Derribo Gene a gran escala en<em> C. elegans</em> Utilizar bibliotecas de alimentación de dsRNA para generar sólidas fenotipos de pérdida de función
Summary
Mientras dsRNA alimentación en C. elegans es una poderosa herramienta para evaluar la función de los genes, los protocolos actuales para pantallas de alimentación a gran escala resultan en eficiencias desmontables variables. Se describe un protocolo mejorado para realizar a gran escala pantallas de alimentación de RNAi que se traduce en caída altamente eficaz y reproducible de la expresión génica.
Abstract
ARN de interferencia alimentando gusanos bacterias que expresan dsRNAs ha sido una herramienta útil para evaluar la función de genes en C. elegans. Si bien esta estrategia funciona bien cuando un pequeño número de genes están dirigidos por caída, pantallas de alimentación a gran escala muestran eficiencias variables desmontables, lo que limita su utilidad. Hemos deconstruido protocolos desmontables de RNAi publicados previamente y se encontró que la fuente primaria de la caída reducida puede atribuirse a la pérdida de plásmidos que codifican dsRNA de las bacterias alimentados a los animales. Basándose en estas observaciones, hemos desarrollado un protocolo de alimentación de dsRNA que reduce en gran medida o elimina la pérdida de plásmido para lograr eficiente, de alto rendimiento de la precipitación. Se demuestra que este protocolo producirá robusto, reproducible golpe abajo de C. elegans genes en múltiples tipos de tejidos, incluyendo las neuronas, y permitirán caída eficiente en pantallas de gran escala. Este protocolo utiliza una alimentación de dsRNA disponible comercialmentebiblioteca y describe todos los pasos necesarios para duplicar la biblioteca y realizar pantallas de ARN de doble cadena. El protocolo no requiere el uso de cualquier equipo sofisticado, y por lo tanto puede ser realizada por cualquier C. elegans laboratorio.
Introduction
Históricamente, las pantallas de genética en C. elegans se han realizado mediante el tratamiento de los animales con un mutágeno químico tal como metanosulfonato de etilo para crear mutaciones aleatorias dentro del DNA. Progenie o grandprogeny de animales mutados son entonces aislados que presentan un fenotipo anormal deseado. La mutación responsable de causar el fenotipo se identifica a continuación a través de un procedimiento de asignación de mano de obra intensiva o mediante la secuenciación de todo el genoma del gusano mutante. Hay muchas ventajas a la realización de este tipo de pantallas de mutagénesis química, ya que crean lesiones permanentes en el genoma del gusano que pueden resultar en ambos fenotipos con ganancia de función y la pérdida de la función, pero el procedimiento de asignación es lento y costoso.
La interferencia de ARN de doble cadena (dsRNAi) proporciona un medio alternativo para identificar genes implicados en procesos biológicos importantes. En este método, dsRNA a juego la secuencia de codificación de un gen endógeno se introduce en el gusano.El dsRNA se procesa en vivo para generar pequeños RNAs (21-22 nucleótidos) que sirven como guías para encontrar y se unen los ARNm endógenos a juego, la orientación para su destrucción 1. Este procedimiento es relativamente rápido, sino porque dsRNA mRNA objetivos en lugar de ADN, sólo los fenotipos de reducción de la función, cuando se utilice este enfoque.
Introducción de ARNbc en un animal se puede lograr mediante la inyección directa de dsRNA 2, empapando animales en dsRNA 3, o por la alimentación de animales bacterias que expresan dsRNA 4. Cada uno de estos métodos de entrega causan efectos sistémicos desmontables como la mayoría de las células del animal expresan SID-1, un canal transmembrana capaz de importar dsRNA 5. Originalmente utilizado como un enfoque de genética inversa para derribar la expresión de genes individuales uno a la vez, el desarrollo de dos bibliotecas de alimentación permite ahora pantallas genéticos a gran escala. Las bibliotecas de dsRNA comercialmente disponibles contienen baclones cterial que representan ya sea el 55% o el 87% de toda la C. elegans genes 6, 7.
