Summary
Ici, nous présentons une méthode pour l'analyse de microscopie optique des cellules trachéales terminaux en
Abstract
la forme des cellules est essentiel pour la fonction cellulaire. Cependant, malgré l'importance de la morphologie des cellules, on en sait peu sur la façon dont les cellules individuelles génèrent des formes spécifiques. Cellules terminales trachéales drosophile sont devenus un modèle génétique puissant pour identifier et élucider les rôles des gènes nécessaires pour générer des morphologies cellulaires. des cellules de bornes sont un composant d'un réseau tubulaire ramifiée, le système trachéal qui fonctionne pour fournir de l'oxygène aux tissus internes. cellules terminales sont un excellent modèle pour étudier les questions de la forme des cellules car ils possèdent deux architectures cellulaires distincts. Tout d'abord, les cellules terminales ont une morphologie ramifiée complexe, semblable à des neurones complexes, deuxièmement, branches de cellules terminales sont formées comme des tubes minces et contiennent une lumière intracellulaire membranaire. L'analyse quantitative de nombre de succursales de la cellule terminale, l'organisation de la branche et la forme de la branche individuelle, peut être utilisé pour fournir des informations sur le rôle de mech génétique spécifiquenismes dans la fabrication d'une cellule ramifiée. L'analyse de la formation du tube dans ces cellules peuvent révéler des mécanismes conservées de tubulogenèse communs à d'autres réseaux tubulaires, tels que le système vasculaire vertébré. Nous décrivons ici les techniques qui peuvent être utilisés pour fixer rapidement, l'image et analyser à la fois les modèles de branchement et la formation de tubes dans les cellules de terminaux au sein de larves de drosophile. Ces techniques peuvent être utilisées pour analyser les cellules terminales chez les animaux de type sauvage et mutant, ou des mosaïques génétiques. En raison de la grande efficacité de ce protocole, il est également bien adapté pour les écrans de drogue dans le système trachéal Drosophila génétique, basées sur l'ARNi, ou.
Introduction
la forme des cellules est essentiel pour la fonction de cellules individuelles au sein d'un organisme, ainsi que des cellules qui fonctionnent comme une partie d'un tissu ou d'organe. Nous utilisons des cellules terminales trachée chez la drosophile, une composante du système respiratoire des insectes, pour étudier les mécanismes moléculaires qui participent à contrôler deux types conservées de la morphologie cellulaire: L'éclaircie et la formation du tube (lumenogenesis). cellules de terminaux sont situés à l'extrémité d'un réseau de tubes ramifiés qui sert à fournir de l'oxygène aux tissus internes 1 et ont une morphologie ramifiée complexe qui dépend d'une voie de signalisation FGF qui est contrôlée par les niveaux d'oxygène dans les tissus locaux cibles 2. branches de la cellule de terminaux sont des tubes minces, avec un gaz remplies de lumière sub-cellulaires fonctionnant par chaque branche. Les architectures cellulaires distincts de cellules terminales, ainsi que la facilité avec laquelle l'analyse génétique peut être réalisée chez la drosophile, font de ces cellules un excellent modèle fou mécanismes d'excroissance cellulaire enquête, la ramification et la formation du tube intracellulaire. cellules terminales sont avérés un modèle utile pour comprendre certaines des voies de signalisation conduisant à la différenciation cellulaire ramifiée, excroissance, et la maturation 2-4. Grâce à ce système impartial, écrans avant génétiques pour mutants de morphogenèse cellulaires ont été réalisées, ce qui donne un aperçu des mécanismes de contrôle de la forme des cellules 5,6. Par exemple, ces écrans ont révélé qu'un RabGAP spécifique est nécessaire pour la polarité du cytosquelette et le trafic vésiculaire dans la formation de lumière et de positionnement 7; que l'adhésion médiée par l'intégrine est nécessaire pour la stabilité de la branche 8, et que les protéines PAR-polarité épithéliale réguler le trafic membranaire polarisée requis à la fois pour la ramification et