Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Крупномасштабная Нокдаун гена в Published: September 25, 2013 doi: 10.3791/50693
Automatic Translation
1, 2, 3
1Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts, Amherst, 2Neuroscience and Behavior Program, University of Massachusetts, Amherst, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Massachusetts, Amherst

Summary

В то время как дсРНК кормления в С. Элеганс является мощным инструментом для оценки функции гена, настоящие протоколы для крупномасштабных экранов кормления привести к эффективности переменных бросовым. Мы описываем улучшенный протокол для выполнения крупномасштабных RNAi кормления экраны, что приводит к высокоэффективным и воспроизводимым нокдаун экспрессии генов.

Abstract

РНК-интерференция путем подачи черви бактерии, выражающие дцРНК был полезным инструментом для оценки функции гена в С. Элеганс. Хотя эта стратегия хорошо работает, когда небольшое число генов ориентированы на нокдаун, крупномасштабные экраны кормления показать эффективность переменных нокдаун, что ограничивает их полезность. Мы разобрали ранее опубликованные протоколы нокдаун RNAi и обнаружили, что основным источником уменьшенного нокдауна можно отнести к потере дцРНК-кодирующих плазмиды из бактерии, подаваемых на животных. На основании этих наблюдений, мы разработали протокол кормления дсРНК, что значительно уменьшает или устраняет потери плазмиды для достижения эффективного, высокую пропускную нокдаун. Мы показываем, что этот протокол будет производить надежные, воспроизводимые сбить из С. Элеганс гены в нескольких типов тканей, в том числе нейронов, и позволит эффективно нокдаун в больших экранах масштабных. Этот протокол использует имеющийся в продаже дсРНК кормлениебиблиотека и описывает все шаги, необходимые, чтобы дублировать библиотеку и выполнять экраны дцРНК. Протокол не требует использования какого-либо сложного оборудования и, следовательно, может быть выполнена любым С. Элеганс лабораторию.

Introduction

Исторически, генетические экраны в С. Элеганс были выполнены лечении животных с химическим мутагеном, таким как этиловый метансульфонат, чтобы создать случайные мутации в ДНК. Потомство или grandprogeny из мутагенизированных животных затем выделяют, которые проявляют желаемую аномальный фенотип. Мутация ответственность за причинение фенотип затем определены в ходе процедуры отображения трудоемкого или путем секвенирования всего генома мутантного червя. Есть много преимуществ для выполнения таких экранов химического мутагенеза, поскольку они создают постоянные поражения в червя генома, которые могут привести в обоих усиления из-функции и с потерей функции фенотипов, но процедура отображение медленный и дорогой.

Двухцепочечная РНК-интерференция (dsRNAi) предоставляет альтернативный способ для выявления генов, участвующих в важных биологических процессов. В этом методе, дцРНК соответствующие кодирующую последовательность эндогенного гена вводят в червя.ДсРНК обрабатывается в естественных условиях для создания небольших (21-22 нуклеотидов) РНК, которые служат направляющие, чтобы найти и связать подходящие эндогенных мРНК, ориентации их для уничтожения 1. Эта процедура является относительно быстро, а потому, что дсРНК цели мРНК, а не ДНК, только сокращение-из-функции фенотипы наблюдаются при использовании этого подхода.

Введение дцРНК в животное может быть достигнуто путем прямой инъекции дцРНК 2, путем замачивания животных в дцРНК 3, или по кормлению животных бактерий, которые экспрессируют дцРНК 4. Каждый из этих способов доставки вызывать системные нокдаун эффекты как большинство клетки животного выразить SID-1, трансмембранный канал, способный импорта дсРНК 5. Первоначально использовалась как обратной генетики подхода к нокдаун экспрессию отдельных генов по одному, развитие двух библиотек кормления теперь разрешает масштабные генетические экраны. В коммерчески доступные дцРНК библиотеки содержат баcterial клоны, представляющие либо 55% или 87% всех С. Элеганс гены 6, 7.

К сожалению, крупномасштабные экраны dsRNAi кормления часто приводят к эффективности переменных бросовым 8-10. В то время как абсолютный уровень нокдауна по RNAi не так легко измерить, уменьшается эффективность наблюдается в нокдаун больших экранов шкала должна быть вызвана остаточных Гено-специфические мРНК, которые ускользают от деградации РНК-интерференции. Это, в свою очередь, может быть прямым результатом дсРНК потери плазмиды от бактерий, подаваемых на животных в этих экранов. Подтверждением этой идеи, животных, которых кормили смеси бактерий, в котором только 50% бактерий выразить дцРНК против гена-мишени, показывают резко сократилось (если таковые имеются) нокдаун эффекты по сравнению с контрольными кормили животных 11. Степень гена нокдаун становится критической проблемой при выполнении экраны dsRNAi как большинство генов в С. Элеганс являются haplosufficient и, таким образом экспрессия гена должна быть снижена не менее чем на 50% то вызвать с потерей функции фенотипы 12.

Мы использовали ранее опубликованные протоколы кормления для выполнения крупномасштабных экраны и обнаружили те же самые изменяющиеся эффекты нокдаун, сообщенные другим 8-10. В поисках возможных причин, мы обнаружили, что почти 60% бактерий, подаваемых на животных в экране потерял плазмиды дсРНК. Мы разработали библиотеку дублирования и скрининга протокол, который резко уменьшает или устраняет потери плазмиды и значительно улучшает нокдаун эффективность. Этот протокол подходит для выполнения больших экранов масштабные в С. Элеганс и могут быть использованы для скрининга любой из коммерчески доступных библиотек дцРНК. Используя этот протокол, мы находим, что практически 100% бактерий, подаваемых на животных во время отображения экрана сохранить дсРНК-кодирования плазмиды и вызвать надежную и высоко проникающей потеря функции фенотипов во всех исследованных тканях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Этот протокол может быть использован, чтобы идентифицировать гены, необходимые для различных биологических процессах в различных типах тканей. В качестве контроля необходимо качества во время экрана, животные питаются как положительные, так и отрицательные контрольные дцРНК-выражения бактерии продемонстрировать RNAi эффекты в обрабатываемой области.

