igualmente bien con la expresión de otras proteínas fluorescentes, tales como DsRed. Además, hemos incluido un método para cuantificar los patrones de ramificación y la formación del lumen de las células terminales, con base en los métodos desarrollados para caracterizar los patrones de ramificación neuronal 13. Este tipo de datos cuantitativos puede ser crítico para discernir el papel preciso de los genes en el proceso de ramificación o lumenogenesis, así como para permitir comparaciones directas entre los diferentes mutantes 9.
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Protocol
1. Generación Mosaico
- Cruz genética
w FRT 19A bañera: GAL80 FLP 122 / Y; BTL-GAL4, UAS-GFP (machos) * X FRT 19A / Bal (hembras), donde * representa el mutante a ser examinado. Nota: Configure cruzar por lo menos un día antes de experimentar, ya que esto permite a los animales se aparean correctamente. - Pre-lay: Centro de transferencia de viales volar de comida con una pequeña mancha de pasta de levadura fresca colocada en los medios de comunicación. Permitir a sentar durante 1 hora a 25 ° C.
- Lay: Transferencia de animales de vial pre-sentar a un vial fresco con una pequeña mancha de pasta de levadura fresca. Permitir a sentar durante 6 horas a 25 ° C.
- Transferencia de adultos de vuelta a vial pre-sentar para su almacenamiento y su uso en experimentos posteriores. Inmediatamente choque de calor el vial laico que contiene 0-6 hr embriones durante 45 min a 38 ° C, en un baño de agua circulante. Nota: La superficie de los alimentos debe estar por debajo del nivel del agua para verificar toda laembriones están debidamente choque térmico.
- Incubar viales calor conmocionado a 25 ° C durante 4-5 días hasta que las larvas comienzan a divagar.
2. Pantalla de mosaico Animales
- Usando unas pinzas finas recoger suavemente errante larvas de tercer estadio de los lados del vial y colocarlos en refrigerada glicerol 100% en una pequeña placa de plástico.
- Examine larvas utilizando un microscopio de disección alta magnificación-equipada con óptica fluorescentes. Identificar las larvas con la expresión mosaico de células traqueales marcados con fluorescencia. Típicamente, esto se puede hacer en 10-20X.
3. Fijación de calor
- Con unas pinzas finas recoger cuidadosamente animales mosaico del plato y coloque en una gota de agua dulce 100% de glicerol en mm blanco vidrio portaobjetos de 75x25x1. Nota: múltiples animales pueden ser colocados en la gota (Figura 1A).
Los animales también se pueden colocar en una gota de glicerol directamente sobre un cubreobjetos,pero se debe tener cuidado durante la fijación (paso 3.2), ya que los animales se calientan muy rápidamente y pueden llegar a ser sobre-fija. - Colocar el portaobjetos de vidrio a 70 ° C del bloque de calor hasta que los animales sólo dejan de moverse, no más de 20 segundos para una diapositiva, y 10 seg para una hoja de cubierta (Figura 1B). Los animales se retuercen al principio, pero detenerse y volverse rígida y alargada, una vez muerto. Nota: La exposición demasiado larga al calor puede dañar ramas terminales y lúmenes, así como hacer la señal de GFP tenue y difusa. Para una eficacia óptima, se recomienda tener el bloque de calor en la habitación con los microscopios.
- Usando unas pinzas finas orientar cuidadosamente todas las larvas del menú en una sola dirección, de tal manera que todas las larvas en la diapositiva son orientadas en paralelo el uno al otro (Figura 1C).
- Coloque con cuidado la cubierta de vidrio micro 18x18mm en la parte superior de las larvas (o invertir el cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio) y evitar la formación de burbujas (Figura 1D). Nota: cubreobjetos no puede estar exactamenteplana sobre larvas, esto no es un problema.
- Larvas de imagen dentro de 30 min. Células terminales fijos de calor se degradarán y la señal de GFP se convertirán en muy difusa.
4. Imágenes in vivo de las células traqueales de terminales
- Coloque la diapositiva en el escenario de un microscopio estereoscópico compuesto. El uso de un objetivo de 5X localizar los dos troncos de dorsales paralelas que van de anterior a posterior en la superficie dorsal del animal (Figura 1F). Localice las dos células terminales dorsal, directamente entre los dos troncos de dorsales. Esto ayuda a identificar el segmento apropiado para el análisis.
- Una vez orientado, rotar a los animales para agrandar las células terminales deseados. Para hacer esto, empuje con cuidado el cubreobjetos en el borde con las pinzas perpendiculares al eje largo de las larvas, rodando lentamente las larvas debajo del cubreobjetos (Figuras 1E y 1G).
