Su larga scala Knockdown Gene in Published: September 25, 2013 doi: 10.3791/50693

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Kathryn N. Maher¹, Mary Catanese², Daniel L. Chase³

¹Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts, Amherst, ²Neuroscience and Behavior Program, University of Massachusetts, Amherst, ³Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Massachusetts, Amherst

Summary

Mentre dsRNA alimentazione in C. elegans è un potente strumento per valutare la funzione del gene, i protocolli attuali schermi di alimentazione su larga scala producono efficienze atterramento variabili. Descriviamo un protocollo migliorato per eseguire larga scala RNAi schermi alimentazione che si traduce in knockdown altamente efficace e riproducibile di espressione genica.

Abstract

RNA interference alimentando worm batteri che esprimono dsRNAs è stato uno strumento utile per valutare la funzione del gene in C. elegans. Mentre questa strategia funziona bene quando un piccolo numero di geni sono mirati per atterramento, schermi alimentazione larga scala mostrano efficienze abbattibili variabili, che limita la loro utilità. Abbiamo decostruito protocolli smontabili RNAi precedentemente pubblicati e trovato che la fonte primaria del knockdown ridotta può essere attribuita alla perdita di plasmidi codificanti dsRNA dai batteri somministrati agli animali. Sulla base di queste osservazioni, abbiamo sviluppato un protocollo di alimentazione dsRNA che riduce notevolmente o elimina la perdita di plasmide per ottenere efficienza, alta knockdown produttività. Abbiamo dimostrato che questo protocollo produrrà robusto, colpo riproducibile giù di C. elegans geni in diversi tipi di tessuto, tra cui i neuroni, e consentiranno atterramento efficiente in schermi di grandi dimensioni. Questo protocollo utilizza un'alimentazione dsRNA disponibile in commerciobiblioteca e descrive tutti i passi necessari per duplicare la libreria ed eseguire schermi dsRNA. Il protocollo non richiede l'uso di attrezzature sofisticate, e può pertanto essere eseguita con qualsiasi C. elegans laboratorio.

Introduction

Storicamente, gli schermi genetiche in C. elegans sono state effettuate considerando gli animali con un mutageno chimico come metansolfonato etilico per creare mutazioni casuali entro DNA. Progenie o grandprogeny di animali mutagenizzate vengono poi isolate che mostrano un fenotipo anormale se lo desideri. La mutazione responsabile per provocare il fenotipo viene quindi identificato mediante una procedura di mappatura laborioso o mediante sequenziamento dell'intero genoma del verme mutante. Ci sono molti vantaggi per l'esecuzione di tali schermi di mutagenesi chimica creano lesioni permanenti all'interno del genoma worm che possono provocare entrambi i fenotipi guadagno-di-funzione e perdita di funzione, ma la procedura di mappatura è lento e costoso.

Double-stranded RNA interference (dsRNAi) fornisce un mezzo alternativo per identificare i geni coinvolti in importanti processi biologici. In questo metodo, dsRNA corrispondente alla sequenza codificante di un gene endogeno viene introdotto nel verme.Il dsRNA viene elaborato in vivo di generare piccole (21-22 nucleotidi) RNA che fungono da guida per trovare e fermare il mRNA endogeni corrispondenti, rivolgersi a loro per la distruzione ^1. Questa procedura è relativamente breve, ma perché dsRNA obiettivi mRNA anziché DNA, solo fenotipi riduzione di funzione sono osservati utilizzando questo approccio.

Introduzione di dsRNA in un animale può essere ottenuto mediante iniezione diretta di dsRNA ^2, immergendo animali in dsRNA ^3, o somministrate animali batteri che esprimono dsRNA ^4. Ciascuno di questi metodi di consegna causare effetti atterramento sistemici come la maggior parte delle cellule dell'animale esprimono SID-1, un canale transmembrana in grado di importare dsRNA ^5. Originariamente utilizzato come un approccio di genetica inversa per knockdown l'espressione di diversi geni uno alla volta, lo sviluppo di due librerie di alimentazione permette ora schermi genetici su larga scala. Le librerie dsRNA disponibili in commercio contengono bacloni cterial che rappresentano sia il 55% o il 87% di tutti i C. elegans geni ^{6, 7.}

Purtroppo, su larga scala schermi di alimentazione dsRNAi spesso sfociano in efficienza atterramento variabili ^8-10. Mentre il livello assoluto di atterramento da RNAi non è facilmente misurabile, l'efficienza atterramento riduzione osservata in schermi di grandi dimensioni deve essere causata da mRNA specifico gene residue che sfuggono alla degradazione da RNAi. Questo, a sua volta, potrebbe essere un risultato diretto di dsRNA perdita plasmidico da batteri somministrati ad animali in queste schermate. A supporto di questa idea, animali alimentati con miscele di batteri, in cui solo il 50% dei batteri esprimono dsRNAs contro un gene targeting, mostrano drasticamente ridotto (eventuali) effetti knockdown rispetto agli animali di controllo alimentati ^11. L'entità del gene knockdown diventa un problema critico durante l'esecuzione di schermi dsRNAi come la maggior parte dei geni di C. elegans sono haplosufficient e quindi l'espressione genica devono essere ridotte almeno del 50% to causare la perdita-di-funzione fenotipi ^12.