Другие опубликованные протоколы подачи расти дцРНК-экспрессирующих бактерий в присутствии либо 50 мкг / мл ампициллина или 25 мкг / мл карбенициллина 8-10. Мы обнаружили, что бактерии, выращенные в одно из этих условий потерять плазмиду дцРНК на высокой частоте. Действительно, мы обнаружили, что даже тогда, когда бактерии выращивали в течение ночи в очень высоких концентрациях (до 2 мг / мл) ампициллина более чем 50% бактерий, больше не содержат плазмиду. В то время как рост в карбенициллина целом привело к повышению удержания плазмиды, 25 мкг / мл было недостаточно, чтобы предотвратить потерю плазмиды. Вместо этого мы обнаружили, что карбенициллина концентрацииций 500 мкг / мл были необходимы, чтобы блокировать потери плазмиды в процессе роста в жидких культурах и 2 мг / мл карбенициллина требовалось, чтобы блокировать потери плазмиды, когда бактерии выращивали на чашках с твердых поверхностей.

Потому что сохранение плазмиды имеет решающее значение для успеха нокдаун, только карбенициллин используется при дцРНК бактерии культивируют в этом протоколе. Мы тщательно оптимизированы концентрацию карбенициллина, используемого в бактериальных культур роста, описанных в данном протоколе для того, чтобы бактерии, которые не содержат плазмиду не растут в этих культурах. Однако, в качестве меры контроля качества, потери плазмида определяется в несколько этапов протокола. Для обеспечения эффективного нокдаун, более 80% бактерий на каждом из этих этапов должен содержать дсРНК плазмиды. Если более 20% бактерий на любом этапе протокола потеряли плазмиды дсРНК, проверить качество карбенициллина используется. Карбенициллин следует приготовить свежую день он используется. Готовить свежий карбенициллин и повторите культуру.

1. Как определить, Plasmid Потеря

  1. Удалить небольшой образец бактерий (как описано в каждом соответствующем этапе) и добавить его в 450 мкл стерильной воды.
  2. С помощью 100 мкл разбавленного образца для создания дальнейшего 1:10, 1:100, 1:1000 и серийных разведений с использованием стерильной воды, смешивания растворов тщательно между разбавлением.
  3. Спрэд по 100 мкл каждого разведения на LB и LB AMP пластин и инкубировать эти листы в течение ночи при 37 ° С
  4. На следующий день, определить LB пластины, которая содержит от 100 до 500 бактериальных колоний. Подсчитайте количество колоний на этой пластине и на соответствующем LB AMP пластины (содержащий тот же разбавление бактерий).
  5. Определить потери плазмиды из этих подсчетов колоний. Процентов бактерий, которые не содержат плазмиду рассчитывается с помощью уравнения 1, и должна быть не менее 15% для эффективного дсРНК сбить.

</ HTML"Уравнение 1" Первоначально "/ files/ftp_upload/50693/50693eq1.jpg" />

2. Создание Плиты Дубликат Библиотека

Обзор: библиотека дцРНК прибудет от производителя (OpenBiosystems) в качестве 10566 бактериальных клонов в 96-луночных планшетах. Храните пластины сразу в -80 ° C морозильник. Оригинальной библиотеки пластины будет повторяться, и все питающие экраны будут использовать дубликатов библиотеки пластины в качестве источника бактерий. Желательно, чтобы сохранить оригинал и дубликат библиотеки пластин в отдельных морозильников. По простоте обращения, дублируя только 10 библиотек тарелки в день рекомендуется.

  1. Удалить библиотеки пластину (ы) от -80 ° C морозильник и снять пломбу фольги в то время культур по-прежнему заморожены. Замените пластиковую крышку Библиотека пластины и не установите пластину на ровную поверхность таять при комнатной температуре (не более 30 мин).

Примечание: Мы заметили, что значительная рercentage бактерий, обнаруженных в каждую лунку оригинальной библиотеки пластин не содержат плазмиду. Однако, так как библиотека бактерии драгоценный ресурс не рекомендуется для проверки потери плазмиды в оригинальных культур библиотеки.

  1. Использование многоканальной пипетки, добавить 150 мкл библиотеки дублирования СМИ в каждую лунку пустой 96-луночных плоскодонных дубликата пластины.
  2. Смешайте размороженные библиотеки бактериальные культуры с помощью пипетки вверх и вниз четыре-пять раз, используя многоканальную пипетку установлен в 100 мкл. Затем снимите 10 мкл каждой смешанной культуре и трансфер в соответствующие лунки дубликата пластины. Продолжить передать культур из библиотеки пластины дублировать пластину убедившись, что изменить пипеток советы для каждой передачи.
  3. После того как все культуры из библиотеки пластины были переданы, покрыть скважин от первоначальной библиотеки пластины с новой самоклеющейся пленкой с использованием Брейер ролик для обеспечения тщательного уплотнения. Замените пластиковую крышку на тарелку ипоместите его в вертикальном положении в -80 ° C морозильнике до культуры не замораживать (не менее 30 мин). Затем переместите оригинальные библиотеки тарелки обратно в библиотеке ящик для хранения.
  4. Встряхнуть дубликаты библиотек культуры пластины плоские для 8-10 часов при температуре 37 ° C (450 оборотов в минуту на Микрошейкер, орбиты 3 мм).
  5. Определить потери плазмиды в каждого дубликата библиотеки пластины. Мы обнаружили, что высокая доля бактерий в каждую лунку оригинальной библиотеки пластины не содержат дсРНК плазмиды. Важно, что эти бактерии не способствуют росту дубликата библиотеки. Чтобы предотвратить их рост, высокая концентрация карбенициллина используется в библиотеке дублирования информации (3 мг / мл). После культуры дублирования пластине с помощью этих условий мы обнаружили, что более 90% бактерий содержат дсРНК плазмиды. Удалить 10 мкл пробы из репрезентативной культуры лунку каждого дубликата тарелку и добавить его в 450 мкл стерильной воды. Используя эти разбавленных образцов, определить потери плазмиды в каждого дубликата библиотекеПластина по шагов 1.1-1.4. При обнаружении потери значительное плазмида (> 20% бактерий в дубликате библиотеки не содержат плазмиду), переделать культуральной среды с использованием свежих карбенициллин и повторить протокол с шага 2.1.
  6. После инкубации разместить новый клейкого листа фольги прямо над дубликатов планшета, и поместить пластины крышки над этим фольги. Поместите дубликаты библиотек пластин в вертикальном положении в -80 ° C морозильник (не менее 30 мин) до заморожены. После того, как замороженные, переместить пластины дубликата ящик для хранения библиотеки для долговременного хранения.