formation de lumière 9. D'autres études dans des cellules de terminaux ont montré que l'accumulation d'actine asymétrique et l'organisation des microtubules est nécessaire à l'élongation cellulaire et lumenogenesis Ici, nous décrivons une méthode pour fixer rapidement intact troisième stade larves de drosophile pour l'analyse des cellules ramification de terminal et formation de lumière. Ce protocole peut aussi être réalisée à la fois premier et deuxième animaux de stade. La clé de cette technique est la possibilité de visualiser les cellules terminales qui sont génétiquement marquées par l'expression de la protéine fluorescente directement à travers la cuticule des larves d'animaux intacts. Depuis que cette procédure ne nécessite pas de manipulations post-fixation, tels que la coloration d'anticorps, d'observer les cellules, il est bien adapté à l'analyse à haut débit, y compris le dépistage génétique ou de drogue. Expression de la protéine fluorescente révèle la structure des branches cytoplasme remplis. la formation du tube peut être contrôlée en parallèle en utilisant la microscopie à champ clair d'identifier la lumière remplie de gaz, ce qui contraste avec le fluide environnant-filltissus éd. Inclus dans ce protocole est la méthode pour générer des mosaïques génétiques basés sur le système marcm 11, pour produire des cellules mutantes homozygotes terminaux étiquetés avec des protéines fluorescentes dans les animaux autrement non étiquetés. Cela est nécessaire, car les cellules terminales seulement élaborer leurs structures complexes relativement tard dans le développement; mosaïques génétiques permettent de contournement des exigences de gènes dans d'autres tissus plus tôt dans le développement. . Pour générer des clones marcm, de la trachée sont étiquetés en utilisant le pilote spécifique à bout de souffle trachéal (BTL) 12 décrit ici est le protocole pour le chromosome X chez la drosophile, car d'autres chromosomes, une procédure similaire peut être utilisée, avec des réactifs génétique approprié au chromosome étant examiné. Ici, la trachée sont marquées par l'expression d'une GFP localisée dans le cytoplasme, mais la procédure fonctionne aussi bien avec l'expression d'autres protéines fluorescentes, comme DsRed. En outre, nous avons inclus une méthode pour quantifier les schémas de branchement et la formation de lumière dans les cellules terminales, basée sur des méthodes développées pour déterminer les caractéristiques de la branche neuronales 13. Ce genre de données quantitatives peut être critique pour discerner le rôle exact de gènes dans le processus de branchement ou lumenogenesis, ainsi que de permettre des comparaisons directes entre les différents mutants 9.
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Protocol
1. Mosaic Generation
- Génétique Croix
w FRT 19A bain: GAL80 FLP 122 / Y; Btl-GAL4, UAS-GFP (mâles) X * FRT 19A / Bal (femelles), où * représente le mutant à examiner. Note: Mettre en place traverser au moins un jour avant l'expérience, car cela permet aux animaux de s'accoupler de façon appropriée. - Pré-lay: croix de transfert des flacons voler alimentaires avec une petite tache de pâte de levure fraîche placé sur le support. Laisser poser pendant 1 heure à 25 ° C.
- Lay: animaux de transfert de pré-mise flacon à un nouveau flacon avec une petite tache de pâte de levure fraîche. Laisser poser pendant 6 heures à 25 ° C.
- adultes de transfert retour à pré-Lay flacon pour le stockage et l'utilisation dans des expériences ultérieures. Choc thermique immédiatement le flacon laïque contenant 0-6 h embryons pendant 45 min à 38 ° C, dans un bain d'eau en circulation. Remarque: La surface de l'aliment devrait être en dessous du niveau de l'eau pour vérifier tousembryons sont correctement choc thermique.
- Incuber les flacons choc thermique à 25 ° C pendant 4-5 jours jusqu'à la troisième larves commencent à se promener.
2. Écran pour Mosaic Animaux
- En utilisant des pinces fines ramasser doucement errance larves de troisième stade larvaire sur les côtés du flacon et placez-les dans réfrigéré 100% de glycérol dans une petite plaque en plastique.