- Selección de las células terminales apropiados es fundamental para obtener resultados consistentesy las comparaciones entre los mutantes. Células terminales La rama de grasa corporal (PC) se encuentran fácilmente al lado del tronco dorsal, lateral a la línea media. Las células terminales del grupo G laterales (LG) son fáciles de encontrar y están situadas justo lateral de la línea media ventral (Figura 1H). Nota: en los segmentos más anteriores (Tr1) y posterior (Tr10) la disposición de la célula terminal es divergente de otros segmentos. Nosotros sólo analizamos las células terminales en los segmentos Tr2-TR9. Células terminales dorsales tienen un patrón de ramificación más estereotipado que otras células traqueales de terminales. Esto puede depender de las señales autónomas adicionales, no celulares, y esto debe ser considerado al momento de decidir si se debe incluir en el análisis.
- Una vez que una célula terminal del interés ha sido identificado, la captura de una imagen con el tamaño deseado, normalmente 10X o 20X es mejor (Figura 2A). Nota: debido a los patrones de ramificación variables, tratar de capturar imágenes que incluyan tantas ramas y puntas de las ramas como sea posible.
- Sin mover el escenario, apagar la fluorescencia y encienda la luz transmitida para capturar una imagen de campo claro de la misma célula y el plano focal (Figura 2B). El lumen se puede visualizar como contrasta en color oscuro en el espacio celular terminal. Si planeas cuantificar ramas terminales celulares y lúmenes, recoge varias imágenes en múltiples planos focales de cada célula terminal.
5. Análisis y cuantificación de Morfología Celular Terminal Utilizando ImageJ
- Abra las imágenes fluorescentes y campo claro mediante el ImageJ ( http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) plug-in NeuronJ ( http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ ).
- Utilizando el "Add trazados" herramienta rastrear manualmente las ramas y el lumen de la célula entera terminal.
- Con la herramienta "trazados Label", cambiar el nombre y la reColor asignar cada línea de la traza de una denominación específica.
- Con la herramienta "parámetros de Set", ajustar el ancho de línea 6-10 512x512 píxeles (para imágenes obtenidas por la cámara digital conectada al microscopio compuesto. Para cámaras de mayor resolución o menor, el ancho de píxel debe escalarse apropiadamente), utilizando todos los otros valores predeterminados y seleccione "OK". A continuación, utilice la función "Hacer foto" para tomar una imagen. Seleccione la opción "Dibujar trace" para obtener una instantánea de la traza que se puede mostrar de lado a lado con el original.
- Seleccione la herramienta "Medir trazados" y seleccionar el tipo de trazado (es decir, que se ramifica a medida basada en las denominaciones específicas asignadas en el paso 5.3). A continuación, seleccione "Mostrar las mediciones de rastreo" y "Borrar las mediciones anteriores" y luego haga clic en "Ejecutar". Esto producirá una hoja de cálculo que contiene el nombre, la etiqueta, la longitud (en píxeles), y otros datos para la imagen. Estos datos se pueden guardar como una hoja de cálculo Microsoft Excel para su posterior estadísticaanálisis.
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Representative Results
Los resultados se muestran en la Figura 2. Un grupo lateral única (LG) celular terminal muestra extensa ramificación subcelular (visualizado por las buenas prácticas agrarias, A) y un gas llenos de luz subcelulares que atraviesan cada una de las ramas (visualizaron por microscopía de campo claro, B). Estas imágenes se obtuvieron de un mosaico L3 larva, generado usando el sistema de MARCM descrito en las secciones 1 y 2, y el calor y la imagen fija, tal como se describe en las secciones 3 y 4. Los paneles C y D muestran una huella NeuronJ generado, tal como se describe en la sección 5, de las ramas y la luz, respectivamente, de las imágenes mostradas en A & B. Los paneles E y F muestran la ubicación de la grasa corporal (PC) rama en una larva preparado para la formación de imágenes tal como se describe en las secciones 3 y 4. Tenga en cuenta que en este ejemplo, el animal no es un mosaico, y GFP se expresa a lo largo de todo el sistema traqueal. Los paneles G y H muestran un ejemplo de un terminal de las células GFP-etiquetados que era calor fijado para un tiempo demasiado largo. GFP es difusa (G), branches se han roto y parte de lúmenes se llenan ya no hay gas, apareciendo así como interrupciones en la imagen campo claro.