3. Создание временные копии библиотеки на Omniplates

Обзор: Для начала, чтобы приготовить еду для экрана дсРНК, бактерии из дубликатов библиотеки пластин передаются твердых агара omniplates и выращивали в течение ночи. Для предотвращения потери плазмиды на твердых средах, содержащих omniplates карбенициллина в 2 мг / мл. Бактерии на этих пластинах могут быть использованы в течение периодаиз одной недели, и нет никаких потерь плазмиды. Мы не тестировали для потери плазмиды бактерий, выращенных на omniplates более одной недели.

  1. Удалить дубликаты библиотеки пластину (ы) от -80 ° C морозильник и снять пломбу фольги в то время как культуры по-прежнему заморожены. После удаления фольги, заменить пластиковую крышку пластины и не установлен дубликат библиотеки пластину на ровную поверхность таять при комнатной температуре (не более 30 мин).
  2. Стерилизовать контактный репликатор Boekel 96. Колья чистой репликатора следует промыть дистиллированной водой и затем стерилизуют перед каждым использованием. Для стерилизации репликатор, поместите его в этанол (3/4 в глубоко в блюдо Pyrex), а затем записать этанола покрытия флажки с использованием горелку. Разрешить пламя потушить, а затем повторить.
  3. Поместите стерилизованное репликатор в лунки талой дубликата пластины и использовать его, чтобы аккуратно перемешать культур. Небольшие объемы культуры будет придерживаться к выводам репликатора.
    4. <литий> Осторожно снимите репликатор из скважин дубликата пластины и поместить его (булавки вниз) мягко на поверхности omniplate, стараясь не проколоть поверхность агара. Оставьте репликатор на поверхности omniplate в течение 3-4 сек, так что бактерии из штырей репликатора переносятся на поверхность агара.
  4. Снимите репликатор и позволить небольшой объем (2-3 мкл) бактериальной культуры, чтобы поглотить в агар. Инкубируйте omniplates перевернутые для 15-18 часов при температуре 37 ° С. Эти omniplates можно использовать следующим утром, чтобы привить 96 хорошо жидких культур. Кроме того, omniplates содержащие овернайт колоний бактерий могут храниться до семи дней при 4 ° С.
  5. Чтобы реплика-передачи дополнительных дублирующих пластин, промыть кончики репликатора стерильной водой и повторите процедуру стерилизации, поместив репликатор в этаноле и пламенный его дважды, как и прежде. После стерилизованы, репликатор может быть использован на следующей дубликата пластины.

4. Подготовка бактерий для кормления червей

ОБЗОР: Бактерии для кормления червей готовят в виде 1 мл жидких культур (в формате 96-луночного) с помощью бактерий из omniplates. Эти жидкие культуры выращивали в течение ночи, чтобы генерировать насыщенные nonlogarithmic бактериальные культуры. Быстро рост гарантирует, что все культуры будет содержать подобные концентрации бактерий и, следовательно, все черви будет подаваться то же самое количество пищи. Без потери плазмиды в течение этого роста не должны быть соблюдены.

