Summary
Hier presenteren we een methode voor lichtmicroscopie analyse van tracheale terminal cellen in
Abstract
Cel vorm is van cruciaal belang voor de celfunctie. Echter, ondanks het belang van de cel morfologie, is weinig bekend over hoe individuele cellen te genereren specifieke vormen. Drosophila tracheale terminal cellen een krachtig genetisch model te identificeren en verhelderen van de rollen van genen die nodig zijn voor het genereren van cellulaire morfologie zijn geworden. Terminal cellen zijn een onderdeel van een vertakte buisvormige netwerk, de tracheale systeem dat functioneert zuurstof naar interne weefsels. Terminale cellen zijn een uitstekend model voor het onderzoeken van de vragen van de cel vorm als ze beschikken over twee verschillende cellulaire architecturen. Eerste, terminale cellen hebben een uitgebreid vertakte morfologie, vergelijkbaar met complexe neuronen, ten tweede, zijn terminal cel takken gevormd als dunne buizen en bevatten een membraan-gebonden intracellulaire lumen. Kwantitatieve analyse van terminale cellen filiaalnummer, branch organisatie als filialen vorm, kan worden gebruikt om informatie over de rol van specifieke genetische mech biedennismen in het maken van een vertakte cel. Analyse van buisvorming in deze cellen kan onthullen geconserveerde mechanismen tubulogenesis bij andere buisvormige netwerken, zoals de vertebraat vaatstelsel. Hier beschrijven we technieken die kunnen worden gebruikt om snel oplossen, beeld en analyseren zowel vertakkingspatronen en vaatvorming in terminal cellen in Drosophila larven. Deze technieken kunnen worden gebruikt om cellen te analyseren terminal in wild-type en mutante dieren of genetische mozaïeken. Vanwege het hoge rendement van dit protocol, is het ook zeer geschikt voor genetische, RNAi-gebaseerde, of drug-schermen in het Drosophila tracheale systeem.
Introduction
Celvorm is cruciaal voor de functie van afzonderlijke cellen in een organisme, alsook cellen die als onderdeel van een weefsel of orgaan. We gebruiken Drosophila tracheale cellen terminal, een component van het insect luchtwegen, de moleculaire mechanismen die aan de controle twee geconserveerde types van cellulaire morfologie onderzoeken: vertakking en buisvorming (lumenogenesis). Terminal cellen zich aan de uiteinden van een netwerk van vertakte buizen die functies zuurstof aan interne weefsels 1 en hebben een uitgebreide vertakte morfologie die afhangt van een FGF signaling pathway die wordt bestuurd door de lokale zuurstofconcentratie in doelweefsels 2. Terminale cel takken zijn dunne buisjes, met een gasgevulde subcellulaire lumen loopt door elke tak. De van cellulaire architectuur van terminale cellen, samen met het gemak waarmee genetische analyse kan worden uitgevoerd in Drosophila, maken deze cellen een uitstekend model fof onderzoeken van mechanismen van cellulaire uitgroei, vertakking, en intracellulaire buis formatie. Terminale cellen hebben een bruikbaar model voor het begrijpen van een aantal van de signaalwegen die leiden tot vertakte celdifferentiatie, uitgroei en rijping 2-4 bewezen. Met behulp van dit systeem onpartijdige, zijn forward genetische schermen voor mobiele morfogenese mutanten uitgevoerd, waardoor inzicht in mechanismen die de cel vorm 5,6. Zo hebben deze schermen gebleken dat een bepaald RabGAP vereist voor cytoskelet polariteit en vesicle handel in lumen vorming en positionering 7, dat integrine-gemedieerde hechting vereist voor branch stabiliteit 8, en die PAR-epitheliale polariteit eiwitten reguleren gepolariseerde membraantransport vereist zowel vertakking en lumen vorming 9. Andere studies in terminal cellen hebben aangetoond dat asymmetrische actine accumulatie en microtubuli organisatie is nodig voor cel-rek en lumenogenesis Hier beschrijven we een methode om snel te repareren intact derde instar Drosophila larven voor de analyse van de terminal cel vertakking en lumen vorming. Dit protocol kan ook worden uitgevoerd op zowel eerste als tweede instar dieren. Sleutel tot deze techniek is de mogelijkheid om terminal cellen die genetisch gemerkt door fluorescerend eiwit expressie rechtstreeks via de larvale cuticula van intacte dieren te visualiseren. Aangezien deze procedure vereist geen post-fixatie manipulaties, zoals antilichaam kleuring, de cellen nemen, is het geschikt voor hoge doorvoer analyse, waaronder genetische of drug screening. Fluorescent eiwitexpressie toont de structuur van het cytoplasmatisch gevulde takken. De buisvorming kan worden gecontroleerd parallel met helderveld microscopie gas gevulde lumen, die afwijkt van de omringende vloeistof-vul identificerened weefsels. Inbegrepen in dit protocol is de methode voor het genereren van genetische mozaïeken gebaseerd op het marcm systeem 11, om homozygote mutant terminal cellen gelabeld met fluorescerende eiwitten in andere niet-gemerkte dieren produceren. Dit is nodig, omdat terminal cellen alleen werken hun complexe structuren relatief laat in de ontwikkeling; genetische mozaïeken zorgen voor bypass van gen-eisen in andere weefsels eerder in ontwikkeling. . Om marcm klonen te genereren, zijn luchtpijp geëtiketteerd met de tracheale-specifieke driver ademloos (BTL) 12 Beschreven hier is het protocol voor de Drosophila X-chromosoom, voor andere chromosomen, kan een soortgelijke procedure worden toegepast, met genetische reagentia geschikt om het chromosoom zijn onderzocht. Hier trachea worden gelabeld door expressie van een cytoplasmatisch gelokaliseerde GFP, maar de procedure werkt even goed met de expressie van andere fluorescerende eiwitten, zoals DsRed. Daarnaast hebben we een methode vertakkingspatronen en vorming lumen kwantificeren terminal cellen, gebaseerd op technieken ontwikkeld voor de karakterisering van neuronale branch patronen 13. Dit soort van kwantitatieve data kan kritisch zijn in het onderscheiden van de precieze rol van genen in de vertakking of lumenogenesis proces evenals waardoor directe vergelijkingen tussen verschillende mutanten 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mozaïek Generation
- Genetische Cross
w FRT 19A bad: GAL80 FLP 122 / Y; Btl-GAL4, UAS-GFP (mannetjes) X * FRT 19A / Bal (vrouwtjes), waarbij * de mutant te worden onderzocht. Opmerking: Stel voorafgaand aan experiment ten minste een dag, omdat dit mogelijk maken de dieren adequaat te paren. - Pre-lay: Transfer kruis te vliegen-food flesjes met een klein uitstrijkje van verse gist pasta geplaatst op de media. Laat leggen gedurende 1 uur bij 25 ° C.
- Lay: Transfer dieren uit de pre-lay flacon een nieuwe flacon met een kleine uitstrijkje van verse gist pasta. Laten leggen voor 6 uur bij 25 ° C.
- Transfer volwassenen terug naar pre-lay flacon voor opslag en gebruik in de volgende experimenten. Onmiddellijk hitteschok de lay flacon met 0-6 uur oud embryo gedurende 45 min bij 38 ° C, in een circulerend waterbad. Opmerking: Het oppervlak van het eten moet worden onder het waterniveau te controleren alleembryo's op de juiste wijze te verwarmen geschokt.
- Incubeer warmte geschokt flesjes bij 25 ° C gedurende 4-5 dagen tot derde instar larven beginnen te dwalen.
2. Scherm voor Mosaic Dieren
- Met behulp van fijne tang voorzichtig pick zwerven derde instar larven van de zijkanten van de flacon en plaats ze in gekoelde 100% glycerol in een klein plastic plaat.
- Onderzoeken larven met behulp van een hoge vergroting-dissectiemicroscoop uitgerust met fluorescerende optica. Identificeer larven met mozaïek expressie van fluorescent gelabelde tracheale cellen. Meestal kan dit worden gedaan op 10-20X vergroting.