Figura 1. Las larvas preparación e identificación de células terminales. (A) Lugar larva en una gota de 100% de glicerol en un portaobjetos de vidrio. (B) larvas múltiple puede ser colocado para la fijación de calor. (C) Después de la fijación de calor, organizan larvas paralelo el uno al otro y perpendicular al eje longitudinal de la corredera. (D) colocar el cubreobjetos sobre las larvas. (E) Para reorientar las larvas, empuje con cuidado la cubierta de cristal con unas pinzas para tirar los animales. (F) de tipo salvaje tercera larva instar con GFP expresa en todo el sistema traqueal. Los troncos dorsales pareadas (DT) se pueden ver en the lado dorsal. (G) Lo mismo larva después de la técnica de laminación con el lado ventral ahora mirando hacia arriba. (H) Diagrama de la vista lateral de dos hemisegments traqueales de tercer estadío (uno hemisegment está resaltada en gris). Los círculos indican grupo lateral (LG) y la grasa corporal (PC) de las células terminales que usamos para la cuantificación. Las líneas discontinuas representan otras ramas del sistema traqueal que no cuantifican de forma rutinaria. Para una descripción completa de las ramas traqueales en un segmento larval, consulte Ref 1.
Figura 2. Imágenes representativas. (AD) Mosaico larvas L3 se generaron utilizando la técnica MARCM (sección 1) y fija y la imagen mediante el protocolo en las secciones 2-4. El patrón de ramificación de un solo terminal de la célula LG was visualizada por la expresión del mosaico de GFP (A), el lumen llenos de gas se visualizaron con microscopía de campo claro (B). (C) Seguimiento del patrón de ramificación de la celda en A, generado mediante NeuronJ (sección 5). (D) el rastreo de la luz llenos de gas de la célula en B, generados usando NeuronJ (servicio de protocolo 5). (E, F) A (FB) terminal de las células de grasa corporal (puesto de manifiesto por el círculo rojo) visualizó mediante la expresión de GFP en todo el sistema traqueal (E) y microscopía de campo claro (F) en una larva preparado por el protocolo en las secciones 2-4. (G, H) Ejemplo de artefactos de fijación obtenidos cuando la muestra se calienta durante un período demasiado largo. GFP es difusa y pequeñas ramas han degradado (G). Áreas de lumen también han dejado de aparecer lleno de aire (flecha en H). Barra de escala: 100 m.
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Discussion
La técnica de fijación por calor descrito aquí es una herramienta rápida y conveniente para las larvas células terminales traqueales imágenes Drosophila. Aquí, nosotros usamos esta técnica para examinar la ramificación y el patrón de luz de las células de tipo salvaje. Células traqueales que expresan GFP, dirigido por el promotor específico traqueal sin aliento, se pueden visualizar fácilmente a través de la cutícula larval después de la fijación de calor. Los patrones de ramificación específicas de las células de terminales individuales, así como las de los lúmenes llenas de aire, pueden ser rápidamente visualizados y medido utilizando este método. Esta técnica también se puede realizar en ambos primero y segundo estadio las larvas. Sin embargo, se debe tener cuidado en la fijación de los animales más pequeños, como expresión de la proteína fluorescente puede ser fácilmente interrumpido.
En el método que se muestra aquí, se describe un análisis de los animales mosaico con GFP expresado en células traqueales individuales. Sin embargo, las mismas técnicas son aplicables al análisis de las células traqueales bajo un Number de manipulaciones experimentales. Por ejemplo, animales en los que la expresión del gen ha sido alterada por los enfoques moleculares, en todo el sistema traqueal o en células individuales mediante la expresión de los transgenes RNAi o proteínas modificados, también puede ser examinado con este enfoque. Los tratamientos no genéticos que afectan el desarrollo de células de terminales, tales como drogas o hipoxia 2,14, también se pueden caracterizar usando estos métodos. En estos últimos casos, es necesario comenzar con un stock de Drosophila que expresan constitutivamente GFP u otra proteína fluorescente a través de su sistema traqueal con el fin de visualizar los patrones de ramificación. De llenado de gas puede ser examinado independientemente de expresión de la proteína fluorescente.
Aquí sólo se muestran ejemplos de no etiquetado (citoplásmicamente localizada) GFP se utilizan para etiquetar el sistema traqueal. Sin embargo, los métodos descritos aquí también son adecuados para la detección de otras proteínas nativas fluorescentes, tales como DsRed, así como pro fluorescenteproteínas que han sido modificados para ser localizados a las estructuras subcelulares específicos. Por ejemplo, actina: GFP o tubulina: fusiones de GFP se puede utilizar para visualizar el citoesqueleto traqueal 10.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero en competencia.
Acknowledgments
Damos las gracias a Gillian Stanfield los comentarios sobre el manuscrito. TAJ con el apoyo de la Universidad de Utah Genética Formación subvención T32-GM007464 del NIH NIGMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
References
- Manning, G., Krasnow, M. A.
- Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF. Cell. 99 (2), 211-220 (1999).
- Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis. Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).
- Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation. PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).
- Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system. PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).
- Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila. Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).
- Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth. Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).
- Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization. Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).
- Jones, T. A., Metzstein, M. M. A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster. Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).
- Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila. Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).
- Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting. Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).