  1. Разлить 1 мл бактериальной питательной среды в каждую лунку по 2 мл глубоких скважин 96-луночного планшета с использованием повторного пипетки и 50 мл наконечников Combitip.
  2. Поместите стерильную репликатор на поверхность omniplates, содержащих бактериальные колонии, сгенерированные с шагом 3,1-3,6 убедившись, что штифты находятся в контакте с каждой из 96 колоний бактерий.
  3. Осторожно переместите репликатор от поверхности omniplate в глубокую тарелку а убедившись, что штифты не скрести стороны глубоких скважин, пока не погружен в питательной среде. Перемещениерепликатор медленно в квадратной движения следующем внутренней стенке глубокой луночный планшет выбить бактерии в питательной среды. Будьте осторожны, чтобы не пролить и кросс загрязнять скважин.
  4. Контрольные лунки: Для каждого культурального планшета 96-луночный глубокой скважины добавить дцРНК-экспрессирующих бактерий в одной скважине, которые будут действовать в качестве положительного контроля для ожидаемого бросовой фенотипа и добавить бактерии, содержащие пустой вектор (дцРНК pL4440) в качестве отрицательного контроля к другому хорошо . Мы вновь полоса контроль дцРНК бактерии, экспрессирующие один раз в неделю на LB пластины, содержащие тетрациклин (15 мкг / мл) и карбенициллин (2 мг / мл) так, что бактерии остаются свежими и сохраняют плазмиды.
  5. Используя стерильный прививки петлю удалить один хорошо изолированы колонию от контрольной пластины (примерно такое же количество бактерий, передаваемых репликатора) и привить пустой колодец в глубокой культуры пластины а. Запись положение скважины, который был инокулированных. С другой стороны, петля с бактериями сбыть перемещены в пробирку Эппендорф, содержащей 250 мкл питательной среды, встряхивали и затем использовали для инокуляции несколько скважин.
  6. Встряхните глубоко луночных в плоском положении при 650 оборотах в минуту на Микрошейкер (орбита: 3 мм) при 37 ° С в течение ночи. Культуры будет насыщен на следующее утро. Несмотря на это, концентрация карбенициллина, используемого в этих культур должна предотвратить потерю плазмиды.
  7. Определить потери плазмиды в 1 мл ночных культур. Культуры будет использоваться непосредственно кормить червей для экрана. Важно, что более чем 80% бактерий в каждой культуре содержать дцРНК плазмиды. Определить потери плазмиды в течение двух представительных культур в соответствии с пунктами 1.1-1.4. Ожидание: Более 90% бактерий в каждой культуре будет содержать дцРНК плазмиды. Мы никогда не наблюдали значительные потери плазмиды в этих ночных культур, даже если выращенных к насыщению. Однако, если наблюдается потеря значительной плазмиды (> 20%), переделать СМИ роста свежих карбенициллин и репутациюсъесть протокол с шага 4.1. Культуры может быть перезапущен из исходных omniplates тех пор, пока omniplates меньше, чем 1-2 недель.
  8. После того, как используется для запуска 1 мл культурам, omniplates хранятся при 4 ° С, пока экран не будет завершена и может быть использован в качестве источника пищи, чтобы начать повторное тестирование любые культур.
  9. После инкубации в течение ночи культур, использовать многоканальную пипетку 12-канальный, чтобы удалить 150 мкл бактериальной культуры от глубокого луночного планшета и извлечь на поверхность подающего пластины. Важно, чтобы не проколоть поверхность агара во время передачи, как черви прятаться и не питаются дсРНК экспрессирующих бактерий. Передача может быть сделано четыре скважины за один раз (рис. 1). Чтобы сделать это, поместите наконечники на каждом третьем канале многоканальной пипетки (поскольку есть только 4 скважины на ряд в подающем пластины). После каждого набор из 4 скважин передается, изменить к новым, стерильные наконечники пипеток. Каждый 96-культура глубоко лунками потребует 96 советовдля передачи в восемь подающих пластин 12-луночных.
  10. Магазин высевают пластин в вертикальном положении в темном ночь так бактерии могут впитаться в агар.

5. Создание L1 Арестован C. Элеганс Личинки

Обзор: L1-арестован личинки используются для запуска синхронизации червь культуры на подающих пластин дсРНК. Эти личинки генерируются отбеливания популяции беременных взрослых изолировать здоровых яйца, а затем позволяя яйца вылупиться в S-полной СМИ без пищи. При отсутствии пищи вылупились личинки L1 будет задерживать развитие, генерирование синхронного население L1 личинок. Во экране, готовить свежий L1 арестован личинок каждую неделю, как эти голодали животные заболевают в течение долгого времени и должны быть уничтожены. Выбор генетического фона животных, используемых в штамме подачи дцРНК может изменяться в зависимости от применения, для нейрональных экранов Эри-1; лин-15B мутанты рекомендуется.

  1. Возьмите 10-20 L4 лаrvae шести отдельных NGM пластин, содержащих газон OP50 бактерий и не ждать 6-7 дней пока пластин содержит много свежих отложенные яйца и беременных взрослых.
  2. Удаление животных и яйца с пластин добавлением 3 мл воды к поверхности каждой пластины и использовать палец в перчатке, чтобы сместить яйца, бактерии и животных от поверхности каждой пластины в воду. Будьте уверены, чтобы покрыть все области пластины, обращая особое внимание на бактериальной газон. Удалить воду, бактерии, черви и яйца от каждой пластины с помощью стеклянной пипетки и трансфер в одной стерильной 50 мл коническую трубку.
  3. Добавить еще 3 мл воды к поверхности каждой пластины, пипетки вверх и вниз по всей поверхности, чтобы удалить все оставшиеся бактерии, черви и яйца. Добавить этот объем в 50 мл коническую трубку.
  4. Вращайте коническую трубку при 1500 оборотах в минуту в течение 1 мин в настольную центрифугу. Черви и яйца должны осаждения на дно трубки и бактерии должны оставаться приостановлено. Тщательно аспирата все, кроме 4 млжидкости из трубки будучи уверенным, чтобы избежать осаждали червей и яиц.
  5. Ресуспендируют осадок в червь остаточной воды и перенести в стерильный 15 мл коническую пробирку с помощью стеклянной пипетки. Довести объем до 10 мл стерильной воды.
  6. Отжим при 1500 оборотах в минуту в течение 1 мин, как раньше. Аспирируйте супернатант, оставляя 200 мкл воды, чтобы не нарушить червь / яйцо осадок.
  7. Добавить 10 мл воды в конической мыть червей и яйца и спин, как и раньше, чтобы удалить дополнительные бактерии.

внимание: В шаги 5.8-5.11 червей и яйца выдерживают в растворе хлорной извести. Bleach уничтожит червей и оставить яйца относительно невредимым. Однако, если яйца остаются в раствор отбеливателя слишком долго, они также будут уничтожены. Установите таймер, когда отбеливатель добавленную на шаге 5.8, чтобы быть уверенным, что яйца не остаются подвержены отбеливателя в течение более 10 мин.