3. Warmte Fixatie
- Met behulp van fijne tang zorgvuldig te kiezen mozaïek dieren uit de schotel en plaats in een daling van verse 100% glycerol op een 75x25x1 mm wit glas microscoopglaasje. Opmerking: meerdere dieren kunnen in de drop (figuur 1A) worden geplaatst.
Dieren kunnen ook een druppel glycerol geplaatst direct op een dekglaasje,maar zorg moet worden genomen tijdens fixatie (stap 3.2), als de dieren zal zeer snel opwarmen en kan over-vast geworden. - Plaats glasplaatje op 70 ° C hitte blok totdat de dieren gewoon stoppen met bewegen, niet meer dan 20 seconden voor een dia, en 10 seconden voor een dekglas (Figuur 1B). Dieren zullen kronkelen aanvankelijk maar stoppen en rigide en langwerpig eens dood. Opmerking: te lange blootstelling aan hitte zal terminal takken en lumen beschadigen en maken het GFP-signaal zwak en diffuus. Voor een optimale efficiëntie is het aanbevolen om de warmte-blok hebben in dezelfde ruimte als de microscopen.
- Met behulp van fijne pincet voorzichtig oriënteren alle larven in de daling in een enkele richting, zodanig dat alle larven op de dia zijn evenwijdig aan elkaar (figuur 1C).
- Plaats voorzichtig een 18x18mm micro dekglas op de top van de larven (of keren de dekglaasje op een glasplaatje) en vermijd het vormen van luchtbellen (figuur 1D). Opmerking: dekglaasje kan niet precies liggenplat op larven, dit is geen probleem.
- Afbeelding larven binnen 30 minuten. Warmte vaste terminal cellen zullen degraderen en GFP signaal zal zeer diffuus geworden.
4. In vivo beeldvorming van Tracheale Terminal Cells
- Plaats dia op het podium van een verbinding stereomicroscoop. Met behulp van een 5X objectieve zoek naar de twee evenwijdige dorsale boomstammen loopt van anterior naar posterior op het dorsale oppervlak van het dier (Figuur 1F). Zoek de twee dorsale terminale cellen, rechtstreeks tussen de twee dorsale stammen. Dit helpt de geschikte segment voor analyse.
- Eenmaal georiënteerd, draai de dieren op de foto om de gewenste aansluiting cellen. Hiervoor Duw het dekglaasje op de rand met de tang loodrecht op de lengteas van de larven, langzaam rollen de larven onder het dekglaasje (Figuren 1E en 1G).
- Het selecteren van de juiste terminal cellen is essentieel voor consistente resultatenen vergelijkingen tussen mutanten. De dikke lichaam tak (FB)-aansluiting cellen zijn gemakkelijk te vinden naast de dorsale stam, lateraal van de middellijn. De laterale groep G terminal cellen (LG) zijn gemakkelijk te vinden en liggen net lateraal van de ventrale middellijn (figuur 1 H). Opmerking: in de meeste anterior (Tr1) en achterste (TR10) segmenten van de opstelling van de terminal cel is divergent van andere segmenten. Wij analyseren enige terminal cellen in segmenten Tr2-TR9. Dorsale terminale cellen hebben een meer stereotiepe takstand dan andere tracheale terminale cellen. Dit kan afhankelijk zijn van aanvullende, niet-cel-autonome signalen, en dit moet worden overwogen bij de beslissing of ze op te nemen in de analyse.
- Zodra een terminale cel van belang is geïdentificeerd, een opname met de gewenste vergroting, meestal 10X of 20X is het beste (Figuur 2A). Opmerking: als gevolg van variabele vertakking patronen, probeer beelden die zo veel takken en takuiteinden mogelijk zijn vast te leggen.
- Zonder het verplaatsen van het podium, schakel de fluorescentie en zet het doorgelaten licht een helderveld beeld van dezelfde cel en focal plane (Figuur 2B) vast te leggen. Het lumen wordt gevisualiseerd als donkere, contrasterende binnen de terminal celruimte. Als plan kwantificeren terminal cel takken en lumen, verzamel meerdere afbeeldingen in meerdere focale vlakken van elke terminal cel.
5. Analyse en kwantificering van Terminal Celmorfologie behulp ImageJ
- Open de TL-en helderveld beelden met de ImageJ ( http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) plug-in NeuronJ ( http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ ).
- Behulp van de functie "Add traces", handmatig de takken en lumen van de gehele terminal cel traceren.
- Functie "Label traces", hernoemen en reColor aan elke lijn toe te wijzen binnen het trace een specifieke aanduiding.
- Behulp van de functie "Set-parameters", stel de lijndikte 6-10 pixels (voor 512x512 beelden verkregen van de digitale camera is aangesloten op de samengestelde microscoop. Voor hogere of lagere resolutie camera's, moet de pixelbreedte passende wijze worden geschaald), met behulp van alle andere standaardinstellingen en kies "OK". Maak dan gebruik van de functie "Make snapshot" om een beeld te nemen. Kies "Draw trace" om een momentopname van het spoor dat kan worden aangetoond side-by-side met het origineel te krijgen.
- Selecteer de functie "Meet traces" en selecteer het opsporen soort (dwz die takken te meten op basis van de specifieke aanduidingen toegewezen in stap 5.3). Selecteer vervolgens "Toon tracing metingen" en "Clear eerdere metingen" en klik op "RUN". Dit zal een werkblad met de naam, label, lengte (in pixels), en andere gegevens voor de afbeelding bevat produceren. Deze gegevens kunnen vervolgens worden opgeslagen als een Microsoft Excel-spreadsheet voor verdere statistischeanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten worden getoond in Figuur 2. Een laterale groep (LG) terminal cel geeft uitgebreide subcellulair vertakking (gevisualiseerd door GFP, A) en een gas-gevulde subcellulaire lumen die door elk van de takken (gevisualiseerd door helderveld microscopie, B). Deze beelden werden verzameld uit een mozaïek L3 larve, gegenereerd met behulp van het marcm systeem in de paragrafen 1 en 2 beschreven, en de warmte vast en afgebeeld, zoals beschreven in de hoofdstukken 3 en 4. Panelen C & D tonen een NeuronJ gegenereerd respectievelijk spoor, zoals beschreven in hoofdstuk 5, van de takken en het lumen van de getoonde afbeeldingen in A & B. Panelen E & F tonen de locatie van het dikke lichaam (FB) tak in een larve voorbereid voor de beeldvorming, zoals beschreven in de paragrafen 3 en 4. Merk op dat in dit voorbeeld is het dier niet een mozaïek en GFP expressie het gehele tracheale systeem. Panelen G en H tonen een voorbeeld van een GFP-gelabelde terminale cel die was te lang een tijd vast hitte. GFP is diffuus (G), branches hebben afgebroken en delen van lumen zijn niet meer met gas gevuld, dus verschijnen als onderbrekingen in beeld de helderveld.
Figuur 1. Larven voorbereiding en identificatie van de terminal cellen. (A) Plaats larve in een daling van 100% glycerol op een glasplaatje. (B) meerdere larven worden geplaatst voor thermofixatie. (C) Na thermofixatie, dient larven parallel aan elkaar en loodrecht op de lengteas van de dia. (D) Plaats deksel glas over larven. (E) Voor larven heroriënteren, duw dekking van glas met een tang om de dieren te rollen. (F) Wildtype derde instar larve met GFP in de hele tekst de tracheale systeem. De gepaarde dorsale boomstammen (DT) zijn zichtbaar op the dorsale zijde. (G) Dezelfde larve na de rollende techniek met de buikzijde nu naar boven. (H) Diagram van zijaanzicht van twee derde instar tracheale hemisegments (een hemisegment wordt grijs gemarkeerd). Cirkels geven laterale groep (LG) en dikke lichaam (FB) terminal cellen die we gebruiken voor de kwantificering. Stippellijnen vertegenwoordigen andere takken van de tracheale systeem dat we niet routinematig te kwantificeren. Voor een volledige beschrijving van de tracheale takken in een larvale segment, zie Ref 1.
Figuur 2. Representatieve afbeeldingen. (AD) Mozaïek L3 larven werden gegenereerd met behulp van de marcm techniek (deel 1) en gefixeerd en beeld gebracht met behulp van het protocol in de punten 2-4. De vertakking patroon van een enkele LG terminal cel was gevisualiseerd door mozaïek expressie van GFP (A), het gas-gevulde lumen gevisualiseerd met helderveld microscopie (B). (C) Het opsporen van de vertakking patroon van de cel in A, gegenereerd met behulp NeuronJ (hoofdstuk 5). (D) Het opsporen van de gasgevulde lumen van de cel in B, gegenereerd met behulp NeuronJ (protocol hoofdstuk 5). (E, F) Een dikke lichaam (FB) aansluiting cel (gemarkeerd door de rode cirkel) gevisualiseerd door GFP expressie in de tracheale systeem (E) en helderveld microscopie (F) in een larve opgesteld door het protocol in de punten 2-4. (G, H) Voorbeeld van fixatie artefacten verkregen wanneer het monster wordt gedurende een te lange periode. GFP is diffuus en kleine takken afgebroken (G). Gebieden van lumen ook niet meer weergegeven lucht gevulde (pijl in H). Schaalbalk: 100 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De thermofixatie hier beschreven techniek is een snel en handig hulpmiddel voor beeldvorming Drosophila larven tracheale terminale cellen. Hier gebruiken we deze techniek de vertakking en lumen patroon van wildtype cellen onderzocht. Tracheale cellen die GFP, gedreven door de tracheale specifieke promotor ademloos, kan eenvoudig worden gevisualiseerd door het larvale cuticula na thermofixatie. De specifieke vertakking patronen van afzonderlijke terminal cellen, evenals die van de met lucht gevulde lumen, kan snel worden gevisualiseerd en zo gemeten. Deze techniek kan ook worden uitgevoerd op zowel eerste als tweede instar larven. Maar zorg moet worden genomen bij de vaststelling van kleinere dieren, zoals fluorescerend eiwit expressie kan gemakkelijk worden verstoord.
In de hier getoonde methode, beschrijven we een analyse van mozaïek dieren met GFP uitgedrukt in enkele tracheale cellen. Echter, dezelfde technieken voor analyse van tracheale cellen onder een number van experimentele manipulaties. Bijvoorbeeld, dieren waarin genexpressie wordt veranderd door moleculaire benaderingen in de tracheale systeem of in afzonderlijke cellen door expressie van RNAi transgenen of gewijzigde eiwitten kan worden onderzocht met deze benadering. Niet-genetische behandelingen die terminal celontwikkeling, zoals geneesmiddelen of hypoxie 2,14 beïnvloeden, kunnen ook worden gekarakteriseerd met behulp van deze methoden. In deze laatste gevallen is het nodig om te beginnen met een Drosophila stock constitutief GFP of een ander fluorescerend eiwit in de tracheale systeem om te visualiseren vertakkingspatronen. Gas-vulling kan van fluorescerend eiwit expressie worden onderzocht, ongeacht.
Hier hebben we alleen voorbeelden van niet-gecodeerde (cytoplasmatisch gelokaliseerd) GFP wordt gebruikt voor het merken van de tracheale systeem. De hier beschreven werkwijzen zijn ook geschikt voor de detectie van andere natieve fluorescerende eiwitten, zoals DsRed, alsmede fluorescent proeiwitten die werden aangepast om te worden gelokaliseerd op specifieke subcellulaire structuren. Bijvoorbeeld, actine: GFP of tubuline: GFP-fusies kunnen worden gebruikt om de tracheale cytoskelet 10 visualiseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financieel belang.
Acknowledgments
Wij danken Gillian Stanfield voor commentaar op het manuscript. TAJ wordt ondersteund door de Universiteit van Utah Genetics Training Grant T32-GM007464 van NIH NIGMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
References
- Manning, G., Krasnow, M. A.
- Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF. Cell. 99 (2), 211-220 (1999).
- Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis. Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).
- Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation. PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).
- Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system. PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).
- Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila. Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).
- Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth. Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).
- Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization. Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).
- Jones, T. A., Metzstein, M. M. A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster. Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).
- Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila. Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).
- Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting. Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).
