Undersøkelse av Published: July 9, 2013 doi: 10.3791/50496

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Tiffani A Jones¹, Mark M. Metzstein¹

¹Department of Human Genetics, University of Utah

Summary

Her presenterer vi en metode for lysmikroskopi analyse av luftrør terminal celler i

Abstract

Cell formen er kritisk for cellefunksjon. Men til tross for viktigheten av cellemorfologi, er lite kjent om hvordan individuelle celler genererer spesifikke former. Drosophila luftrør terminal celler har blitt et kraftig genetisk modell for å identifisere og belyse rollene til gener som kreves for å generere mobilnettet morfologi. Terminal-celler er en bestanddel av et forgrenet nettverk rørformet, tracheal system som fungerer til å levere oksygen til indre vev. Terminal celler er en utmerket modell for å undersøke spørsmål av cellen form som de har to forskjellige cellulære arkitekturer. Først terminal celler har en forseggjort forgrenet morfologi, i likhet med komplekse nevroner; andre, er terminal celle grener dannet som tynne rør og inneholder en membran-bundet intracellulær lumen. Kvantitativ analyse av terminal celle gren nummer, bransjeorganisasjonen og enkelte bankkontor form, kan brukes til å gi informasjon om rollen til spesifikke genetiske mechanisms i inngåelse av en forgrenet celle. Analyse av røret formasjonen i disse cellene kan avsløre konserverte mekanismer av tubulogenesis felles for andre tubulære nettverk, slik som det vertebrate vaskulatur. Her beskriver teknikker som kan brukes til å raskt fikse, bilde og analysere både forgreninger mønstre og tube dannelse i terminal celler i Drosophila larver. Disse teknikkene kan anvendes for å analysere terminale celler i vill-type og mutante dyr, eller genetiske mosaikk. På grunn av den høye effektiviteten av denne protokollen, er det også godt egnet for genetisk, RNAi-baserte, eller narkotika-skjermer i Drosophila tracheal system.

Introduction

Cell formen er kritisk for funksjonen av individuelle celler i en organisme, så vel som celler som fungerer som en del av et vev eller organ. Vi bruker Drosophila luftrør terminal celler, en komponent av insekt luftveiene, for å undersøke de molekylære mekanismene som deltar i å kontrollere to konserverte typer mobilnettet morfologi: forgrening og tube dannelse (lumenogenesis). Terminal-celler er plassert på tuppen av et nettverk av forgrenede rør som fungerer for å levere oksygen til ^en indre vev og har et omfattende forgrenet morfologi som avhenger av et FGF signalveien som styres av lokale oksygennivå innenfor målvev ^2. Terminal celle grener er tynne rør, med en gassfylt subcellular lumen kjører gjennom hver gren. De forskjellige cellulære arkitekturer av terminal celler, sammen med den enkle der genetiske analyser kan utføres i Drosophila, gjør disse cellene en utmerket modell feller undersøke mekanismer for cellulær utvekst, forgrening, og intracellulær tube formasjon. Terminal celler har vist en nyttig modell for å forstå noen av de signalveier som fører til forgrenet celledifferensiering, utvekst, og modning ^2-4. Ved hjelp av dette systemet objektiv, har frem genetiske skjermer for celle morphogenesis mutanter er utført, gir innsikt i mekanismene som styrer cellen form ^5,6. For eksempel har disse skjermene vist at en spesifikk RabGAP er nødvendig for cytoskeletal polaritet og vesikkel handel med lumen formasjon og posisjonering ^7; som integrin-mediert adhesjon er nødvendig for stabilitet gren ^8, og at epitelial PAR-polaritet proteiner regulere polarisert membran handel kreves for både forgrening og lumen dannelse ^ni. Andre studier i terminal celler har vist at asymmetrisk aktin akkumulering og microtubule organisering er nødvendig for celle tøyelighet og lumenogenesis

Her beskriver vi en metode for å raskt fikse intakt tredje instar Drosophila larver for analyse av terminal celle forgrening og lumen formasjon. Denne protokollen kan også utføres på både første og annen instar dyr. Nøkkelen til denne teknikk er muligheten til å visualisere terminale celler som er genetisk merket med fluorescerende protein ekspresjon direkte gjennom larvestadiet hårstråene av intakte dyr. Siden denne prosedyren krever ingen post-fiksering manipulasjoner, som antistoffarging, for å observere cellene, det er godt egnet til høy throughput analyser, inkludert genetisk eller narkotika screening. Fluorescerende protein uttrykk viser strukturen av cytoplasmically-fylt grener. Tube dannelse kan overvåkes parallelt med lysfelt mikroskop for å identifisere gassfylte hulrom, som kontrast til det omkringliggende væske-filled vev.