  1. Удалить все, кроме 200 мкл надосадочной жидкости, снова избегая гранул, затем добавить 10мл раствора хлорной извести и запустить таймер.
  2. Выдержите червей и яиц в раствор отбеливателя для 3-4 мин, иногда смешивая инверсией. Тогда вращаются на 1500 оборотов в минуту в течение 45 секунд в настольной центрифуге. Посмотрите на гранулы в нижней части трубки, она должна быть меньше и более компактно, чем исходный гранул и может занять на желтом внешний вид.
  3. Аспирируйте раствор отбеливателя оставив 200 мкл за тем, чтобы не нарушить гранул.
  4. Добавьте еще 10 мл свежий раствор отбеливателя и инвертировать, как раньше. Когда таймер читает 10 мин, спина снова и аспирации раствор отбеливателя, оставив 200 мкл позади и быстро добавить 10 мл стерильной воды. Изучите раствора при вскрытии микроскопом. Личинки и многие из взрослых должен быть растворен в раствор отбеливателя, в результате чего в основном за яйца.
  5. Спин, как и прежде в течение 45 секунд и вновь аспирата супернатант, чтобы не нарушить гранул. Это осадок должен содержать, прежде всего, яйца и будет очень свободно.
  6. Добавить Anotее 10 мл воды, инвертировать смешивать, спин и аспирации, оставив немного воды позади. Важно, чтобы удалить столько гипохлоритом натрия, насколько это возможно.
  7. Добавить 4 мл S-полной среде в конической трубе, ресуспендируйте яйца и перенести в стерильную 100 мл колбу Эрленмейера. Поместите колбу в инкубаторе 20 ° C на шейкере движущегося просто достаточно быстро, чтобы вызвать содержимое колбы вертеться. Это обеспечит достаточную аэрацию поддержать личинок L1, когда они люк. В 15 часов все яйца должны быть отложены производить синхронный население L1 задержанных в развитии личинок.

Арестован личинки L1 должны быть сделаны свежие каждую неделю в течение экране. После того, как первая партия была сделана, последующие партии может быть запущен, добавив 500 арестованного L1 личинок (от партии на предыдущей неделе), чтобы каждый из четырех стандартных, посеянных 6 см пластинах (содержащие 100 мкл ночной культуры OP50), и инкубировали при 20 ° С в течение 4 дней. На четвертый день планшеты должны содержатьмного яиц и беременные взрослых и можно отбелить подготовить свежие яйца для более синхронизированной L1 личинок.

6. Передача Арестован L1 Личинки на кормления Тарелки

Обзор: Для выполнения экран дсРНК, 20-30 L1 арестован личинки переносят на дсРНК кормления пластин. Досрочную победу эффекты, такие как личинки ареста или летальности будет наблюдаться после животные питались дсРНК экспрессирующих бактерий в течение 2-3 дней. В зависимости от экрана, проведенного, желательные фенотипы могут наблюдаться либо в исходных животных, размещенных на пластине подачи (P0 животных) или в их потомства (F1 животных). Презентация фенотипа будет зависеть от целого ряда переменных, включая perdurance белка, кодируемого геном, экспрессия которого сбил и времени в процессе разработки, в которых требуется ген, представляющий интерес. Начиная кормления культур дцРНК только 20-30 животных должны разрешать наблюдать как P0 и F1 фенотипов доimals исчерпывается источник пищи.

Чтобы легко перенести 20-30 животных к питательным пластин, сначала определить концентрацию L1 арестован животных в арестованного L1 культуры.

  1. Смешайте колбу, содержащую арестован L1 личинок распространять животных.
  2. Удалить 10 мкл аликвоты и место каплям на качестве без затравки 6 см NGM пластины в 4-5 капель по центру пластины убедившись, что все средства массовой информации исключен из пипетки.
  3. Использование конец наконечника пипетки распространение точки червя суспензии в единую непрерывную линию жидкости, который охватывает диаметр пластины.
  4. Использование рассекает микроскопом, подсчет всех животных, начиная с одного конца линии жидкости и продолжая до другого конца до того, как жидкость всасывается в пластине, и животные разойтись. Для этого может потребоваться постоянное смещение акцента в рассекает сферу, чтобы быть уверенным, что ни одно животное не пропущены.
  5. Повторите эту процедуру для трех отдельных 10 мклаликвоты и усреднить три числа, чтобы определить среднее количество червей на мкл червя подвески и записать этот номер непосредственно на коническую колбу.

7. Начните кормления экран

Обзор: Чтобы начать экран дцРНК, 20-30 задержанных в развитии личинок L1 добавляют в каждую лунку 12-луночных планшетах, содержащих питающих тонкий газон дцРНК, экспрессирующих бактерий. Кормление пластины содержат стандартный питательной среды нематоды (NGM) и с добавлением 500 мкг / мл карбенициллина (чтобы предотвратить потерю плазмиды) и 1 мМ IPTG (для индукции экспрессии дцРНК). Животные разрешается кормить и развивать в течение нескольких дней при 20 ° C. Два типичных схем кормления животных 3 дня при выполнении экран P0 и 6-7 дней при выполнении экран F1. Продолжительность подачи, однако, можно варьировать в зависимости от конкретных фенотипов искать в экране.