Abbiamo usato protocolli di alimentazione precedentemente pubblicati effettuare schermi di grandi dimensioni e trovato gli stessi effetti smontabili variabili riportati da altri ^8-10. In una ricerca di possibili cause, abbiamo riscontrato che quasi il 60% dei batteri alimentati agli animali nella schermata aveva perso il plasmide dsRNA. Abbiamo sviluppato una duplicazione e di screening protocollo biblioteca che riduce drasticamente o elimina la perdita di plasmide e migliora notevolmente l'efficienza knockdown. Questo protocollo è adatto per l'esecuzione di schermi di grandi dimensioni in C. elegans e può essere usata per selezionare uno dei due librerie dsRNA disponibili in commercio. Usando questo protocollo, troviamo che sostanzialmente il 100% dei batteri somministrati ad animali durante la schermata mantenere il plasmide dsRNA-codifica e causare la perdita robusto e altamente penetrante dei fenotipi funzione in tutti i tessuti esaminati.

Protocol

Nota: Questo protocollo può essere utilizzato per identificare geni necessari per una varietà di processi biologici in una varietà di tipi di tessuti. Come controllo qualità necessaria durante la schermata, gli animali sono nutriti positive e negative di controllo-dsRNA esprimendo batteri per dimostrare gli effetti RNAi nel tessuto bersaglio.

Altri protocolli di alimentazione pubblicati crescere batteri dsRNA-esprimono in presenza sia di 50 ug / ml ampicillina o 25 mg / ml carbenicillina ^8-10. Abbiamo trovato che i batteri siano prodotti in una di queste condizioni perdono il plasmide dsRNA ad alta frequenza. Infatti, abbiamo scoperto che anche quando i batteri sono cresciute overnight a concentrazioni molto elevate (fino a 2 mg / ml) di ampicillina più del 50% dei batteri contiene più plasmide. Mentre la crescita in carbenicillina generalmente ad una maggiore ritenzione di plasmide, 25 mcg / ml non era sufficiente per prevenire la perdita plasmide. Invece, abbiamo scoperto che carbenicillina concentrazionezioni di 500 mcg / ml sono stati tenuti a bloccare la perdita plasmide durante la crescita in coltura liquida e 2 mg / ml carbenicillina era tenuta a bloccare la perdita plasmide quando i batteri sono stati coltivati ​​su substrati solidi agar.

Poiché ritenzione plasmide è fondamentale per il successo di knockdown, solo carbenicillina viene utilizzato quando i batteri dsRNA sono coltivate in questo protocollo. Abbiamo accuratamente ottimizzato la concentrazione di carbenicillina utilizzato nelle culture crescita batterica descritti in questo protocollo per garantire che i batteri che non contengono il plasmide non crescono in queste culture. Tuttavia, come misura di controllo della qualità, perdita plasmide è determinato in diverse fasi del protocollo. Per garantire un knockdown efficiente, più del 80% dei batteri in ciascuno di questi passaggi deve contenere dsRNA plasmide. Se più del 20% dei batteri in una qualsiasi fase del protocollo hanno perso il plasmide dsRNA, controllare la qualità del carbenicillina utilizzato. Carbenicillin deve essere preparato fresco il giorno in cui viene utilizzato. Preparare carbenicillina nuovo e ripetere la cultura.

1. Come determinare la perdita di plasmidi

1. Rimuovere un piccolo campione di batteri (come descritto ad ogni passo rilevante) e aggiungerlo a 450 ml di acqua sterile.
2. Utilizzare 100 ml di questo campione diluito per creare ulteriore 1:10, 1:100, e 1/1.000 diluizioni con acqua sterile, miscelando le soluzioni accuratamente tra diluizione.
3. Distribuire 100 ml di ciascuna diluizione su piastre LB e LB AMP e incubare le piastre per una notte a 37 ° C.
4. Il giorno successivo, identificare la piastra LB contenente tra 100 e 500 colonie batteriche. Contare il numero di colonie su questa piastra e sulla corrispondente piastra LB AMP (contenente la stessa diluizione di batteri).
5. Determinare la perdita del plasmide da questi conteggi delle colonie. La percentuale dei batteri che non contengono il plasmide è calcolato utilizzando l'equazione 1, e dovrebbe essere inferiore al 15% per un efficace dsRNA abbattere.

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2. Fare Piastre Duplicate Biblioteca

Sommario: La biblioteca dsRNA arriverà dal produttore (OpenBiosystems) come 10.566 cloni batterici in 96 pozzetti. Memorizzare immediatamente le piastre a -80 ° C freezer. Le piastre originali delle librerie saranno duplicati e tutti gli schermi alimentazione utilizzerà le piastre biblioteca duplicati come fonte di batteri. Si consiglia di conservare l'originale e duplicare piatti della biblioteca nei congelatori separati. Per raccomanda maneggevolezza, duplicare solo 10 piastre di libreria al giorno.

1. Rimuovere la piastra biblioteca (s) da -80 ° C freezer e rimuovere il sigillo di alluminio, mentre le culture sono ancora congelati. Rimettere il coperchio in plastica del piatto biblioteca e impostare la piastra su una superficie piana per scongelare a temperatura ambiente (non più di 30 min).

Nota: Abbiamo notato che un significativo percentuale di batteri presenti in ciascun pozzetto delle piastre originali delle librerie non contengono plasmide. Tuttavia, poiché i batteri della biblioteca sono una risorsa preziosa non è consigliabile per verificare la perdita di plasmide nelle culture biblioteca originali.