Por desgracia, las pantallas de alimentación dsRNAi gran escala a menudo resultan en eficiencias desmontables variables 8-10. Mientras que el nivel absoluto de la caída de RNAi no se mide fácilmente, la eficiencia reducida caída observada en pantallas de gran escala debe ser causado por residuales ARNm de genes específicos que escapan a la degradación por RNAi. Esto, a su vez, podría ser un resultado directo de dsRNA pérdida de plásmido a partir de bacterias alimentados a los animales en estas pantallas. Apoyando esta idea, los animales alimentados con mezclas de bacterias, en el que sólo el 50% de las bacterias expresan dsRNA contra un gen diana, muestran reducido dramáticamente (en su caso) efectos desmontables en comparación con los animales de control alimentados con 11. La extensión de la caída de genes se convierte en una preocupación fundamental al realizar pantallas dsRNAi como la mayoría de los genes en C. elegans son haplosufficient y por lo tanto la expresión de genes que deben reducirse en al menos un 50% to causar la pérdida de la función de los fenotipos 12.
Hemos utilizado los protocolos de alimentación previamente publicados para realizar pantallas de gran escala y ha encontrado los mismos efectos derribo variables reportadas por otros 8-10. En la búsqueda de las posibles causas, se encontró que casi el 60% de las bacterias alimentadas a animales en la pantalla había perdido el plásmido dsRNA. Hemos desarrollado un protocolo de la duplicación y el cribado de la biblioteca que reduce drásticamente o elimina la pérdida de plásmido y mejora en gran medida la eficiencia desmontables. Este protocolo es adecuado para la realización de pantallas de gran escala en C. elegans y se puede utilizar para detectar ya sea una de las bibliotecas de dsRNA disponibles comercialmente. Usando este protocolo, nos encontramos con que esencialmente el 100% de las bacterias a los animales alimentados durante la pantalla de retener el plásmido dsRNA-codificación y causa la pérdida robusto y altamente penetrante de fenotipos de función en todos los tejidos examinados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos descrito un protocolo que utiliza una biblioteca de alimentación dsRNA disponible en el mercado para realizar pantallas de gran escala en C. elegans. Proporcionamos todas las instrucciones para duplicar la biblioteca y para utilizar de manera eficaz. Se demuestra que este enfoque es capaz de identificar genes implicados en diferentes procesos biológicos en diferentes tejidos del animal. Mientras que los fenotipos que describimos aquí son fácilmente observables (UNC, Egl, y Dpy), este protocolo se pued…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Nacionales de Salud MH097163. Algunas cepas fueron proporcionados por la CGC, que es financiado por la Oficina de NIH de los programas de infraestructuras de investigación (P40-OD010440).
Materials
| Reagent/Material | |||
| 96-well Falcon flat bottom plate | Fisher Scientific | 353072 | sterile |
| adhesive foil | USA Scientific | 2923-0100 | |
| Nunc omniplate | Fisher Scientific | 267060 | |
| 2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock | USA Scientific | 5678-0285 | autoclavable |
| Lids for deep well plates | USA Scientific | 5665-6101 | |
| 50 ml combitips | USA Scientific | 4796-5000 | individually wrapped |
| Reservoir | USA Scientific | 2977-8500 | autoclavable |
| 12-well plates | USA Scientific | CC7682-7512 | individually wrapped |
| dsRNA feeding library | OpenBiosystems | RCE1181 | store -80 °C |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Tetracycline | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Carbenicillin | allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com | ||
| Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A | Affymetrix | 10906 | for worm plates |
| Equipment | |||
| Brayer roller | USA Scientific | 9127-2940 | |
| Boekel 96-pin replicator | Fisher Scientific | 05-450-9 | autoclavable |
| microshaker | Thomas Scientific | 1231A93 | 3 mm orbit |
| 12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl) | USA Scientific | 7112-0510 | |
| 12 channel multichannel pipet (30-300 μl) | USA Scientific | 7112-3300 | |
| Repeater Plus manual pipettor | USA Scientific | 4026-0201 |
References
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