  1. Используйте приостановку L1 задержанных в развитии личинок и стерильной воды для приготовления такLution содержащий 2000 червей / мл. Каждый кормления пластина 12-а будет требовать 120 мкл этого червя подвески. Тщательно перемешать, чтобы обеспечить равномерное распределение животных и передачи животных в стерильную емкость для пипетки.
  2. Используя многоканальную пипетку настроить с советами в каждом третьем положении (см. рис 1) передачу 10 мкл червячного раствор непосредственно на бактериальной лужайке подающих пластин. Будьте осторожны, не прокалывают поверхность агара, как черви зарываются в агар, а не питаются дсРНК экспрессирующих бактерий.
  3. Remix червячный решение в резервуаре (по мягко болтающихся его о) после каждых двух рядов подачи пластин, как черви решить быстро. Продолжить дозирования червячный подвеску, пока все питающие пластинки не имеют червей. Изучите несколько скважин на раннем этапе в рамках рассекает сферу, чтобы гарантировать, что каждый хорошо становится 20-30 червей.
  4. Храните пластины вертикально в увлажненной поле в инкубаторе 20 ° C. На следующий день, после того, как горегт подвеска вобрала в пластину, инвертировать тарелки и вернуться в хьюмидор при 20 ° С. Животные на этих пластин можно наблюдать после 3 дней (при р0 фенотипов) и снова через 6 дней (для F1 фенотипов).

внимание: Бактерии, которые остаются на кормления пластины после 7 дней роста червя были протестированы на потери плазмиды и почти 100% сохраняется плазмиды дсРНК.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

P0 нокдаун фенотип начнут появляться через 2-3 дней кормления животных дсРНК выражая бактерии. Некоторые ранние фенотипы включают личинок арест и летальность и должны наблюдаться в 2-3% всех питающих скважин. Эти же фенотипы будут наблюдаться в поколения F1. Наличие F1 яйца, которые не вылупляются является еще одним распространенным фенотип F1, и вместе, эти три фенотипа будет наблюдаться в почти 10% от всех скважин в экранах F1.

Мы использовали протокол, описанный здесь, чтобы исследовать эффекты нокдаун в течение нескольких генов, экспрессируемых в различных типах тканей, как для P0 и F1 фенотипов. Потому что мы также хотели, чтобы проверить на бросовым эффектов в нервной ткани, мы использовали Эри 1; лин-15B мутанты в наших экранах. Мутации в МЭО-1 и лин-15B, наряду с мутациями в СБР-3, были определены в экранах для мутаций, которые вызвали повышенную чувствительность к РНК-интерференции 8,13,14.

EGL-30, DPY-17, Пэт-10 и UNC-4. Два из этих генов, EGL-30 и UNC-4, выражаются в нервной системе 15-17 одного гена, погладить-10, выражается в стенки тела мышцы 18 и четвертом гена, DPY-17, выражается в гиподермальных клеток 19. Когда мы кормили МЭО-1; лин-15B животные бактерии, которые содержатся пустую pL4440 плазмиды, но не выражают дсРНК, мы не наблюдали никаких морфологических или поведенческие дефекты (рис. 2A, Таблица 1).

EGL-30, кодирует С. Элеганс ортолог белковой субъединицы G GAQ. EGL-30 нулевые мутанты арест во время раннего развития личинок, но некоторые нулевые Беглецы и гипоморфные с потерей функции EGL-30 мутанты расти, чтобы стать взрослая стадия и неполноценны в передвижении и откладки яиц поведения 20. Когдамы кормили L1 Этапа МЭО-1; lin15B личинки бактерии выражая EGL-30 дсРНК, мы обнаружили, что личинки росла, чтобы стать взрослым, которые показали четкие дефекты в передвижении и откладки яиц поведения. После трех дней, 100% животных кормили дсРНК против EGL-30 были парализованы и не в состоянии откладывать яйца (рис. 2Б, таблица 1). Мы не наблюдали фенотип личинок арест в наших экспериментах бросовым дсРНК, которая наблюдается в EGL-30 (ad810) нулевых животных. Предположительно это происходит потому, что L1 животные, которых мы высевали на EGL-30 дсРНК бактерий уже прошел раннее требование развития для EGL-30. Это подчеркивает преимущество экранов кормления: поздней стадии фенотипы можно наблюдать генов, которые также играют жизненно важную роль в процессе разработки.

DPY-17 кодирует белка коллагена, необходимого для формирования кутикулы в С. Элеганс 19. DPY-17 нулевые мутанты короче и толще, чем дикого типа Анимлов. Мы не наблюдали никаких морфологических дефектов в P0 животных, которых кормили DPY-17 дсРНК. Тем не менее, 98% из F1 животных показали DPY фенотип (рис. 2C, таблица 1). Отсутствие коротких и толстых P0 животных показывает, что DPY-17 Функция гена требуется на ранних личиночных стадиях для правильного морфологии тела. В то время как DPY-17 не был мишенью в других экранов кормления, это был сбит дсРНК инъекции 21. Интересно, что только 30% потомства дсРНК вводили животных показали фенотип DPY, предполагая, что протокол кормления описано здесь является более эффективным, чем более трудоемкого подхода инъекции, по крайней мере для некоторых генов.

погладить-10 кодирует тела стены мышц тропонина С, белок, содержащий четыре EF Ручные мотивы, которые связывают кальций 18. Мы нашли, что 100% Эри 1; лин-15B животные питались погладить-10 дсРНК парализовало в течение 3 дней и не наложил ни одного яйца ведущих тО.А. летальный фенотип (фиг. 2D, таблица 1).

UNC-4 кодирует гомеодоменовый белок, выраженное в вентральной мозга моторных нейронов и необходим для правильной синаптической ввода выбора 22,23. Мы выбрали UNC-4 как ген тест, потому что это, оказалось, был устойчив к предыдущим кормления стратегий дсРНК 8,24. UNC-4 мутанты обнаруживают дефект в поведении передвижения. В результате дефектов в синаптической связи, UNC-4 мутанты не могут поддержать 22,23. По сравнению с животных дикого типа, что еще свободно в синусоидальной движения, когда ткнул на голове, UNC-4 нулевые мутанты не назад, а вместо этого контракт их середины тела плотно, в результате чего спинной изгиб, который часто становится настолько велика, что голова и хвост животное прикосновение, поместив тело в спиральной положении. Мы обнаружили, что 68% животных, которых кормили UNC-4 дсРНК-выражающие бактерии от нашей библиотеке подготовки показали недостатки в баCking. Это резкое улучшение в нокдаун эффективности по сравнению с 0% бэк дефекта наблюдается, когда СБР-3 животных кормят UNC-4 дсРНК используя ранее опубликованные протоколы 8 (табл. 1).