- Examiner les larves à l'aide d'un microscope grossissement dissection haut équipé d'optiques fluorescentes. Identifier les larves avec l'expression de la mosaïque de cellules trachéales marquées par fluorescence. Typiquement, cela peut être fait à 10 grossissement de 20x.
3. Fixation de la chaleur
- En utilisant des pinces fines choisir soigneusement les animaux de mosaïque sur le plat et le placer dans une goutte de frais 100% de glycérol sur un mm verre blanc lame de microscope 75x25x1. Remarque: plusieurs animaux peuvent être placés dans la liste (figure 1A).
Les animaux peuvent également être placés dans une goutte de glycérine directement sur une lamelle,mais il faut faire attention lors de la fixation (étape 3.2), que les animaux vont chauffer très rapidement et peuvent devenir trop fixe. - Placer la lame de verre sur 70 ° bloc thermique C jusqu'à ce que les animaux s'arrête pas bouger, pas plus de 20 secondes pour une diapositive, et 10 sec pour une lamelle (figure 1B). Les animaux se soustraire au départ, mais arrêter et devenir rigide et allongé une fois mort. Note: exposition trop longue à la chaleur peut endommager les branches terminales et lumières ainsi que de faire le signal GFP faible et diffus. Pour une efficacité optimale, il est recommandé d'avoir le bloc de chaleur dans la même pièce que les microscopes.
- Utilisation de pinces fines soin d'orienter toutes les larves à la baisse dans une seule direction, de telle sorte que toutes les larves sur la lame sont orientées parallèlement les unes aux autres (figure 1C).
- Placez délicatement une lamelle micro 18x18mm au-dessus de larves (ou inverser la lamelle sur une lame de verre) et éviter les bulles en forme (figure 1D). Note: lamelle ne peut trouver exactementplat sur les larves, ce n'est pas un problème.
- Les larves de l'image dans 30 min. Cellules terminales fixes chaleur va se dégrader et le signal de GFP deviendront très diffuse.
4. L'imagerie in vivo de cellules terminales trachéales
- Placer la lame sur la scène d'un microscope stéréoscopique composé. L'utilisation d'un objectif 5x localiser les deux troncs dorsaux parallèles qui courent d'avant en arrière sur la face dorsale de l'animal (figure 1F). Repérez les deux cellules terminales dorsales, directement entre les deux troncs dorsaux. Cela permet d'identifier le segment approprié pour l'analyse.
- Une fois orienté, tournez les animaux Image cellules terminales désirées. Pour ce faire, poussez délicatement la lamelle sur le bord avec les forceps perpendiculaires à l'axe longitudinal de la larve, en roulant lentement les larves sous la lamelle (figures 1E et 1G).
- Sélection des cellules terminales appropriées est essentiel pour des résultats constantset les comparaisons entre les mutants. Cellules terminales au Service de la graisse corporelle (FB) sont faciles à trouver à côté du tronc dorsal, latéral de la ligne médiane. Les cellules de la borne G du groupe latérales (LG) sont faciles à trouver et sont situés juste en dehors de la ligne médiane ventrale (figure 1H). Remarque: en (RT10) les segments les plus antérieures (Tr1) et postérieure la disposition de la cellule de terminal est divergente des autres segments. Nous n'analysons cellules terminales des segments TR2-Tr9. Cellules terminales dorsales ont un schéma de branchement plus stéréotypée que les autres cellules terminales trachéales. Cela peut dépendre de signaux autonomes supplémentaires, non-cellulaires, et cela devrait être considéré au moment de décider de les inclure dans l'analyse.
- Une fois qu'une cellule terminale d'intérêt a été identifié, capturer une image en utilisant le grossissement souhaité, typiquement 10X ou 20X est meilleur (figure 2A). Note: en raison d'une ramification variables, essayer de capturer des images qui comprennent autant de branches et des conseils de succursales que possible.
- Sans bouger la scène, éteindre la fluorescence et allumer la lumière transmise pour capturer une image en fond clair de la même cellule et le plan focal (figure 2B). La lumière sera visualisé comme sombre contrastant à l'intérieur de l'espace de cellule de terminal. Si la planification de quantifier les branches et les lumens des cellules terminales, de recueillir des images multiples dans plusieurs plans focaux de chaque cellule de terminal.
5. L'analyse et la quantification des terminal morphologie cellulaire en utilisant ImageJ
- Ouvrez les images fluorescentes et brightfield utilisant le ImageJ ( http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) plug-in NeuronJ ( http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ ).
- Utilisation de l'outil «tracés Ajouter", tracer manuellement les branches et la lumière de la cellule terminale entier.
- Utilisation de l'outil «tracés d'étiquettes", renommer et recolor d'attribuer à chaque ligne dans la trace d'une désignation spécifique.
- Utilisation de l'outil "Set paramètres", ajuster la largeur de la ligne 6 à 10 pixels (pour 512x512 images issues de la caméra numérique reliée au microscope composé. Pour les caméras de résolution supérieure ou inférieure, la largeur de pixel doit être réduite de façon appropriée), en utilisant tous d'autres paramètres par défaut et cliquez sur "OK". Ensuite, utilisez la fonction "Faire instantané» pour prendre une image. Choisissez «Dessine trace" pour obtenir un instantané de la trace qui peuvent être indiquées côte-à-côte avec l'original.
- Sélectionnez l'outil «tracés de mesure» et sélectionnez le type de traçage (ie qui se ramifie à mesure fondée sur les désignations spécifiques assignées à l'étape 5.3). Ensuite, sélectionnez "Afficher les mesures de traçage" et "les mesures précédentes claires" puis cliquez sur "Exécuter". Ceci va produire une feuille de calcul qui contient le nom, l'étiquette, la longueur (en pixels) et d'autres données de l'image. Ces données peuvent ensuite être enregistrées dans un tableur Microsoft Excel pour plus de statistiquesanalyse.
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Representative Results
Les résultats sont présentés dans la figure 2. Un groupe latéral unique (LG) de la cellule terminale montre très étendue ramification subcellulaire (visualisé par la GFP; A) et rempli de gaz subcellulaires lumière traversant chacune des branches (visualisées par microscopie en fond clair, B). Ces images ont été recueillies à partir d'une mosaïque L3 larve, généré en utilisant le système de marcm décrit dans les sections 1 et 2, et de la chaleur fixes et imagés, tels que décrits dans les sections 3 et 4. Les panneaux C et D montrent une trace NeuronJ généré, tel que décrit dans la section 5, des branches et la lumière respectivement des images présentées dans A et B. Les panneaux E et F montrer l'emplacement de la masse grasse corporelle (FB) de branche dans une larve préparé pour l'imagerie comme décrit dans les sections 3 et 4. Notez que dans cet exemple, l'animal n'est pas une mosaïque, et la GFP est exprimée à travers l'ensemble du système trachéal. Panneaux G et H montrent un exemple d'une cellule terminale GFP-étiquetée qui était fixé chaleur pendant trop longtemps. GFP est diffus (G), branches sont effondrées et des parties de lumens ne sont plus remplis de gaz, apparaissant ainsi comme des ruptures dans l'image de fond clair.
Figure 1. préparation des larves et l'identification des cellules terminales. (A) place larve dans une goutte de 100% de glycérol sur une lame de verre (B). larves multiple peut être placée pour la fixation à la chaleur. (C) après la fixation thermique, d'organiser larves parallèlement les uns aux autres et perpendiculaire à l'axe de la lame. (D) Placer le verre de couverture sur les larves. (E) à réorienter les larves, poussez délicatement couvercle en verre avec une pince à rouler les animaux. (F) de type sauvage troisième stade larvaire avec la GFP exprimée tout au long de le système trachéal. Les troncs d'dorsales appariés (DT) sont visibles sur ee face dorsale. (G) La même larve après la technique de roulement avec la face ventrale maintenant face vers le haut. (H) Schéma de vue latérale de deux hemisegments trachéales troisième stade (un hemisegment est surligné en gris). Les cercles indiquent groupe latéral (LG) et corps gras (FB) des cellules de terminaux que nous utilisons pour la quantification. Les lignes pointillées représentent les autres branches de la trachée qui nous n'avons pas quantifier de façon routinière. Pour une description complète des branches trachéales dans un segment larvaire, reportez-vous à Réf 1.
Figure 2. Des images représentatives. (AD) Mosaic L3 larves ont été générés en utilisant la technique de marcm (section 1) et fixes et imagés utilisant le protocole dans les sections 2-4. Le schéma de branchement d'un seul LG borne cellulaire was visualisées par l'expression de la mosaïque de la GFP (A), la lumière remplis de gaz visualisées par microscopie en fond clair (B). (C) le traçage du motif de branchement de la cellule A, généré à l'aide NeuronJ (section 5). (D) Suivi de la lumière remplis de gaz de la cellule B, générées à l'aide NeuronJ (section protocole 5). (E, F) A (FB) cellule terminale de graisse corporelle (mis en évidence par le cercle rouge) visualisé par l'expression de la GFP dans le système trachéal (E) et la microscopie en fond clair (F) dans une larve préparé par le protocole dans les sections 2-4. (G, H) Exemple d'artefacts de fixation obtenus lorsque l'échantillon est chauffé pendant une période trop longue. GFP est diffuse et petites branches ont dégradé (G). Domaines de la lumière également n'apparaissent plus rempli d'air (flèche en H). Barre d'échelle: 100 um.
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Discussion
La technique de fixation à la chaleur décrit ici est un outil rapide et pratique pour drosophile cellules terminales trachéales larvaires imagerie. Ici, nous utilisons cette technique pour examiner le branchement et le modèle lumen des cellules de type sauvage. Cellules trachéales exprimant la GFP, dirigé par le promoteur spécifique trachéale à bout de souffle, peuvent être facilement visualisées à travers la cuticule des larves après la fixation de la chaleur. Les schémas de branchement spécifiques de cellules de terminaux individuels, ainsi que celles de la lumière remplis d'air, peuvent être rapidement visualisées et mesurées en utilisant cette méthode. Cette technique peut également être effectuée à la fois premier et deuxième stade larvaire. Cependant, des précautions doivent être prises lors de la fixation des animaux plus petits, comme expression de la protéine fluorescente peut facilement être perturbé.
Dans la méthode présentée ici, nous décrivons une analyse des animaux de mosaïque avec la GFP exprimée dans les cellules trachéales simples. Cependant, les mêmes techniques sont applicables à l'analyse des cellules trachéales sous un number des manipulations expérimentales. Par exemple, les animaux chez lesquels l'expression des gènes a été modifiée par des approches moléculaires, à travers le système trachéal ou dans des cellules individuelles par l'expression de transgènes RNAi ou de protéines modifiées, peut également être examiné avec cette approche. Les traitements non génétiques qui affectent le développement des cellules du terminal, tels que les médicaments ou l'hypoxie 2,14, peuvent également être caractérisés en utilisant ces méthodes. Dans ces derniers cas, il est nécessaire de commencer avec un stock Drosophila exprimant constitutivement la GFP ou d'une autre protéine fluorescente au long de son système trachéal afin de visualiser les modèles de branchement. De remplissage de gaz peut être examinée indépendamment de l'expression de la protéine fluorescente.
Ici, nous montrons que des exemples de non balisé (cytoplasmique localisée) GFP être utilisés pour étiqueter le système trachéal. Cependant, les méthodes décrites ici sont également appropriés pour détecter d'autres protéines natives fluorescents, tels que DsRed, ainsi que des pro fluorescentprotéines qui ont été modifiés pour être localisés à des structures sous-cellulaires spécifiques. Par exemple, l'actine: GFP ou la tubuline: fusions GFP peut être utilisé pour visualiser le cytosquelette trachée 10.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier compétition.
Acknowledgments
Nous remercions Gillian Stanfield de commentaires sur le manuscrit. TAJ est soutenu par l'Université de l'Utah Genetics Training Grant T32-GM007464 de NIGMS NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
References
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