2. Usando una pipetta multicanale, aggiungere 150 ml di mezzi di duplicazione libreria a ciascun pozzetto di un fondo piatto da 96 pozzetti piastra duplicato vuoto.
3. Mescolare le colture batteriche biblioteca scongelati pipettando su e giù 4-5 volte utilizzando una pipetta multicanale impostato a 100 microlitri. Quindi rimuovere 10 ml di ogni cultura mista e trasferire ai corrispondenti pozzetti della piastra duplicato. Continuare a trasferire le culture dalla piastra biblioteca di duplicare piastra facendo attenzione a cambiare puntali per pipette per ogni trasferimento.
4. Dopo che tutte le culture da una piastra libreria sono stati trasferiti, coprire i pozzetti della piastra libreria originale con una nuova pellicola adesiva utilizzando un rullo brayer per garantire una tenuta completa. Riposizionare il coperchio di plastica sul piatto emettono diritto in un -80 ° C freezer fino le colture sono ricongelati (almeno 30 minuti). Quindi spostare le lastre originali delle librerie di nuovo in una scatola biblioteca.
5. Agitare duplicati culture piastra biblioteca piatte per 8-10 ore a 37 ° C (450 rpm su un microshaker, orbita 3 mm).
6. Determinare la perdita plasmide Ogni piastra biblioteca duplicato. Abbiamo trovato che una percentuale elevata dei batteri in ciascun pozzetto della piastra libreria originale non conteneva dsRNA plasmide. È importante che questi batteri non contribuiscono alla crescita in biblioteca duplicato. Per impedire la loro crescita, un'alta concentrazione di carbenicillina è utilizzato nei mezzi duplicazione biblioteca (3 mg / ml). Dopo la cultura della piastra di duplicazione utilizzando queste condizioni abbiamo scoperto che oltre il 90% dei batteri contengono dsRNA plasmide. Rimuovere 10 microlitri del campione da una cultura ben rappresentativo di ogni piatto duplicato e aggiungerlo a 450 ml di acqua sterile. Utilizzando questi campioni diluiti, determinare perdita plasmide in ogni libreria duplicatoPiastra secondo la procedura 1,1-1,4. Se la perdita significativa plasmide si osserva (> 20% dei batteri presenti nella libreria duplicato non contengono plasmide), rifare il terreno di coltura utilizzando carbenicillina fresco e ripetere protocollo da punto 2.1.
7. Dopo l'incubazione, inserire un nuovo foglio adesivo pellicola direttamente sui pozzetti della piastra duplicati, e posizionare le palpebre piastra su questo foglio. Posizionare le piastre biblioteca duplicati verticale in un -80 ° C freezer (almeno 30 minuti) fino congelati. Una volta congelato, spostare le piastre per la scatola di immagazzinaggio biblioteca duplicato per l'archiviazione a lungo termine.

3. Esecuzione di copie temporanee della Biblioteca on Omniplates

Sommario: Per iniziare a preparare il cibo per uno schermo dsRNA, batteri da lastre di libreria duplicati vengono trasferiti omniplates agar solidi e cresciuti durante la notte. Per evitare la perdita del plasmide su supporti solidi, omniplates contiene carbenicillina a 2 mg / ml. I batteri su queste piastre possono essere utilizzate per un periododi una settimana, e non mostrano la perdita di plasmide. Non abbiamo testato per la perdita di plasmide in batteri coltivati ​​su omniplates più di una settimana.

1. Rimuovere la piastra biblioteca duplicato (s) da -80 ° C freezer e togliere il sigillo di alluminio, mentre le colture sono ancora congelati. Dopo la rimozione della pellicola, rimettere il coperchio di plastica della piastra e fissare la piastra biblioteca duplicato su una superficie piana scongelare a temperatura ambiente (non più di 30 min).
2. Sterilizzare il perno replicatore Boekel 96. I perni di un replicatore pulita devono essere risciacquati con acqua distillata e poi sterilizzati prima di ogni utilizzo. Per sterilizzare il replicatore, metterlo in un bagno di etanolo (3/4 in profondità in una pirofila) e poi masterizzare l'etanolo rivestire i perni fuori utilizzando un becco Bunsen. Lasciare la fiamma per spegnere e poi ripetere.
3. Posizionare il replicatore sterilizzato nei pozzetti della piastra duplicato scongelato e usarlo per mescolare delicatamente le culture. Piccoli volumi di cultura potranno aderire ai pin del replicatore.
<li> rimuovere con cautela il replicatore dai pozzetti della piastra duplicato e posizionarlo (pin giù) delicatamente sulla superficie del omniplate, facendo attenzione a non forare la superficie agar. Lasciare il replicatore sulla superficie del omniplate per 3-4 secondi in modo che i batteri dai perni del replicatore vengono trasferiti sulla superficie agar.
4. Rimuovere il replicatore e consentire al piccolo volume (2-3 ml) di coltura batterica di assorbire in agar. Incubare le omniplates invertiti per 15-18 ore a 37 ° C. Questi omniplates possono essere utilizzati la mattina successiva per inoculare 96 culture ben liquidi. In alternativa, omniplates contenenti colonie batteriche overnight possono essere conservati fino a sette giorni a 4 ° C.
5. Per replica di trasferimento lastre duplicati supplementari, sciacquare le punte replicatore con acqua sterile e ripetere il processo di sterilizzazione mettendo il replicatore di etanolo e fiammeggiante due volte, come prima. Una volta sterilizzati, il replicatore può essere usata al prossimo piastra duplicato.

4. Preparazione di batteri degli alimenti per Worms

OANORAMICA: Batteri per vermi alimentazione sono preparati come 1 ml colture liquide (in un formato ben 96) con i batteri dalle omniplates. Queste colture liquide sono cresciute durante la notte per generare colture batteriche nonlogarithmic saturi. Crescita overnight garantisce che tutte le culture conterranno simili concentrazioni di batteri e quindi tutti i vermi saranno alimentati con la stessa quantità di cibo. Occorre rilevare alcuna perdita plasmide durante questa crescita.

1. Pipettare 1 ml di terreno di coltura batterica in ciascun pozzetto di 2 ml di pozzo piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta di ripetizione e 50 ml Combitip.
2. Posizionare replicatore sterile sulla superficie di omniplates contenenti colonie batteriche generati nei passaggi 3.1-3.6 assicurandosi che i perni sono in contatto con ciascuna delle 96 colonie batteriche.
3. Spostare con cautela il replicatore dalla superficie del omniplate nella piastra pozzo profondo assicurandosi che i perni non raschiare i lati dei pozzi profondi fino immersi in terreni di crescita. Spostare ilreplicatore lentamente in un movimento quadrato seguendo la parete interna della piastra pozzo profondo per rimuovere i batteri nel mezzo di crescita. Fare attenzione a non schizzare e cross contaminare i pozzi.
4. I pozzetti di controllo: per ogni piastra di coltura da 96 pozzetti pozzo profondo aggiungere un batterio dsRNA-esprimono una bene che agirà come controllo positivo per il fenotipo knockdown previsto e aggiungere batteri contenenti vettore vuoto dsRNA (pL4440) come controllo negativo ad un altro bene . Abbiamo ri-striscia di controllo-dsRNA esprimendo batteri una volta a settimana su piastre LB contenenti tetraciclina (15 mg / ml) e carbenicillina (2 mg / ml) in modo che i batteri rimangono freschi e conservano plasmide.
5. Utilizzando un'ansa da inoculo sterile rimuovere una singola colonia ben isolata dalla piastra di controllo (circa la stessa quantità di batteri trasferiti dal replicatore) e inoculare un pozzo vuoto nel pozzo piastra di coltura profonda. Registrare la posizione del pozzo che è stato inoculato. In alternativa, il ciclo con batteri cun essere spostati in una provetta Eppendorf contenente 250 microlitri mezzi di crescita, in agitazione e poi utilizzati per inoculare diversi pozzi.
6. Agitare le piastre profondo bene in posizione piana a 650 rpm su microshaker (orbita: 3 mm) a 37 ° C per una notte. Le colture saranno saturati dalla mattina successiva. Indipendentemente, la concentrazione di carbenicillina utilizzato in queste culture dovrebbe impedire perdita plasmide.
7. Determinare la perdita plasmide nelle culture 1 ml durante la notte. Le colture saranno utilizzati direttamente per alimentare vermi per lo schermo. E 'importante che più dell'80% dei batteri in ciascuna cultura contenute dsRNA plasmide. Determinare la perdita plasmide per due culture rappresentativi in ​​base ai punti 1.1-1.4. Aspettative: Più del 90% dei batteri in ogni cultura conterrà dsRNA plasmide. Non abbiamo mai osservato una significativa perdita plasmide in queste culture durante la notte, anche quando cresciuto fino a saturazione. Tuttavia, se la perdita significativa plasmide si osserva (> 20%), rifare il terreno di coltura utilizzando carbenicillina fresco e repmangiare protocollo dal punto 4.1. Le culture possono essere riavviati dai omniplates originali finchè i omniplates sono meno di 1-2 settimane di età.
8. Una volta utilizzato per avviare 1 ml culture, le omniplates vengono conservati a 4 ° C finché lo schermo è completata e può essere utilizzato come fonte di cibo per iniziare qualsiasi culture ripetere il test.
9. Dopo incubazione per una notte di culture, utilizzare una pipetta multicanale a 12 canali per rimuovere 150 ml di coltura batterica dalla piastra pozzo profondo ed espellere sulla superficie della piastra di alimentazione. È importante non forare la superficie dell'agar durante il trasferimento come vermi scavano e non alimentare sui batteri dsRNA-esprimono. Trasferimento può essere fatto quattro pozzetti alla volta (Figura 1). Per fare questo, posizionare le punte delle pipette su ogni terzo canale della pipetta multicanale (come ci sono solo 4 pozzi per riga nella piastra di alimentazione). Dopo ogni set di 4 pozzi viene trasferito, cambiare a nuovi puntali sterili. Ogni piatto 96 cultura profonda e richiederà 96 consigliper il trasferimento di otto lastre di alimentazione da 12 pozzetti.
10. Conservare seminato piatti in posizione verticale durante la notte buio così i batteri possono assorbire nella agar.

5. Generazione L1 Arrestato C. elegans larve

Panoramica: larve L1-arrestati vengono utilizzati per avviare colture a vite senza fine sincronizzati sulle piastre di alimentazione dsRNA. Queste larve sono generati da sbianca popolazioni di adulti gravido di isolare uova sane e quindi permettendo alle uova di schiudersi in S-multimediale completo senza cibo. In assenza di cibo larve L1 schiuse arresterà sviluppo, generando una popolazione sincrona di larve L1. Durante lo schermo, preparare fresco larve L1-arrestato ogni settimana come questi animali affamati si ammalano nel tempo e devono essere eliminati. La scelta del background genetico degli animali utilizzati in un ceppo di alimentazione dsRNA può variare a seconda dell'applicazione, per schermi neuronali eri-1; mutanti lin-15B sono raccomandati.

1. Scegliere 10-20 L4 larvae a sei piastre NGM separati contenenti un prato di batteri OP50 e aspettare 6-7 giorni fino a quando le piastre contiene molte uova appena deposte e adulti gravide.
2. Rimuovere animali e uova dalle piastre aggiungendo 3 ml di acqua alla superficie di ciascuna piastra ed utilizzare un dito guantato per rimuovere le uova, batteri e animali dalla superficie di ciascuna piastra in acqua. Assicurarsi di coprire tutte le aree della piastra, con particolare attenzione al prato batterica. Rimuovere l'acqua, batteri, vermi e uova di ogni piatto con una pipetta di vetro e trasferire ad uno sterile tubo da 50 ml.
3. Aggiungere altri 3 ml di acqua alla superficie di ciascuna piastra, pipettando su e giù attraverso la superficie per rimuovere tutti i rimanenti batteri, vermi e uova. Aggiungere questo volume alla provetta conica da 50 ml.
4. Spin tubo conico a 1.500 rpm per 1 min in una centrifuga da tavolo. Vermi e uova dovrebbero pellet al fondo del tubo e batteri dovrebbero rimanere sospese. Con attenzione aspirare tutti, ma 4 mldel liquido dal tubo avendo cura di evitare i vermi e uova pellet.
5. Risospendere il pellet verme in acqua residua e trasferire in un tubo da 15 ml sterile utilizzando una pipetta di vetro. Portare il volume a 10 ml con acqua sterile.
6. Spin a 1.500 rpm per 1 min come prima. Aspirare il surnatante lasciando 200 microlitri di acqua in modo da non disturbare il pellet verme / uovo.
7. Aggiungere acqua 10 ml al conica per lavare i vermi e le uova e girare come prima per rimuovere i batteri supplementari.

nota: In passaggi 5,8-5,11 vermi e le uova sono esposti a una soluzione di candeggina. Bleach distruggerà vermi e lasciare le uova relativamente incolume. Tuttavia, se le uova sono lasciati in una soluzione di candeggina troppo a lungo, saranno distrutti. Impostare un timer quando candeggina viene aggiunto nella fase 5.8 per essere certi che le uova non rimanere esposti a candeggina per più di 10 min.

8. Rimuovere tutti ma 200 pl del supernatante, il pellet di nuovo evitando, quindi aggiungere 10ml di soluzione di candeggina e avviare un timer.
9. Incubare vermi e uova in soluzione di candeggina per 3-4 minuti, mescolando di tanto in tanto per inversione. Poi girare a 1.500 rpm per 45 secondi in una centrifuga da tavolo. Cercare un pellet nel fondo del tubo, dovrebbe essere più piccolo e più compatto del pellet originale e potrebbe assumere un aspetto giallo.
10. Aspirare la soluzione di candeggina lasciando 200 microlitri dietro in modo da non disturbare il pellet.
11. Aggiungere un altro 10 ml di soluzione di candeggina fresca e capovolgere come prima. Quando il timer legge 10 min, girare di nuovo e aspirare la soluzione di candeggina, lasciando 200 microlitri alle spalle e rapidamente aggiungere 10 ml di acqua sterile. Esaminare la soluzione sotto un microscopio da dissezione. Le larve e molti degli adulti avrebbero dovuto disciolto nella soluzione di candeggina, lasciando dietro lo più uova.
12. Spin come prima per 45 sec, e ancora aspirare il supernatante in modo da non disturbare il pellet. Questo pellet deve contenere principalmente uova e sarà molto sciolto.
13. Aggiungi anotla sua acqua 10 ml, capovolgere per mischiare, effetti e aspirare lasciando un po 'd'acqua alle spalle. È importante rimuovere soluzione di candeggina per quanto possibile.
14. Aggiungere 4 ml S-complete media per il tubo conico, risospendere le uova e versare in un 100 ml beuta sterile. Porre il pallone in un incubatore a 20 ° C su un agitatore in movimento insieme abbastanza veloce per causare il contenuto del pallone di swirl. Ciò fornirà aerazione sufficiente a sostenere le larve L1 quando si schiudono. Entro 15 ore tutte le uova sono schiuse dovrebbe produrre una popolazione sincrona di larve L1 arrestato.

Arrestato larve L1 deve essere preparata fresca ogni settimana durante uno schermo. Una volta fatto il primo lotto, lotti successivi possono essere avviati con l'aggiunta di 500 arrestati larve L1 (da lotto della settimana precedente) a ciascuno dei quattro, seminate piastre 6 centimetri standard (contenenti 100 ml cultura durante la notte di OP50), e incubate a 20 ° C per 4 giorni. Il quarto giorno le piastre devono conteneremolte uova e adulti gravido e possono essere sbiancate per preparare uova fresche per più sincronizzato larve L1.

6. Trasferimento Arrestato L1 larve sulle piastre di alimentazione

Sommario: Per eseguire una schermata dsRNA, 20-30 larve L1 arrestati vengono trasferiti su piastre di alimentazione dsRNA. Effetti presto knockdown come l'arresto delle larve o in letalità saranno osservati dopo gli animali sono alimentati con batteri dsRNA-esprimono per 2-3 giorni. A seconda della schermata condotta, fenotipi desiderati possono essere osservati sia negli animali originali immessi sul piatto di alimentazione (animali P0) o nella loro progenie (animali F1). La presentazione del fenotipo dipenderà da un certo numero di variabili tra cui la perdurance della proteina codificata dal gene la cui espressione è abbattuto e il tempo durante lo sviluppo in cui è richiesto il gene di interesse. Avvio di culture alimentazione dsRNA con solo 20-30 animali dovrebbe consentire l'osservazione di entrambi P0 e F1 fenotipi prima di unimals esaurisce la fonte di cibo.

Per trasferire facilmente 20-30 animali da lastre di alimentazione, prima di determinare la concentrazione di L1 arrestato animali nella cultura L1 arrestati.

1. Mescolare la beuta contenente la L1 larve arrestato per distribuire gli animali.
2. Rimuovere una aliquota di 10 microlitri e luogo goccia a goccia su una piastra NGM 6 centimetri testa di serie in 4-5 gocce verso il centro della piastra di fare in modo che tutti i media viene espulso dalla pipetta.
3. Con l'estremità del puntale diffondere i puntini di sospensione verme per formare una singola linea continua di liquido che attraversa il diametro della piastra.
4. Utilizzando un microscopio da dissezione, contare tutti gli animali partire da una estremità della linea di liquido e continuando verso l'altra estremità prima il liquido è assorbito dalla piastra e gli animali disperdere. Questo può richiedere costante ridefinizione del campo di applicazione dissezione per essere certi che gli animali non sono mancati.
5. Ripetere questa operazione per tre 10 microlitri separatialiquote e media dei tre numeri per determinare il numero medio di vermi per microlitri di sospensione verme e registrare questo numero direttamente sulla beuta.

7. Iniziare la schermata di alimentazione

Sommario: Per iniziare la schermata dsRNA, 20-30 arrestato larve L1 vengono aggiunti a ciascun pozzetto di 12 pozzetti piastre di alimentazione contenenti un sottile prato di batteri dsRNA-esprimono. Piastre di alimentazione contengono terreni di crescita nematode standard (NGM) e sono integrati con 500 mg / ml carbenicillina (per prevenire la perdita plasmide) e 1 mM IPTG (a indurre l'espressione dsRNA). Animali possono alimentare e sviluppare per diversi giorni a 20 ° C. Due regimi alimentari tipici per gli animali sono tre giorni quando si esegue una schermata P0 e 6-7 giorni durante l'esecuzione di uno schermo F1. La durata di alimentazione, tuttavia, può essere variata a seconda delle fenotipi specifici richiesti nella schermata.

1. Utilizzare la sospensione delle larve L1 arrestato e acqua sterile per preparare una cosìluzione contenente 2.000 worm / ml. Ogni piastra di alimentazione a 12 e richiederà 120 ml di questa sospensione worm. Mescolare accuratamente per assicurare una distribuzione uniforme di animali e trasferire gli animali ad un serbatoio sterile per pipettare.
2. Usando una pipetta multicanale costituita con punte in ogni terza posizione (vedere Figura 1) trasferimento 10 microlitri della soluzione verme direttamente sul prato batterica delle piastre di alimentazione. Fare attenzione a non forare la superficie del agar, come vermi scavano in agar e non si nutrono di batteri dsRNA-esprimono.
3. Remix la soluzione verme nel serbatoio (da rovesciare delicatamente circa) dopo ogni due filari di lastre di alimentazione, come vermi depositano rapidamente. Continua l'erogazione della sospensione verme fino a quando tutte le piastre di alimentazione sono i vermi. Esaminare alcuni pozzi nella fase iniziale nell'ambito del campo di applicazione dissezione per garantire che ogni bene è sempre 20-30 vermi.
4. Conservare le piastre verticali in una scatola umidificata in un incubatore a 20 ° C. Il giorno successivo, dopo il wosospensione rm ha assorbito nella piastra, capovolgere le piastre e tornare alla humidor a 20 ° C. Animali su queste piastre possono essere osservati dopo 3 giorni (per fenotipi P0) e nuovamente dopo 6 giorni (per fenotipi F1).

Nota: I batteri che rimangono sulla piastra di alimentazione dopo 7 giorni di crescita senza fine sono stati testati per la perdita di plasmide e quasi il 100% trattenuto il plasmide dsRNA.

Representative Results

P0 fenotipo knockdown inizieranno ad apparire dopo 2-3 giorni di alimentazione degli animali dsRNA esprimere batteri. Alcuni primi fenotipi includono arresto larvale e mortalità e devono essere osservate nel 2-3% di tutti i pozzetti di alimentazione. Questi stessi fenotipi saranno osservati negli animali generazione F1. La presenza di uova di F1 che non riescono a schiudersi è un altro fenotipo F1 comune, e, insieme, sarà osservato questi tre fenotipi in quasi il 10% di tutti i pozzetti, le schermate di F1.

Abbiamo utilizzato il protocollo qui descritto per esaminare gli effetti smontabili per diversi geni espressi in una varietà di tipi di tessuti sia per P0 e fenotipi F1. Perché volevamo anche per testare gli effetti atterramento nel tessuto neuronale, abbiamo utilizzato eri-1; mutanti lin-15B nei nostri schermi. Mutazioni in eri-1 e lin-15B, insieme con mutazioni in RRF-3, sono stati identificati in schermi per le mutazioni che hanno causato una maggiore sensibilità al RNAi ^8,13,14.

EGL-30, dpy-17, pat-10, e unc-4. Due di questi geni, EGL-30 e unc-4, sono espressi nel sistema nervoso ^15-17, un gene, pat-10, è espresso in corpo-parete muscolare ^18, e il quarto gene, dpy-17, è espresso in cellule ipodermiche ^19. Quando abbiamo alimentato eri-1; lin-15B animali batteri che contenevano la pL4440 plasmide vuoto ma non hanno espresso un dsRNA, non abbiamo osservato alcun difetti morfologici o comportamentali (Figura 2A, Tabella 1).

EGL-30, codifica per la C. elegans ortologa della proteina subunità G GAQ. EGL-30 mutanti nulli arresto durante le prime fasi dello sviluppo larvale, ma alcuni fuggitivi nulli e hypomorphic perdita di funzione EGL-30 mutanti crescono per diventare stadio adulto e sono difettosi in locomozione e comportamenti ovaiole ^20. Quandoabbiamo alimentato fase L1 eri-1; lin15B batteri larve esprimono EGL-30 dsRNA, abbiamo scoperto che le larve crebbe fino a diventare adulti che hanno mostrato i difetti evidenti nella locomozione e comportamento deposizione delle uova. Dopo tre giorni, il 100% degli animali alimentati dsRNA contro EGL-30 erano paralizzati e incapaci di deporre le uova (Figure 2B, tabella 1). Non abbiamo osservato il fenotipo arresto larvale nei nostri esperimenti atterramento dsRNA che si osserva in EGL-30 (AD810) animali nulli. Questo è probabilmente perché gli animali L1 abbiamo placcato su EGL-30 batteri dsRNA avevano già superato il requisito dello sviluppo presto per EGL-30. Questo evidenzia un vantaggio di schermi alimentazione: fenotipi in fase avanzata possono essere osservati per geni che svolgono anche un ruolo fondamentale durante lo sviluppo.

dpy-17 codifica per una proteina di collagene necessario per la formazione della cuticola in C. 17 dpy-elegans ^19. mutanti nulli sono più brevi e più grassa di wild-type animSLA. Non abbiamo osservato eventuali difetti morfologici negli animali nutriti dpy P0-17 dsRNA. Tuttavia, il 98% degli animali F1 ha mostrato il fenotipo Dpy (Figura 2C, Tabella 1). La mancanza di animali P0 breve e grasso indica che dpy-17 funzione del gene è necessaria nelle fasi larvali precoci per la corretta morfologia del corpo. Mentre dpy-17 non è stato preso di mira in altre schermate di alimentazione, è stato abbattuto da dsRNA iniezione ^21. È interessante notare che solo il 30% della progenie di dsRNA iniettato animali hanno mostrato il fenotipo Dpy, suggerendo che il protocollo di somministrazione qui descritto è più efficiente del metodo di iniezione più alta intensità di lavoro, almeno per alcuni geni.

pat-10 codifica corpo muscolare della parete troponina C, una proteina contenente quattro motivi EF mano che legano il calcio ^18. Abbiamo scoperto che il 100% di eri-1; animali lin-15B alimentati pat-10 dsRNA diventato paralizzato nei 3 giorni e posato senza uova leader toa fenotipo letale (Figura 2D, tabella 1).

unc-4 codifica per una proteina homeodomain espressa in ventrale motoneuroni del midollo ed è necessario per la corretta scelta di input sinaptico ^22,23. Abbiamo scelto unc-4 come gene test perchè ha dimostrato di essere resistente alle precedenti strategie di alimentazione dsRNA ^8,24. Mutanti unc-4 mostrano un difetto nel comportamento locomozione. Come risultato di difetti di connettività sinaptica, unc-4 mutanti sono in grado di eseguire il ^22,23. Rispetto alla wild-type animali che indietro liberamente in un movimento sinusoidale quando spronato sulla testa, unc-4 mutanti nulli non indietro e invece contraggono la loro midbody ermeticamente, causando una flessione dorsale che diventa spesso così estremo che la testa e la coda del tocco animale, posizionando il corpo in una posizione arrotolata. Abbiamo scoperto che il 68% degli animali nutriti unc-4 batteri dsRNA-esprimono la nostra preparazione biblioteca ha mostrato difetti di backing. Si tratta di un notevole miglioramento in termini di efficienza knockdown rispetto al difetto supporto 0% osservato quando rrf-3 animali vengono alimentati unc-4 dsRNA utilizzando protocolli precedentemente pubblicati ⁸ (Tabella 1).

Figura 1. Diagramma di flusso per la libreria duplicazione e schermo larga scala. Ogni 96 o 12 pozzetti generato durante il protocollo di screening è indicato, insieme al metodo utilizzato per trasferire batteri tra piastre. Gli asterischi indicano le fasi in cui i batteri dovrebbero essere testati per la perdita del plasmide. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. dsRNA fenotipi knockdown di C. elegans geni espressi in vari tipi di tessuto. A) Gli animali di controllo alimentati batteri contenenti pL4440 vettore vuoto. Freccia nera indica la posizione di un animale giovane adulto. Freccia bianca indica la posizione di un gruppo di uova deposte. Mostra delle fotografie muoversi liberamente animali come dimostra la loro postura del corpo normale. B) Gli animali nutriti dsRNA contro EGL-30. Si noti che tutti gli animali hanno adottato un aspetto rigido tipico degli animali paralizzati. Si noti inoltre la completa assenza di uova deposte sulla piastra. C) gli animali nutriti dsRNA contro dpy-17. Nota che gli animali adulti in campo (quella contrassegnata dalla freccia) sono più brevi e più grassi animali adulti mostrato nel pannello A. D) Animali nutriti dsRNA contro pat-10. Si noti che tutti gli animali sono paralizzati ma possono ancora muovere i muscoli della testa di alimentare come indicato dalla compensazione dei batteri vicino alla testa, indicata dalla freccia. Bar Scala 1 mm.

dsRNA plasmide o gene targeting da feeding	Espressione tissutale di gene targeting	Animali per cento con fenotipo terminale
pL4440 (controllo negativo)		tipo selvatico per tutti i comportamenti
EGL-30	sistema nervoso	100% Egl e Paralizzato
dpy-17	ipoderma	98% Dpy
pat-10	muscolo parete del corpo	100% Paralizzato
unc-4	sistema nervoso	68% Backing difetto

Tabella 1. Fenotipo Terminal di animali nutriti dsRNA contro geni espressi in vari C. elegans tessuti. n = 100 per tutti i geni.

Discussion

Abbiamo descritto un protocollo che utilizza una libreria alimentazione dsRNA disponibile in commercio per eseguire schermi di grandi dimensioni in C. elegans. Forniamo tutte le istruzioni per duplicare la biblioteca e per usarlo in modo efficace. Abbiamo dimostrato che questo approccio è in grado di identificare i geni coinvolti in diversi processi biologici in differenti tessuti dell'animale. Mentre i fenotipi che descriviamo qui sono facilmente osservabili (Unc, Egl, e Dpy), questo protocollo può essere adattato per cercare geni necessari per quasi qualsiasi processo biologico. Ad esempio, abbiamo usato questo protocollo per identificare i geni necessari per la neurotrasmissione nel verme ^25. Una volta che gli animali sono alimentati con batteri esprimenti dsRNA (tipicamente 3 giorni per schermi P0, 6-7 giorni per schermi F1), possono essere rimosse dalla piastra di alimentazione e testati per ogni fenotipo comportamentale.

Perdita di plasmidi:

Abbiamo trovato che gli incrementi di efficienza atterramento ridotte osservate durantegrandi schermi dsRNA imputabile direttamente alla perdita di dsRNA plasmidico dai batteri alimentati ai vermi. Perdita plasmide si verifica nelle culture crescita batterica perché β-lattamasi, codificato sulla libreria plasmide dsRNA, agisce per degradare sia ampicillina e carbenicillina, riducendo la concentrazione di questi antibiotici nel tempo. Quando la concentrazione di antibiotico diventa sufficientemente bassa, batteri che non contengono il plasmide possono sopravvivere e popolare la cultura. L'uso di tali colture batteriche miste in schermi dsRNA deve essere evitata, come dimostrano l'attività knockdown ridotta e spesso non causano perdita-di-funzione fenotipi ^11. Sorprendentemente, abbiamo scoperto che alti livelli di perdita plasmide si verificano anche in colture batteriche coltivate in concentrazioni molto elevate di ampicillina (fino a 2 mg / ml). Mentre carbenicillina è più resistente alla degradazione da β-lattamasi, abbiamo ancora trovato necessario usare concentrazioni di carbenicillina che erano 10-40 volte superiori a quelliutilizzato in precedenza pubblicati dsRNA schermi alimentazione ^8-10,26 per garantire che tutti i batteri nella cultura mantenuto il plasmide dsRNA.

Poiché la maggior parte dei geni di C. elegans sono haplosufficient, è estremamente importante che tutti i batteri somministrati ad animali esprimere dsRNA. Questo assicura altamente efficiente knockdown gene e aumenta la probabilità di osservare perdita di funzione fenotipi in schermi di grandi dimensioni.

Controlli positivi e negativi:

E 'fondamentale per comprendere i batteri di controllo positivi e negativi in ​​ogni piastra di alimentazione durante l'esecuzione di schermi. Il controllo negativo è particolarmente importante se saranno utilizzati test comportamentali per identificare i geni di interesse. Per un controllo negativo usiamo batteri contenenti il ​​vettore pL4440 vuoto. Per un controllo positivo, è meglio usare batteri che esprimono dsRNA contro un gene che causa il fenotipo knockdown desideri. Tuttavia, se non tali geni siano sannon, un controllo positivo per atterramento deve essere usato che provoca un fenotipo facilmente osservabile. Quando si sceglie un tale gene, occorre dare la preferenza ai geni che sono espressi nel tipo di tessuto mirato nella schermata. Ad esempio, in dsRNA schermi alimentazione per fenotipi neuronali, un gene neuronale dovrebbe essere scelto come controllo positivo. Un effetto atterramento osservabili negli animali nutriti con i batteri di controllo positivi indica che l'interferenza dsRNA sta lavorando nel tipo di tessuto desiderato.

E 'meglio se la persona segnando le piastre di alimentazione per fenotipi è cieco alla posizione dei pozzetti di controllo positivi. Il vagliatore dovrebbe essere in grado di identificare facilmente pozzo positivo in ciascuna piastra da 96 pozzetti. Per i test comportamentali è utile a segnare il bene negative prima scansione dei pozzetti rimanenti.

Throughput:

Usando questo protocollo, una persona dovrebbe essere in grado di impostare e schermo 16, piastre da 12 pozzettial giorno. Per spostarsi in modo efficiente attraverso la biblioteca, in genere Verifichiamo ogni ben di ogni piatto biblioteca solo una volta durante uno schermo. Tutti i pozzi che ha ottenuto come positivi sono registrati e vengono riesaminati in triplice copia. Abbiamo bisogno che i pozzetti positivi ripetere la prova in tutte e tre le prove ripetute. Il plasmide viene quindi purificato dai batteri e l'inserto è sequenziato per identificare con certezza il gene. Se mutanti nulli sono disponibili per il gene, noi ordiniamo loro e testiamo gli animali nulli per difetto comportamentale identificato nella schermata.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
96-well Falcon flat bottom plate	Fisher Scientific	353072	sterile
adhesive foil	USA Scientific	2923-0100
Nunc omniplate	Fisher Scientific	267060
2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock	USA Scientific	5678-0285	autoclavable
Lids for deep well plates	USA Scientific	5665-6101
50 ml combitips	USA Scientific	4796-5000	individually wrapped
Reservoir	USA Scientific	2977-8500	autoclavable
12-well plates	USA Scientific	CC7682-7512	individually wrapped
dsRNA feeding library	OpenBiosystems	RCE1181	store -80 °C
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
Tetracycline	Fisher Scientific	BP912-100
Carbenicillin			allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com
Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A	Affymetrix	10906	for worm plates
Equipment
Brayer roller	USA Scientific	9127-2940
B–kel 96-pin replicator	Fisher Scientific	05-450-9	autoclavable
microshaker	Thomas Scientific	1231A93	3 mm orbit
12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl)	USA Scientific	7112-0510
12 channel multichannel pipet (30-300 μl)	USA Scientific	7112-3300
Repeater Plus manual pipettor	USA Scientific	4026-0201