Рисунок 1
Рисунок 1. Блок-схема библиотеки дублирования и крупномасштабного экране. Каждый 96 или 12-луночный планшет генерируется во время протокола скрининга указано, наряду с метода, используемого для передачи бактерий между пластинами. Звездочки указывают шаги, при которых бактерии должны быть проверены на потери плазмиды. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2
Рисунок 2. дцРНК нокдаун Фенотипы С. Элеганс гены, выраженные в различных типах тканей. A) Контрольные животные кормили бактерии, содержащие pL4440 пустой вектор. Черная стрела указывает положение молодой взрослого животного. Белая стрелка указывает положение группы отложенных яиц. Фотография показывает свободно движущихся животных, о чем свидетельствует их нормального положения тела. B) Животные подается дсРНК против EGL-30. Обратите внимание, что все животные приняли жесткую стал типичном парализованных животных. Также обратите внимание на полное отсутствие отложенных яиц на тарелке. C) Животные подается дсРНК против DPY-17. Обратите внимание, что взрослых животных в области (один отмечен стрелкой) короче и толще чем у взрослого животного, показанного на панели А. D) Животные подается дсРНК против погладить-10. Отметим, что все животные парализованы, но все еще может двигаться мышцы головы кормить, как указано очистки бактерий вблизи головы, отмечен стрелкой. Шкала бар 1 мм.

дсРНК плазмиды или ген мишенью FeEding Ткань выражение гена-мишени Процент животных с фенотипа терминала
pL4440 (отрицательный контроль) дикого типа для всех поведения
EGL-30 нервная система 100% Egl и Парализованный
DPY-17 гиподерма 98% DPY
погладить-10 стены мышцы тела 100% Парализованный
UNC-4 нервная система 68% Резервное Дефект

Таблица 1. Терминал фенотип животных, которых кормили дсРНК против генов, выраженных в различных C. Элеганс тканей. п = 100 для всех генов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы описали протокол, который использует имеющийся в продаже библиотеку подачи дсРНК выполнять крупномасштабные экраны в С. Элеганс. Мы предоставляем все инструкции, чтобы дублировать библиотеку и использовать ее эффективно. Показано, что этот подход может идентифицировать гены, участвующие в различных биологических процессах в различных тканях животного. В то время как фенотипы мы описываем здесь легко наблюдаемых (UNC, Egl и DPY), этот протокол может быть адаптирован для поиска генов, необходимых для почти любого биологического процесса. Например, мы использовали этот протокол для идентификации генов, необходимых для нейропередачи в червя 25. После того, как животные питались бактерий, экспрессирующих дцРНК (обычно 3 дня P0 экранов, 6-7 дней для экранов F1), они могут быть удалены из подающего пластины и испытаны для любого фенотипа поведенческой.

Потеря плазмиды:

Мы обнаружили, что снижение эффективности нокдаун наблюдали в течениекрупномасштабные дцРНК экраны могут быть непосредственно отнесены к потере дцРНК плазмиды из бактерии, подаваемых на червей. Потери плазмиды происходит в бактериальных культур роста, так как β-лактамазы, закодированы на плазмидной библиотеки дцРНК, действует деградировать как ампициллин и карбенициллин, снижение концентрации этих антибиотиков в течение долгого времени. Когда концентрация антибиотика становится достаточно низкой, бактерии, которые не содержат плазмиду могут выживать и заполнить культуры. Использование таких смешанных бактериальных культур в экранах дсРНК следует избегать, так как они показывают снижение активности нокдаун и часто не вызывают с потерей функции фенотипы 11. Удивительно, но мы обнаружили, что высокие уровни потери плазмиды происходить даже в бактериальных культур, выращенных в очень высокой концентрации ампициллина (до 2 мг / мл). В то время как карбенициллин более устойчив к деградации по β-лактамазы, мы все еще сочли необходимым использовать концентрации карбенициллина, которые были 10-40 раз выше, чем тех,используется в ранее опубликованных дсРНК кормления экранов 8-10,26 обеспечить, чтобы все бактерии в культуре сохраняется плазмиды дсРНК.

Потому что большинство генов в С. Элеганс являются haplosufficient, крайне важно, чтобы все бактерии питаются животным выразить дсРНК. Это гарантирует высокоэффективную гена нокдаун и увеличивает вероятность наблюдения с потерей функции фенотипы в крупномасштабных экранов.

Положительный и отрицательный контроли:

Очень важно, чтобы включать в себя как положительные, так и отрицательные бактерии управления в каждой подачи пластины при выполнении экраны. Отрицательный контроль особенно важно, если поведенческие тесты будут использованы для идентификации генов, представляющих интерес. Для отрицательного контроля мы используем бактерии, содержащие пустой вектор pL4440. Для положительного контроля, то лучше использовать бактерии, которые выражают дсРНК против гена, который вызывает нужный фенотип нокдаун. Однако, если нет таких генов не знаюN, положительный контроль для нокдауна следует использовать, что приводит к легко наблюдаемый фенотип. При выборе такой ген, предпочтение следует отдавать генов, которые экспрессируются в типе ткани целевой на экране. Например, в дцРНК экранов кормления нейронный фенотипы, нейронов ген должен быть выбран в качестве положительного контроля. Наблюдается нокдаун эффект у животных, питающихся положительных бактерий управления будет указано, что вмешательство дсРНК работает в нужном типа ткани.