Inkludert i denne protokollen er metoden for å generere genetiske mosaikk basert på den MARCM system ^11, for å produsere homozygote mutante terminale celler merket med fluorescerende proteiner i ellers ikke-karakteriserte dyr. Dette er nødvendig, siden terminal celler bare utdype sine komplekse strukturer relativt sent i utviklingen; genetiske mosaikk tillate for bypass av genet krav i andre vev tidligere i utvikling. . Å generere MARCM kloner, er luftrøret merket med luftrør-spesifikk driver andpusten (BTL) ¹² Beskrevet her er protokollen for Drosophila X-kromosomet, for andre kromosomer, kan en lignende fremgangsmåte brukes, med genetiske reagenser hensiktsmessig å kromosomet blir undersøkt. Her blir trachea merket ved ekspresjon av en cytoplasmically lokalisert GFP, men prosedyren fungerer like godt med ekspresjon av andre fluorescerende proteiner, slik som DsRed.

I tillegg har vi tatt med en metode for å kvantifisere forgreninger mønstre og lumen dannelse i terminal celler, basert på metoder utviklet for å karakterisere nevrale avdelingskontorer mønstre ^13. Denne typen kvantitative data kan være avgjørende i kresne presise rolle gener i forgrening eller lumenogenesis prosessen, samt åpner for direkte sammenligninger mellom ulike mutanter ^ni.

Protocol

En. Mosaic Generation

1. Genetisk Cross
   w FRT ^19A kar: GAL80 FLP ¹²² / Y; Btl-Gal4, UAS-GFP (menn) X * FRT ^19A / Bal (kvinner), der * representerer mutant å bli undersøkt. Merk: Sett opp krysser minst en dag før forsøket, da dette gjør at dyrene å parre riktig.
2. Pre-lay: Transfer korset for å fly-food hetteglass med en liten flekk av fersk gjær lim plassert på mediet. Tillat å ligge i 1 time ved 25 ° C.
3. Lay: Overfør dyr fra pre-lay hetteglass til en frisk hetteglass med en liten flekk av fersk gjær lime. Tillat å ligge i 6 timer ved 25 ° C.
4. Overfør voksne tilbake til pre-lay hetteglass for oppbevaring og bruk i senere eksperimenter. Umiddelbart varmesjokk den alminnelige hetteglass inneholdende 0-6 timers gamle embryoer i 45 min ved 38 ° C, i et sirkulerende vannbad. Merk: Overflaten av mat bør være under vann-nivået for å verifisere alleembryoer er riktig varme sjokkert.
5. Inkuber varme sjokkerte ampuller ved 25 ° C i 4-5 dager før tredje instar larvene begynner å vandre.

2. Skjermen for Mosaic Dyr

1. Ved hjelp av fin pinsett forsiktig plukke vandrende tredje-instar larver fra sidene av hetteglasset og plassere dem i kjølt 100% glyserol i en liten plast plate.
2. Undersøk larver ved hjelp av en høy forstørrelse-dissekere mikroskop utstyrt med fluorescerende optikk. Identifisere larver med mosaikk uttrykk for fluorescensmerkede luftrør celler. Vanligvis kan dette gjøres ved 10-20X forstørrelse.

3. Heat Fiksering

1. Ved hjelp av fine tang nøye plukke mosaikk dyr ut av fatet og plasser i en dråpe frisk 100% glyserol på 75x25x1 mm hvitt glass objektglass. Bemerk: flere dyr kan plasseres i dråpen (figur 1A).
   Dyr kan også plasseres i en dråpe av glyserol direkte på et dekkglass,men forsiktighet må tas under fiksering (trinn 3.2), som dyrene vil varme svært raskt og kan bli over-fast.
2. Place glass gli over 70 ° C varme blokk til dyrene bare slutter å bevege seg, ikke mer enn 20 sek for et lysbilde, og 10 sek for et dekkglass (figur 1B). Dyr vil vri seg i utgangspunktet, men stoppe opp og blir stiv og langstrakt gang døde. Merk: overlong eksponering for varme vil skade terminal grener og lumen samt gjøre GFP signal dim og diffuse. For optimal effektivitet, anbefales det å ha varme blokk i samme rom som mikroskoper.
3. Ved hjelp av fin pinsett nøye orientere alle larver i det miste i én retning, slik at alle larver på lysbildet er orientert parallelt med hverandre (figur 1C).
4. Forsiktig plassere en 18x18mm micro cover glass på toppen av larver (eller snu dekkglass på et glass lysbilde) og unngå forming bobler (figur 1D). Merk: dekkglass kan ikke ligge nøyaktigflat enn larver, er dette ikke et problem.
5. Bilde larver innen 30 min. Heat faste terminal celler vil forringe og GFP signal vil bli svært diffus.

4. In vivo avbildning av Tracheal Terminal Cells

1. Plasser lysbildet på scenen av et sammensatt stereomikroskop. Ved hjelp av et objektiv 5X lokalisere de to parallelle dorsal trestammer som går fra fremre til posterior på dorsal-overflaten av dyret (fig. 1F). Finn de to rygg-terminal celler, direkte mellom de to dorsal badebukser. Dette bidrar til å identifisere den aktuelle segmentet for analyse.
2. Når orientert, rotere dyrene til bilde ønskede terminal celler. For å gjøre dette, trykk forsiktig dekkglass på kanten med tang vinkelrett på den lange aksen av larvene, ruller sakte larvene under dekkglass (Tall 1E og 1G).
3. Velge de riktige terminalen cellene er avgjørende for konsistente resultaterog sammenligninger mellom mutanter. Fettet kroppen grenen (FB) terminal celler er lett å finne ved siden av dorsal bagasjerommet, lateralt for midtlinjen. Lateral gruppe G terminal celler (LG) er lett å finne og ligger bare lateral av ventrale midtlinjen (figur 1H). Merk: i de mest anterior (Tr1) og bakre (TR10) segmenter ordningen av terminal celle er avvikende fra andre segmenter. Vi bare analysere terminal celler i segmenter TR2-TR9. Dorsal terminale celler har en mer stereotyp forgrening mønster enn andre tracheal terminale celler. Dette kan avhenge av flere, ikke-celle autonome signaler, og dette bør vurderes når man beslutter å inkludere dem i analysen.
4. Når en terminal celle av interesse har blitt identifisert, ta et bilde med ønsket forstørrelse, vanligvis 10X eller 20X er best (Figur 2A). Merk: På grunn av variable forgreninger mønstre, prøve å ta bilder som inkluderer så mange grener og avdelingskontorer tips som mulig.
5. Uten å flytte scenen, slå av fluorescens og slå på overført lys for å ta et lysfelt bilde av den samme cellen og fokusplanet (figur 2B). Lumen vil bli visualisert som mørke, kontrasterende innenfor terminalen celle plass. Hvis planer om å kvantifisere terminal celle grener og lumen, samle flere bilder i flere fokale plan av hver terminal celle.

5. Analyse og kvantifisering av Terminal cellemorfologi Bruke ImageJ

1. Åpne lysrør og lysfelt bilder med ImageJ ( http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) plug-in NeuronJ ( http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ ).
2. Bruke "Add tracings"-verktøyet, manuelt spore grener og lumen av hele terminalen celle.
3. Bruke "Label tracings"-verktøyet, endre navn og reColor å tilordne hver linje i spor en bestemt betegnelse.
4. Bruke "Set parametere"-verktøyet, må du justere linje bredde fra 6-10 piksler (for 512x512 bilder hentet fra det digitale kameraet koblet til det sammensatte mikroskop. For høyere eller lavere oppløsning kameraer, bør pixel bredden skaleres riktig), ved hjelp av alle andre standardinnstillinger, og velg "OK". Deretter bruker du "Make snapshot" verktøyet for å ta et bilde. Velg "Draw spor" for å få et bilde av det spor som kan vises side om side med den opprinnelige.
5. Velg "Mål tracings"-verktøyet og velg sporing type (dvs. hvilke grener for å måle basert på de spesifikke betegnelser tildelte i trinn 5.3). Deretter velger du "Vis sporing målinger" og "Clear tidligere målinger" klikk "Kjør". Dette vil gi et regneark som inneholder navn, etikett, lengde (i piksler), og andre data for bildet. Disse dataene kan deretter lagres som et Microsoft Excel regneark for videre statistiskanalyse.

Representative Results

Resultatene er vist i figur 2.. En enkelt sideveis gruppe (LG) terminal celle viser omfattende subcellulære forgrening (visualisert ved GFP, A) og en gassfylt subcellulære lumen som går gjennom hver av de grener (visualisert ved lysfelt mikroskopi, B). Disse bildene ble samlet inn fra en mosaikk L3 larve, generert ved hjelp av MARCM systemet beskrevet i pkt. 1 og 2, og varme fast og fotografert, som beskrevet i § § 3 og 4. Paneler C & D viser en NeuronJ generert spor, som beskrevet i kapittel 5, av grenene og lumen henholdsvis av bildene som vises i A & B. Paneler E & F viser plasseringen av fettet kroppen (FB) filial i en larve forberedt for bildebehandling som beskrevet i § § 3 og 4. Legg merke til at i dette eksempel er ikke dyret en mosaikk, og GFP er uttrykt i hele luftrør-system. Paneler G og H viser et eksempel på en GFP-merket terminal celle som var varme-gitt for lang tid. GFP er diffus (G), branches har brutt ned og deler av lumen er ikke lenger gass fylt, og dermed fremstår som brudd i lysfelt bildet.

Figur 1. Larver fremstilling og identifisering av terminale celler. (A) Plass larve i en dråpe 100% glycerol på en glass-slide. (B) Multiple larver kan plasseres for varme-fiksering. (C) Etter varme-fiksering, organisere larver parallelt med hverandre og vinkelrett på den lange aksen av raset. (D) Sett dekslet glass over larver. (E) For å reorientere larver, trykk forsiktig cover glass med pinsett til å rulle dyrene. (F) Wild-type tredje instar larve med GFP uttrykt gjennom den luftrør system. Sammenkoblede rygg badebukser (DT) er synlige på the dorsal side. (G) Den samme larven etter den rullende teknikk med den ventrale siden nå vendt oppover. (H) Diagram av lateral utsikt over to tredje-instar luftrør hemisegments (ett hemisegment er uthevet i grått). Sirkler indikerer lateral gruppe (LG) og fett kroppen (FB) terminal celler som vi bruker for kvantifisering. Stiplede linjer representerer andre grener av luftrør system som vi ikke rutinemessig quantitate. For en fullstendig beskrivelse av luftrør filialer i en larve segment, se Ref ^en.

Figur 2. Representative bilder. (AD) Mosaic L3 larvene ble generert ved hjelp av MARCM teknikk (§ 1) og fast og avbildes med protokollen i § § 2-4. Den forgrening mønster av en enkelt terminal LG celle was visualisert ved mosaikk ekspresjon av GFP (A); de gassfylte hulrom visualisert med lysfelt mikroskopi (B). (C) Tracing av forgrening mønster av cellen i A, generert ved hjelp NeuronJ (§ 5). (D) Tracing av gassfylte hulrom i cellen i B, generert ved hjelp NeuronJ (protokoll § 5). (E, F) Et fett kroppen (FB) terminal celle (markert med rød sirkel) visualisert av GFP uttrykk gjennom luftrør-system (E) og lysfelt mikroskopi (F) i en larve utarbeidet av protokollen i § § 2-4. (G, H) Eksempel fiksering av gjenstander oppnådd når prøven oppvarmes i for lang tid. GFP er diffus og små greiner har degradert (G). Områder i lumen heller ikke lenger vises luftfylt (pilen i H). Scale bar: 100 mikrometer.

Discussion

Varmen fiksering teknikken beskrevet her er en rask og praktisk verktøy for bildebehandling Drosophila larve luftrør terminal celler. Her bruker vi denne teknikken til å undersøke forgrening og lumen mønster av vill type celler. Luftrør celler uttrykker GFP, drevet av luftrør promoter andpusten, kan lett visualiseres gjennom larve cuticle etter varme fiksering. De spesifikke forgreninger mønstre av individuelle terminal-celler, så vel som de av de luftfylte hulrom, idet kan raskt visualisert og målt ved hjelp av denne metoden. Denne teknikken kan også bli utført på både første og andre instar larver. Imidlertid må man være forsiktig i å fikse mindre dyr, som fluorescerende protein uttrykk kan lett bli forstyrret.

I metoden vist her beskriver vi en analyse av mosaikk dyr med GFP uttrykt i enkle luftrør celler. De samme teknikker er anvendbare for analyse av tracheal cellene under et number av eksperimentelle manipulasjoner. For eksempel dyr der genuttrykk har blitt endret av molekylære metoder, gjennom luftrør systemet eller i individuelle celler ved uttrykk for RNAi transgener eller modifiserte proteiner, kan også bli undersøkt med denne tilnærmingen. Ikke-genetiske behandlinger som påvirker terminal celle utvikling, som for eksempel narkotika eller hypoksi ^2,14, kan også karakteriseres ved hjelp av disse metodene. I disse sistnevnte tilfeller er det nødvendig å starte med en Drosophila lager konstitutivt uttrykker GFP eller en annen fluorescerende protein i hele sin tracheal system for å visualisere forgrening mønstre. Gass-fylling kan undersøkes uavhengig av fluorescerende protein uttrykk.

Her viser vi bare eksempler på umerket (cytoplasmically lokalisert) GFP blir brukt til merking av luftrør system. Men de fremgangsmåter som er beskrevet her er også egnet for påvisning av andre innfødte fluorescerende proteiner, slik som DsRed, samt fluorescerende proteins som har blitt modifisert til å være lokalisert til spesifikke subcellulære strukturer. For eksempel, actin: GFP eller tubulin: kan GFP fusjoner brukes til å visualisere tracheal cytoskeleton ^10.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Student Dumont #5 forceps	Fine Scientific Tools	91150-20
Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent)	Leica	MZ16
AxioImager M1 compound microscope (or equivalent)	Carl Zeiss		Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE
100% Glycerol	BioExpress	M152-4L
Fly stock			Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A
Fly stock			Genotype: y w FRT19A