Лучше всего, если человек забил кормления пластины для фенотипов слепа к месту положительных контрольных лунок. Заслон должен быть в состоянии легко определить положительный колодец в каждом 96-луночный планшет. Для поведенческих тестах это полезно сначала забить негативное хорошо перед сканированием оставшиеся скважин.

Пропускная способность:

Используя этот протокол, один человек должен быть в состоянии настроить и экран 16, 12-луночныхв день. Для перемещения эффективно через библиотеку, мы вообще проверить каждую лунку каждого библиотеки пластины только один раз во время экрана. Любые скважины, которые оценивали как положительные записываются и повторно в трех экземплярах. Мы требуем, чтобы положительные скважин повторное тестирование во всех трех повторных испытаний. Плазмида затем очищают от бактерий и вставка секвенировали, чтобы положительно идентифицировать ген. Если нулевые мутанты доступны для гена, мы можем предложить их и проверки нулевой животных для поведенческого дефекта, указанного в экране.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана за счет средств Национального института здравоохранения MH097163. Некоторые штаммы были предоставлены CGC, который финансируется по NIH Управления научно-исследовательских программ в области инфраструктуры (P40-OD010440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
96-well Falcon flat bottom plate Fisher Scientific 353072 sterile
adhesive foil USA Scientific 2923-0100
Nunc omniplate Fisher Scientific 267060
2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock USA Scientific 5678-0285 autoclavable
Lids for deep well plates USA Scientific 5665-6101
50 ml combitips USA Scientific 4796-5000 individually wrapped
Reservoir USA Scientific 2977-8500 autoclavable
12-well plates USA Scientific CC7682-7512 individually wrapped
dsRNA feeding library OpenBiosystems RCE1181 store -80 °C
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-5
Tetracycline Fisher Scientific BP912-100
Carbenicillin allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com
Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A Affymetrix 10906 for worm plates
Equipment
Brayer roller USA Scientific 9127-2940
B–kel 96-pin replicator Fisher Scientific 05-450-9 autoclavable
microshaker Thomas Scientific 1231A93 3 mm orbit
12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl) USA Scientific 7112-0510
12 channel multichannel pipet (30-300 μl) USA Scientific 7112-3300
Repeater Plus manual pipettor USA Scientific 4026-0201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mello, C. C., Conte, D. Jr Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
  2. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  3. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
  4. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
  5. Jose, A. M., Smith, J. J., Hunter, C. P. Export of RNA silencing from C. elegans tissues does not require the RNA channel SID-1. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2283-2288 (2009).
  6. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  7. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
  8. Simmer, F., et al. Genome-wide RNAi of C. elegans using the hypersensitive rrf-3 strain reveals novel gene functions. PLoS Biol. 1, 77-84 (2003).
  9. Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat. Genet. 33 (1), 40-48 (2003).
  10. Sieburth, D., et al. Systematic analysis of genes required for synapse structure and function. Nature. 436 (7050), 510-517 (2005).
  11. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), (2001).
  12. Hodgkin, J. Karyotype, ploidy, and gene dosage. WormBook. , 1-9 (2005).
  13. Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).
  14. Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436 (7050), 593-597 (2005).
  15. Lackner, M. R., Nurrish, S. J., Kaplan, J. M. Facilitation of synaptic transmission by EGL-30 Gqalpha and EGL-8 PLCbeta: DAG binding to UNC-13 is required to stimulate acetylcholine release. Neuron. 24 (2), 335-346 (1999).
  16. Bastiani, C. A., Gharib, S., Simon, M. I., Sternberg, P. W. Caenorhabditis elegans Galphaq regulates egg-laying behavior via a PLCbeta-independent and serotonin-dependent signaling pathway and likely functions both in the nervous system and in muscle. Genetics. 165 (4), 1805-1822 (2003).
  17. Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. J. Neurosci. 21 (6), 2001-2014 (2001).
  18. Terami, H., et al. Genomic organization, expression, and analysis of the troponin C gene pat-10 of Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 146 (1), 193-202 (1999).
  19. Novelli, J., Page, A. P., Hodgkin, J. The C terminus of collagen SQT-3 has complex and essential functions in nematode collagen assembly. Genetics. 172 (4), 2253-2267 (2006).
  20. Brundage, L., et al. Mutations in a C. elegans Gqalpha gene disrupt movement, egg laying, and viability. Neuron. 16 (5), 999-1009 (1996).
  21. Gönczy, P., et al. Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature. 408 (6810), 331-336 (2000).
  22. Miller, D. M., et al. elegans unc-4 gene encodes a homeodomain protein that determines the pattern of synaptic input to specific motor neurons. Nature. 355, 841-845 (1992).
  23. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. Mutations in the Caenorhabditis elegans unc-4 gene alter the synaptic input to ventral cord motor neurons. Nature. 355, 838-841 (1992).
  24. Johnson, N. M., Behm, C. A., Trowell, S. C. Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome. Gene. 359, 26-34 (2005).
  25. Wani, K. A., et al. D1 dopamine receptor signaling is modulated by the R7 RGS protein EAT-16 and the R7 binding protein RSBP-1 in Caenoerhabditis elegans motor neurons. PLoS One. 7 (5), e37831 (2012).
  26. Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi screening to identify postembryonic phenotypes in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3442 (2012).

Tags

Биология развития выпуск 79 Caenorhabditis Элеганс (C. Элеганс) методы Нокдаун гена, Вмешательство дсРНК ген нокдаун экран крупномасштабное кормления
Крупномасштабная Нокдаун гена в<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Использование дцРНК кормления библиотек для генерации Прочные с потерей функции фенотипов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maher, K. N., Catanese, M., Chase,… More

Maher, K. N., Catanese, M., Chase, D. L. Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes. J. Vis. Exp. (79), e50693, doi:10.3791/50693 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter