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Biology

À grande échelle Gene Knockdown dans Published: September 25, 2013 doi: 10.3791/50693
Automatic Translation
1, 2, 3
1Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts, Amherst, 2Neuroscience and Behavior Program, University of Massachusetts, Amherst, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Massachusetts, Amherst

Summary

Bien que l'ARN double brin d'alimentation en C. elegans est un outil puissant pour évaluer la fonction des gènes, les protocoles actuels pour les écrans d'alimentation à grande échelle entraînent des économies de knockdown variables. Nous décrivons un protocole amélioré pour réaliser des écrans d'alimentation d'ARNi à grande échelle qui se traduit par effet de choc très efficace et reproductible de l'expression génique.

Abstract

L'interférence ARN en se nourrissant de vers bactéries exprimant des ARN double brin a été un outil utile pour évaluer la fonction des gènes dans C. elegans. Bien que cette stratégie fonctionne bien quand un petit nombre de gènes sont ciblés pour effet de choc, écrans d'alimentation à grande échelle montrent l'efficacité de knockdown variables, ce qui limite leur utilité. Nous avons déconstruit protocoles de knockdown ARNi déjà publiées et a constaté que la principale source de l'effet de choc réduite peut être attribuée à la perte de plasmides ARNdb codant des bactéries nourris aux animaux. Sur la base de ces observations, nous avons développé un protocole d'alimentation ARN double brin qui réduit ou élimine la perte de plasmide de réaliser avec efficacité, effet de choc à haut débit grandement. Nous démontrons que ce protocole va produire robuste, reproductible coup bas de C. elegans gènes dans différents types de tissus multiples, y compris les neurones, et permettront knockdown efficace dans les grands écrans de grande envergure. Ce protocole utilise un ARN double brin alimentation disponible dans le commercebibliothèque et décrit toutes les étapes nécessaires pour reproduire la bibliothèque et effectuer écrans ARN double brin. Le protocole ne requiert pas l'utilisation de tout équipement sophistiqué, et peut donc être réalisée par toute C. elegans laboratoire.

Introduction

Historiquement, les écrans génétiques dans C. elegans ont été réalisées par le traitement des animaux avec un agent mutagène chimique tel que le méthanesulfonate d'éthyle pour créer des mutations aléatoires dans l'ADN. Descendance ou grandprogeny des animaux ayant subi une mutagénèse sont ensuite isolés qui présentent un phénotype anormal souhaitée. La mutation responsable de causer le phénotype est alors identifié par une procédure de cartographie de main-d'œuvre ou par séquençage de tout le génome du ver mutant. Il ya de nombreux avantages à l'exécution de ces écrans de mutagenèse chimique car ils créent des lésions permanentes au sein du génome du ver qui peuvent résulter dans les deux phénotypes gain de fonction et la perte de fonction, mais la procédure de cartographie est lent et coûteux.

Interférence de l'ARN double brin (dsRNAi) fournit un autre moyen pour identifier les gènes impliqués dans des processus biologiques importants. Dans ce procédé, l'ARN double brin correspondant à la séquence codante d'un gène endogène est introduite dans la vis sans fin.L'ARNdb est traitée in vivo pour générer de petites (21-22 nucléotides) ARN qui servent de guides pour trouver et se lient les ARNm endogènes correspondants, en les ciblant pour la destruction 1. Cette procédure est relativement rapide, mais parce que l'ARN double brin cible ARNm plutôt que l'ADN, seuls phénotypes réduction de fonction sont observées en utilisant cette approche.

Introduction d'ARN double brin dans un animal peut être réalisée par injection directe de l'ARN double brin 2, en trempant les animaux dans ARNdb 3, ou par l'alimentation des animaux des bactéries qui expriment des ARN double brin 4. Chacune de ces méthodes de livraison entraîner des effets systémiques knockdown que la plupart des cellules de l'animal expriment SID-1, un canal transmembranaire capable d'importer des ARN double brin 5. Initialement utilisé comme une approche de génétique inverse pour knockdown de l'expression des gènes individuels un à la fois, le développement de deux bibliothèques d'alimentation permet maintenant écrans génétiques à grande échelle. Les bibliothèques ARNdb disponibles dans le commerce contiennent baclones cterial représentant soit 55% ou 87% de l'ensemble C. elegans gènes 6, 7.

Malheureusement, écrans dsRNAi d'alimentation à grande échelle se traduisent souvent par l'efficacité de knockdown variables 8-10. Alors que le niveau absolu de knockdown par ARNi n'est pas facile à mesurer, l'efficacité de knockdown réduite observée dans de grands écrans d'échelle doit être causé par des ARNm spécifiques du gène résiduelles qui échappent dégradation par ARNi. Ceci, à son tour, pourrait être une conséquence directe de la perte de l'ARN double brin plasmidique à partir de bactéries à des animaux nourris dans ces écrans. L'appui de cette idée, les animaux nourris des mélanges de bactéries, dont seulement 50% des bactéries exprimer ARNdb contre un gène ciblé, montrent considérablement réduit (le cas échéant) des effets knockdown par rapport aux animaux témoins nourris 11. L'étendue de la inactivation génique devient une préoccupation essentielle lors de l'exécution écrans dsRNAi que la plupart des gènes dans C. elegans sont haplosufficient et donc l'expression des gènes doivent être réduites d'au moins 50% to causer la perte de fonction de 12 phénotypes.

Nous avons utilisé les protocoles d'alimentation précédemment publiées pour effectuer grands écrans et trouvé les mêmes effets knockdown variables signalées par d'autres 8-10. Dans une recherche des causes possibles, nous avons constaté que près de 60% des bactéries alimentation des animaux dans l'écran avait perdu le plasmide ARN double brin. Nous avons développé une duplication et le dépistage protocole bibliothèque qui réduit considérablement ou élimine la perte de plasmide et améliore grandement l'efficacité knockdown. Ce protocole est apte à effectuer de grands écrans d'échelle dans C. elegans et peut être utilisé pour cribler une ou l'autre des bibliothèques d'ARNdb disponibles dans le commerce. En utilisant ce protocole, nous constatons que pratiquement 100% des bactéries alimentation des animaux pendant l'écran de conserver le plasmide codant l'ARN double brin et causer la perte robuste et très pénétrant de phénotypes de fonction dans tous les tissus examinés.

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Protocol

Remarque: Ce protocole peut être utilisé pour identifier les gènes requis pour une variété de processus biologiques dans une variété de types de tissus. Comme un contrôle de qualité nécessaire au cours de l'écran, les animaux sont nourris à la fois positif et négatif bactéries ARNdb exprimant contrôle pour démontrer les effets de RNAi dans le tissu ciblé.

D'autres protocoles d'alimentation publiées croître les bactéries exprimant l'ARN double brin en présence de soit 50 pg / ml d'ampicilline ou 25 ug / ml de carbénicilline 8-10. Nous avons découvert que les bactéries cultivées dans l'une de ces conditions perdent le plasmide ARNdb à haute fréquence. En effet, nous avons constaté que, même lorsque les bactéries sont cultivées pendant une nuit dans des concentrations très élevées (jusqu'à 2 mg / ml d'ampicilline) à plus de 50% des bactéries ne contiennent plus de plasmide. Alors que la croissance dans carbenicilline généralement abouti à une meilleure rétention du plasmide, 25 pg / ml n'a pas été suffisante pour empêcher la perte de plasmide. Au lieu de cela, nous avons constaté que la concentration carbenicillinetions de 500 pg / ml ont été nécessaires pour bloquer la perte de plasmide pendant la croissance dans des cultures liquides et 2 mg / ml de carbénicilline a été nécessaire pour bloquer la perte de plasmide quand les bactéries ont été cultivées sur des substrats de gélose solide.

Parce que la rétention de plasmide est essentielle à la réussite de knockdown, ne carbenicilline est utilisé lorsque les bactéries sont cultivées dans ARNdb ce protocole. Nous avons soigneusement optimisé la concentration de carbenicilline utilisé dans les cultures de la croissance bactérienne décrites dans le présent protocole pour s'assurer que les bactéries qui ne contiennent pas plasmide ne poussent pas dans ces cultures. Toutefois, à titre de mesure de contrôle de qualité, la perte de plasmide est déterminée à plusieurs étapes du protocole. Pour assurer knockdown efficace, plus de 80% des bactéries à chacune de ces étapes doit contenir ARNdb plasmide. Si plus de 20% des bactéries à n'importe quelle étape du protocole ont perdu le plasmide ARN double brin, vérifier la qualité de la carbénicilline utilisé. Carbénicilline doit être préparé le jour où il est utilisé. Préparer carbenicilline frais et recommencer la culture.

Une. Comment faire pour déterminer la perte de plasmide

  1. Suppression d'un petit échantillon de bactéries (comme décrit à chaque étape pertinente) et l'ajouter à 450 pi d'eau stérile.
  2. Utilisez 100 pi de cet échantillon dilué pour créer davantage de 1:10, 1:100 et 1:1000 dilutions en série avec de l'eau stérile, mélangeant les solutions soigneusement entre dilution.
  3. Étaler 100 ul de chaque dilution sur des plaques LB et LB AMP et incuber ces plaques pendant une nuit à 37 ° C.
  4. Le jour suivant, identifier la plaque LB contenant entre 100 et 500 colonies bactériennes. Compter le nombre de colonies sur cette plaque et sur la plaque LB AMP correspondant (contenant la même dilution de bactéries).
  5. Déterminer la perte de plasmide de ces comptages de colonies. Le pour cent des bactéries qui ne contiennent pas le plasmide est calculé en utilisant l'équation 1, et devrait être inférieur à 15% pour l'ARN double brin efficace abattre.

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2. Faire Dupliquer Bibliothèque plaques

Vue d'ensemble: La bibliothèque ARNdb arrivera par le fabricant (OpenBiosystems) que 10 566 clones bactériens dans des plaques à 96 puits. Stocker les plaques immédiatement -80 ° C congélateur. Les plaques de la bibliothèque d'origine seront dupliqués et tous les écrans d'alimentation utilisent les plaques de bibliothèques en double comme source de bactéries. Il est conseillé de stocker l'original et le double plaques bibliothèque dans des congélateurs séparés. Pour la facilité de manipulation, la duplication seulement 10 plaques de la bibliothèque par jour est recommandé.

  1. Retirer la plaque (s) bibliothèque de -80 ° C congélateur et retirez le papier d'aluminium tandis que les cultures sont encore gelés. Remettre le couvercle en plastique de la plaque bibliothèque et mettre la plaque sur une surface plane à décongeler à température ambiante (ne dépassant pas 30 minutes).

Remarque: Nous avons remarqué que significative pourcentage de bactéries présentes dans chaque puits des plaques de la bibliothèque d'origine ne contient pas de plasmide. Cependant, parce que les bactéries de la bibliothèque sont une ressource précieuse, il n'est pas recommandé de tester pour la perte de plasmide dans les cultures de la bibliothèque d'origine.

  1. En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 150 ul de milieu de duplication bibliothèque dans chaque puits d'un fond plat de 96 puits plaque double vide.
  2. Mélanger les cultures bactériennes bibliothèque décongelés par aspiration et refoulement quatre à cinq fois à l'aide d'une pipette multicanaux fixé à 100 pi. Retirez ensuite 10 pi de chaque culture mixte et transférer dans les puits correspondants de la plaque double. Continuer à transférer cultures de plaque bibliothèque de reproduire plaque en s'assurant de changer les embouts de pipette pour chaque transfert.
  3. Après toutes les cultures à partir d'une plaque bibliothèque ont été transférés, couvrir les puits de la plaque bibliothèque originale avec une nouvelle feuille adhésive à l'aide d'un rouleau Brayer pour assurer une étanchéité complète. Remettez le couvercle en plastique sur la plaque etplacer en position verticale dans un congélateur à -80 ° C jusqu'à ce que les cultures ont recongelé (au moins 30 minutes). Puis déplacer les plaques de la bibliothèque d'origine de retour dans une boîte de rangement bibliothèque.
  4. Secouez double cultures de plaque bibliothèque plats pour les 8-10 heures à 37 ° C (450 rpm sur un microshaker, orbite 3 mm).
  5. Déterminer la perte de plasmide dans chaque plaque bibliothèque double. Nous avons constaté qu'une forte proportion de bactéries dans chaque puits de la plaque bibliothèque d'origine ne contient pas ARNdb plasmide. Il est important que ces bactéries ne contribuent pas à la croissance en double dans la bibliothèque. Pour empêcher leur croissance, une forte concentration de la carbénicilline est utilisé dans la bibliothèque multimédia de duplication (3 mg / ml). Après la culture de la plaque de duplication en utilisant ces conditions, nous avons constaté que plus de 90% des bactéries contiennent ARNdb plasmide. Retirer 10 ul d'échantillon provenant d'un puits de culture représentant de chaque plaque double et l'ajouter à 450 pi d'eau stérile. L'utilisation de ces échantillons dilués, déterminer la perte de plasmide dans chaque bibliothèque doubleplaque selon les étapes 1.1 à 1.4. Si la perte de plasmide significative est observée (> 20% des bactéries de la bibliothèque ne contiennent pas de double plasmide), refaire le milieu de culture à l'aide de la carbénicilline frais et répéter le protocole de l'étape 2.1.
  6. Après incubation, placez une nouvelle feuille adhésive en aluminium directement sur les puits d'une plaque en double, et placer les couvercles de la plaque sur cette feuille. Placez les plaques de la bibliothèque double verticale dans un congélateur à -80 ° C (au moins 30 minutes) jusqu'à congélation. Une fois congelés, déplacer les plaques de la zone de stockage de la bibliothèque double pour le stockage à long terme.

3. Faire des copies temporaires de la Bibliothèque sur Omniplates

Présentation: Pour commencer à préparer la nourriture pour un écran ARN double brin, les bactéries à partir de plaques de bibliothèques en double sont transférés à omniplates gélose solide et cultivées pendant une nuit. Pour éviter la perte du plasmide sur un support solide, contient le omniplates carbénicilline à 2 mg / ml. Les bactéries sur ces plaques peuvent être utilisées pendant une périoded'une semaine, et ne montrent aucune perte de plasmide. Nous n'avons pas testé pour la perte de plasmide dans les bactéries cultivées sur omniplates plus d'une semaine.

  1. Retirer la plaque de la bibliothèque double (s) à partir de -80 ° C congélateur et enlever le papier d'aluminium tandis que les cultures sont encore gelés. Après avoir retiré la feuille, remettre le couvercle en plastique de la plaque et mettre la plaque bibliothèque double sur une surface de niveau décongeler à température ambiante (pas plus de 30 min).
  2. Stériliser la broche réplicateur Boekel 96. Les broches d'un réplicateur propres doivent être rincés à l'eau distillée, puis stérilisés avant chaque utilisation. Pour stériliser le réplicateur, placez-le dans un bain d'éthanol (3/4 po de profondeur dans un plat en pyrex), puis de graver la éthanol revêtement des broches de l'aide d'un bec Bunsen. Laisser la flamme s'éteint, puis répéter.
  3. Placez le réplicateur stérilisé dans les puits de la plaque double décongelé et l'utiliser pour remuer doucement les cultures. De petits volumes de la culture doivent respecter les broches du réplicateur.
    4. <li> Retirez délicatement le réplicateur de les puits de la plaque double et placez-le (broches vers le bas) sur la surface de la omniplate, en faisant attention de ne pas percer la surface de la gélose. Laissez le réplicateur sur la surface de la omniplate 3-4 sec sorte que les bactéries des broches du réplicateur sont transférées sur la surface de la gélose.
  4. Retirez le réplicateur et laisser le petit volume (2-3 pi) de la culture bactérienne à absorber dans la gélose. Incuber les omniplates inversées pour 15-18 heures à 37 ° C. Ces omniplates peuvent être utilisés le lendemain matin pour inoculer 96 cultures et liquides. Sinon, omniplates contenant des colonies bactériennes nuitées peuvent être stockés jusqu'à sept jours à 4 ° C.
  5. Pour réplique de transfert de plaques en double supplémentaires, rincer les conseils du réplicateur avec de l'eau stérile et répéter le processus de stérilisation en plaçant le réplicateur dans l'éthanol et flamboyant deux fois, comme avant. Une fois stérilisé, le réplicateur peut être utilisé sur la prochaine plaque double.

4. Préparation des bactéries pour l'alimentation Worms

OA perçu: bactéries pour vis d'alimentation sont préparés comme cultures de 1 ml de liquide (dans un format de 96 puits) en utilisant des bactéries des omniplates. Ces cultures liquides sont cultivées pendant une nuit pour produire des cultures bactériennes non logarithmiques saturés. Croissance d'une nuit veille à ce que toutes les cultures contiennent des concentrations similaires de bactéries et donc tous les vers seront nourris de la même quantité de nourriture. Pas de perte de plasmide au cours de cette croissance devrait être observée.

  1. Distribuer 1 ml de milieu de croissance bactérienne dans chaque puits de 2 ml puits profond plaques à 96 puits en utilisant une pipette de répétition et 50 ml Combitip.
  2. Placer réplicateur stérile sur la surface de omniplates contenant des colonies bactériennes produites dans les étapes 3.1 à 3.6 en veillant à ce que les broches sont en contact avec chacun des 96 colonies bactériennes.
  3. Avec précaution déplacez le réplicateur de la surface de la omniplate dans la plaque de puits profond en vous assurant que les broches ne pas gratter les côtés des puits profonds jusqu'à immergé dans un milieu de croissance. Déplacez leréplicateur lentement dans un mouvement carré suivant la paroi interne de la plaque de puits profond pour déloger les bactéries dans le milieu de croissance. Faites attention de ne pas éclabousser et croix contaminent les puits.
  4. Les puits de contrôle: Pour chaque plaque de culture 96 puits profond bien ajouter une bactérie ARNdb exprimant à un bien qui va agir comme un contrôle positif pour le phénotype knockdown prévu et ajouter des bactéries contenant vide ARNdb vecteur (pL4440) comme contrôle négatif à un autre bien . Nous re-série contrôle ARNdb exprimant bactéries une fois par semaine sur des plaques LB contenant de la tetracycline (15 pg / ml) et carbenicilline (2 mg / ml), de sorte que les bactéries restent frais et conservent plasmide.
  5. En utilisant une boucle d'inoculation stérile supprimer une seule colonie bien isolée de la plaque de contrôle (environ la même quantité de bactéries transférées par le réplicateur) et inoculer un puits vide dans la plaque de culture de puits profond. Notez la position du puits qui a été inoculé. Sinon, la boucle avec les bactéries cun être déplacé dans un tube Eppendorf contenant 250 ul de milieu de croissance, puis agité au vortex et utilisées pour inoculer plusieurs puits.
  6. Agiter les plaques à puits profonds dans une position à plat à 650 rpm sur microshaker (orbite: 3 mm) à 37 ° C pendant la nuit. Les cultures seront saturés par le lendemain matin. Quoiqu'il en soit, la concentration de la carbénicilline utilisé dans ces cultures devraient empêcher la perte de plasmide.
  7. Déterminer la perte de plasmide dans les cultures 1 ml d'une nuit. Les cultures seront utilisés directement pour nourrir les vers à l'écran. Il est important que plus de 80% de la bactérie dans chaque culture contient l'ARN double brin plasmidique. Déterminer la perte de plasmide de deux cultures représentatives selon les étapes 01.01 à 01.04. Attente: Plus de 90% des bactéries dans chaque culture contiendra ARNdb plasmide. Nous n'avons jamais observé une importante perte de plasmide dans ces cultures de la nuit, même lorsque cultivé à saturation. Cependant, si la perte de plasmide significative est observée (> 20%), refaire le milieu de croissance à l'aide de la carbénicilline fraîche et repmanger protocole de l'étape 4.1. Les cultures peuvent être renouvelées dans les omniplates origine tant que les omniplates sont âgés de moins de 1-2 semaines.
  8. Une fois utilisé pour démarrer cultures de 1 ml, les omniplates sont conservés à 4 ° C jusqu'à ce que l'écran est terminée et peut être utilisé comme une source de nourriture pour démarrer des cultures de contre-essais.
  9. Après une nuit d'incubation des cultures, utiliser une pipette multicanaux 12 canaux pour éliminer 150 pl de la culture bactérienne à partir de la plaque à puits profond et éjecter sur la surface de la plaque d'alimentation. Il est important de ne pas percer la surface de la gélose pendant le transfert que vers s'enfouissent et pas nourrir les bactéries exprimant l'ARN double brin. Le transfert peut être effectué quatre puits à la fois (figure 1). Pour ce faire, placez les embouts de pipette sur chaque troisième canal de la pipette multicanaux (comme il n'y a que 4 puits par ligne de la plaque d'alimentation). Après chaque série de 4 puits est transféré, changer à nouveau, embouts de pipette stériles. Chaque plaque 96 de la culture profonde de bien, il faudra 96 ​​conseilspour le transfert de huit plaques de 12 puits d'alimentation.
  10. Magasin plaques ensemencées debout dans la nuit sombre si les bactéries peuvent absorber dans la gélose.

5. Génération L1 arrêté C. elegans larves

Vue d'ensemble: les larves L1-arrêté sont utilisés pour démarrer les cultures de vers synchronisés sur les plaques d'alimentation d'ARN double brin. Ces larves sont générés par le blanchiment des populations d'adultes gravides à isoler des oeufs sains, puis en laissant les œufs éclosent dans les médias de S-complet sans nourriture. En l'absence de nourriture, les larves L1 éclos va arrêter le développement, la génération d'une population synchrone des larves L1. Au cours de l'écran, préparer les larves L1-arrêté frais chaque semaine que ces animaux affamés deviennent malades au fil du temps et doivent être jetés. Le choix du fond génétique des animaux utilisés dans une souche d'alimentation ARNdb peut varier en fonction de l'application, pour les écrans neuronales eri-1; mutants lin-15B est recommandé.

  1. Choisissez 10-20 L4 larvae à six plaques NGM séparés contenant un tapis de bactéries OP50 et attendre 6-7 jours jusqu'à ce que les plaques contient de nombreux œufs fraîchement pondus et les adultes gravides.
  2. Retirer les animaux et les œufs à partir des plaques en ajoutant 3 ml d'eau à la surface de chaque plaque et en utilisant un doigt ganté pour déloger les oeufs, les bactéries et les animaux à partir de la surface de chaque plaque dans l'eau. Soyez sûr de couvrir tous les domaines de la plaque, en accordant une attention particulière à la pelouse bactérienne. Éliminer l'eau, les bactéries, les vers et les oeufs de chaque plaque en utilisant une pipette en verre et le transférer à une 50 ml tube conique stérile.
  3. Ajouter un autre 3 ml d'eau à la surface de chaque plaque, aspiration et refoulement dans la surface pour éliminer toutes les bactéries restantes, les vers et les œufs. Ajouter ce volume au tube conique de 50 ml.
  4. Spin le tube conique à 1500 rpm pendant 1 min dans une centrifugeuse de dessus de table. Worms et les œufs doivent sédimenter au fond du tube et les bactéries doivent rester suspendues. Aspirer délicatement tous mais 4 mldu liquide du tube en étant sûr d'éviter les vers et les œufs culot.
  5. Reprendre le culot à vis sans fin dans l'eau résiduelle et transférer dans un tube conique de 15 ml stérile en utilisant une pipette en verre. Porter le volume à 10 ml avec de l'eau stérile.
  6. Tourner à 1500 tours par minute pendant 1 min comme avant. Aspirer le surnageant laissant 200 pi d'eau afin de ne pas perturber le culot ver / oeuf.
  7. Ajouter 10 ml d'eau à la conique se laver les vers et les œufs et tourner comme avant pour éliminer les bactéries supplémentaires.

Remarque: Dans les étapes 5.8 à 5.11 vers et les œufs sont exposés à une solution d'eau de Javel. Bleach va détruire les vers et laisser les œufs relativement indemne. Toutefois, si les œufs sont laissés dans une solution d'eau de Javel trop longtemps, ils seront également détruits. Réglez une minuterie quand l'eau de Javel est ajoutée à l'étape 5.8 pour être certain que les œufs ne pas rester exposés à l'eau de Javel pour plus de 10 min.

  1. Retirez tous mais 200 pi du surnageant, en évitant encore le culot, puis ajouter 10ml de solution d'eau de Javel et de commencer une minuterie.
  2. Incuber les vers et les oeufs dans une solution d'eau de Javel pour 3-4 min, de temps en temps de mélange par inversion. Puis tourner à 1500 tours par minute pendant 45 secondes dans une centrifugeuse de table. Comparer un culot au fond du tube, il devrait être plus petit et plus compact que le culot initial et peut prendre un aspect jaune.
  3. Aspirer la solution d'eau de Javel laissant 200 pi derrière afin de ne pas perturber le culot.
  4. Ajoutez un autre 10 ml de solution d'eau de Javel fraîche et inverser comme avant. Lorsque la minuterie indique 10 min, tourner encore et aspirer l'eau de Javel, laissant 200 pi derrière et rapidement ajouter 10 ml d'eau stérile. Examiner la solution sous un microscope à dissection. Les larves et les adultes de nombreuses auraient dissous dans la solution de blanchiment, en laissant la plupart des oeufs de derrière.
  5. Filer comme précédemment pendant 45 s, et de nouveau aspirer le surnageant de manière à ne pas perturber le culot. Ce culot doit contenir principalement des oeufs et sera très lâche.
  6. Ajouter anotsa 10 ml d'eau, mélanger par inversion, rotation et aspirer en laissant un peu d'eau derrière. Il est important d'éliminer la solution de blanchiment dans la mesure du possible.
  7. Ajouter 4 ml S-complets médias au tube conique, remettre en suspension les œufs et les transférer à un Erlenmeyer de 100 ml stérile. Placer la fiole dans un incubateur à 20 ° C sur un agitateur en mouvement de l'ensemble juste assez rapidement pour provoquer le contenu de la fiole à remous. Cela fournira une aération suffisante pour soutenir les larves L1 quand ils éclosent. Dans les 15 h tous les oeufs auraient éclos production d'une population de larves L1 synchrone arrêté.

Larves L1 arrêtée doit être fait frais chaque semaine au cours d'un écran. Une fois le premier lot a été faite, les lots suivants peuvent être démarrés en ajoutant 500 larves L1 arrêté (du lot de la semaine précédente) pour chacun des quatre types, ensemencées 6 cm plaques (contenant 100 pi culture de nuit de OP50), et incubées à 20 ° C pendant 4 jours. Le quatrième jour, les plaques doivent contenird'œufs et les adultes gravides et peuvent être blanchis pour préparer des oeufs frais pour les larves de L1 plus synchronisée.

6. Transfert Arrêté L1 larves sur Alimentation Plaques

Vue d'ensemble: Pour effectuer un écran ARN double brin, 20-30 larves L1 arrêtés sont transférés sur des plaques d'alimentation d'ARN double brin. Effets précoce knockdown telles que l'arrestation ou la létalité des larves seront observés après les animaux sont nourris sur les bactéries exprimant l'ARN double brin pendant 2-3 jours. En fonction de l'écran réalisé, les phénotypes souhaités peuvent être respectées, soit dans les animaux originaux placés sur la plaque d'alimentation (animaux P0) ou dans leur descendance (animaux F1). La présentation du phénotype dépendra d'un certain nombre de variables y compris le perdurance de la protéine codée par le gène dont l'expression est renversé et le temps au cours du développement dans lequel le gène d'intérêt est nécessaire. À partir de cultures alimentaires ARNdb avec seulement 20-30 animaux doit permettre l'observation de deux P0 et F1 phénotypes avant unchez les animaux épuiser la source de nourriture.

Pour transférer facilement 20-30 animaux à des plaques d'alimentation, d'abord déterminer la concentration de L1 arrêté animaux dans la culture L1 arrêté.

  1. Mélanger l'erlenmeyer contenant les larves L1 arrêté de distribuer les animaux.
  2. Supprimer une aliquote de 10 ul et le lieu goutte à goutte sur une plaque de NGM 6 cm non ensemencées dans 4-5 gouttes au centre de la plaque en vous assurant que tous les médias est expulsé de la pipette.
  3. Utilisation de l'extrémité de l'embout de pipette à répartir les points de suspension à vis sans fin pour former une seule ligne continue de liquide qui s'étend sur le diamètre de la plaque.
  4. En utilisant un microscope à dissection, compter tous les animaux commençant à une extrémité de la ligne de liquide et en continuant vers l'autre extrémité, avant que le liquide soit absorbé dans la plaque et les animaux se disperser. Cela peut nécessiter recentrage constant de la portée de dissection d'être certain que les animaux ne sont pas manquer.
  5. Répétez cette opération pour trois 10 pi distinctsaliquotes et en moyenne les trois chiffres pour déterminer le nombre moyen de vers par ul de suspension ver et enregistrer ce numéro directement sur l'erlenmeyer.

7. Commencez l'écran de l'alimentation

Présentation: Pour commencer l'écran ARN double brin, 20-30 larves L1 arrêté sont ajoutés à chaque puits de plaques à 12 puits d'alimentation contenant une pelouse fine de bactéries exprimant l'ARN double brin. Des plaques d'alimentation contiennent un milieu de croissance de nématodes standard (NGM) et sont complétés avec 500 ug / ml de carbénicilline (pour éviter la perte du plasmide) et 1 mM d'IPTG (à induire l'expression de l'ARN double brin). Les animaux sont autorisés à nourrir et développer pendant plusieurs jours à 20 ° C. Deux schémas typiques d'alimentation pour animaux sont trois jours lors de l'exécution d'un écran de P0 et 6-7 jours lors de l'exécution d'un écran de F1. La durée de l'alimentation, cependant, peut être modifiée en fonction des phénotypes spécifiques recherchées dans l'écran.

  1. Utiliser la suspension des larves L1 arrêté et de l'eau stérile pour préparer une sortelution contenant des vers 2000 / ml. Chaque plaque de 12 puits d'alimentation, il faudra 120 ul de cette suspension à vis sans fin. Mélanger soigneusement pour assurer une répartition uniforme des animaux et de transférer les animaux dans un réservoir stérile pour pipetage.
  2. Utilisation de la pipette multicanaux mis en place avec des conseils dans chaque troisième position (voir la figure 1) le transfert de 10 pi de la solution de ver directement sur ​​la pelouse bactérienne des plaques d'alimentation. Prenez soin de ne pas percer la surface de l'agar-agar, les vers s'enfouissent dans la gélose et pas nourrir les bactéries exprimant l'ARN double brin.
  3. Remix la solution de ver dans le réservoir (par ballottement doucement sur) toutes les deux rangées de plaques d'alimentation, comme des vers s'installent rapidement. Continuer la distribution de la suspension de ver jusqu'à ce que toutes les plaques d'alimentation ont des vers. Examiner quelques puits dès le début sous le microscope à dissection pour s'assurer que chaque puits devient 20-30 vers.
  4. plaques de magasins verticaux dans une boîte humidifiée dans un incubateur à 20 ° C. Le lendemain, après le worm suspension a absorbé dans la plaque, retourner les boîtes et retourner à la cave à 20 ° C. Animaux sur ces plaques peuvent être observés après 3 jours (pour les phénotypes P0) et de nouveau après 6 jours (pour les phénotypes de F1).

Remarque: Les bactéries qui restent sur ​​la plaque d'alimentation après 7 jours de la croissance du ver ont été testés pour la perte de plasmide et près de 100% retenu le plasmide ARN double brin.

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Representative Results

P0 phénotypes knockdown vont commencer à apparaître après 2-3 jours de l'alimentation des animaux ARNdb exprimer bactéries. Certains des premiers phénotypes comprennent arrestation et la létalité des larves et doivent être respectées dans 2-3% de tous les puits d'alimentation. Ces mêmes phénotypes seront également observées chez les animaux de la génération F1. La présence d'œufs de F1 qui n'ont pas éclos est un autre phénotype de F1 commun, et ensemble, ces trois phénotypes sera observée dans près de 10% de tous les puits dans les écrans de F1.

Nous avons utilisé le protocole décrit ici pour examiner les effets démontables pour plusieurs gènes exprimés dans une variété de types de tissus à la fois pour P0 et phénotypes de F1. Parce que nous voulions aussi tester les effets knockdown dans le tissu neuronal, nous avons utilisé eri-1; mutants lin-15B dans nos écrans. Des mutations dans eri-1 et lin-15B, avec des mutations dans far-3, ont été identifiés dans les écrans pour les mutations qui ont causé une sensibilité accrue à l'ARNi 8,13,14.

EGL-30, dpy-17, pat-10, et unc-4. Deux de ces gènes, egl-30 et unc-4, sont exprimés dans le système nerveux 15-17, un gène, pat-10, est exprimé dans le corps paroi musculaire de 18, et le quatrième gène, dpy-17, est exprimée dans des cellules hypodermiques 19. Lorsque nous avons nourri eri-1; lin-15B animaux bactéries qui contiennent le plasmide vide pL4440 mais n'ont pas exprimé un ARN double brin, nous n'avons pas observé de défauts morphologiques ou comportementales (figure 2A, tableau 1).

egl-30, code pour la C. elegans orthologue de la sous-unité de la protéine G Gaq. egl-30 mutants nuls arrestation au cours du développement larvaire, mais certains évadés nulles et EGL-30 mutants hypomorphic perte de fonction poussent à devenir stade adulte et sont défectueux dans la locomotion et les comportements de ponte 20. Quandnous avons nourri stade L1 eri-1; lin15B bactéries larves exprimant egl-30 ARN double brin, nous avons constaté que les larves a grandi pour devenir des adultes qui ont montré des défauts clairs dans la locomotion et le comportement de ponte. Après trois jours, 100% des animaux nourris ARNdb contre egl-30 ont été paralysés et incapables de pondre des œufs (figures 2B, tableau 1). Nous n'avons pas observé l'arrestation phénotype larvaire dans nos expériences de knockdown ARN double brin qui est observé dans egl-30 (ad810) animaux nulles. C'est sans doute parce que les animaux de L1 nous étalées sur egl-30 bactéries ARNdb avaient déjà passé l'exigence de développement précoce pour EGL-30. Cela met en évidence un avantage d'écrans d'alimentation: phénotypes tardifs peuvent être observées pour les gènes qui jouent également un rôle essentiel au cours du développement.

dpy-17 code pour une protéine de collagène nécessaire à la formation de la cuticule en C. elegans 19. dpy-17 mutants nuls sont plus courts et plus gros que le type sauvage animals. Nous n'avons pas observé de défauts morphologiques chez les animaux nourris dpy P0-17 ARN double brin. Cependant, 98% des animaux F1 ont montré le phénotype dpy (Figure 2C, Tableau 1). L'absence de courts et gras animaux P0 indique que dpy-17 la fonction du gène est nécessaire à des stades larvaires de la morphologie du corps propre. Alors que dpy-17 n'a pas été ciblé dans d'autres écrans d'alimentation, il a été renversé par injection d'ARNdb 21. Fait intéressant, seulement 30% de la descendance de l'ARNdb injecté l'animal ont montré le phénotype dpy, ce qui suggère que le protocole d'alimentation décrite ici est plus efficace que l'approche plus de main-d'œuvre injection, au moins pour certains gènes.

pat-10 code corps paroi musculaire de la troponine C, une protéine contenant quatre motifs EF main qui lient le calcium 18. Nous avons constaté que 100% des eri-1; animaux lin-15B nourris pat-10 ARNdb est devenu paralysé dans les 3 jours et mis aucun oeuf menant to un phénotype létal (figure 2D, tableau 1).

unc-4 code pour une protéine à homéodomaine exprimé dans les neurones moteurs de la moelle ventrale et est nécessaire pour le choix approprié d'entrée synaptique 22,23. Nous avons choisi unc-4 comme un gène de test, car il s'est avéré être résistant aux stratégies d'alimentation ARNdb précédentes 8,24. Mutants unc-4 montrent un défaut dans le comportement de locomotion. À la suite de défauts de connectivité synaptique, unc-4 mutants sont incapables de sauvegarder 22,23. Par rapport à des animaux de type sauvage qui soutiennent librement dans un mouvement sinusoïdal quand poussé sur la tête, unc-4 mutants nuls ne dos et à la place se contractent pas leur midbody bien, provoquant une flexion dorsale qui devient parfois si extrêmes que la tête et la queue de l' contact des animaux, en plaçant le corps dans une position enroulée. Nous avons constaté que 68% des animaux nourris unc-4 bactéries exprimant l'ARN double brin à partir de notre bibliothèque préparation a montré les défauts de backing. Il s'agit d'une amélioration spectaculaire de l'efficacité effet de choc par rapport au défaut de renfort 0% observée lorsque far-3 animaux sont nourris unc-4 ARNdb en utilisant les protocoles précédemment publiés 8 (Tableau 1).

Figure 1
Figure 1. Diagramme pour la duplication bibliothèque et d'un écran à grande échelle. Chaque plaque de 96 puits ou 12 généré au cours du protocole de dépistage est indiqué, ainsi que la méthode utilisée pour transférer des bactéries entre les plaques. Les astérisques indiquent les étapes à laquelle les bactéries doivent être testés pour la perte de plasmide. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2
Figure 2. ARNdb phénotypes knockdown de C. elegans gènes exprimés dans différents types de tissus. A) Les animaux témoins nourris bactéries contenant pL4440 vecteur vide. La flèche noire indique la position d'un jeune animal adulte. Flèche blanche indique la position d'un groupe d'œufs pondus. La photographie montre déplacer librement animaux comme en témoigne leur posture normale. B) Animaux nourris ARNdb contre egl-30. Notez que tous les animaux ont adopté une apparence rigide typique des animaux paralysés. A noter également l'absence totale d'œufs pondus sur la plaque. C) Les animaux nourris ARNdb contre dpy-17. Notez que les animaux adultes dans le domaine (celui marqué par la flèche) sont plus courts et plus gros que l'animal adulte montré dans le panneau A. D) Animaux nourris ARNdb contre pat-10. Notez que tous les animaux sont paralysés, mais peut encore bouger les muscles de la tête pour se nourrir, comme indiqué par la compensation des bactéries près de la tête, marqué par la flèche. Barre d'échelle 1 mm.

ARNdb plasmide ou gène ciblé par feEding L'expression tissulaire de gène ciblé animaux Pourcentage de phénotype borne
pL4440 (contrôle négatif) type sauvage pour tous les comportements
egl-30 système nerveux 100% Egl et paralysé
dpy-17 hypoderme 98% dpy
pat-10 corps paroi musculaire 100% Paralysé
unc-4 système nerveux 68% Accompagnement des défauts

Tableau 1. Phénotype terminal d'animaux nourris ARNdb contre gènes exprimés dans divers C. elegans tissus. n = 100 pour tous les gènes.

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Discussion

Nous avons décrit un protocole qui utilise une bibliothèque d'alimentation ARNdb disponible dans le commerce pour effectuer les écrans de grande envergure dans C. elegans. Nous fournissons toutes les instructions pour dupliquer la bibliothèque et de l'utiliser efficacement. Nous démontrons que cette approche permet d'identifier des gènes impliqués dans divers processus biologiques dans différents tissus de l'animal. Alors que les phénotypes que nous décrivons ici sont facilement observables (Unc, Egl, et dpy), ce protocole peut être adapté à la recherche de gènes nécessaires à presque n'importe quel processus biologique. Par exemple, nous avons utilisé ce protocole pour identifier les gènes nécessaires à la neurotransmission dans le ver 25. Une fois que les animaux sont nourris sur des bactéries exprimant l'ARN double brin (en général 3 jours écrans de P0, 6-7 jours pour les écrans de F1), ils peuvent être retirés de la plaque d'alimentation et testés pour n'importe quel phénotype comportemental.

La perte de plasmide:

Nous avons constaté que les rendements de knockdown réduits observés au coursécrans ARNdb à grande échelle pouvaient être directement attribués à la perte de l'ARN double brin plasmidique des bactéries aux vers. La perte de plasmide se produit dans des cultures bactériennes en raison de la croissance β-lactamase, codé sur le plasmide bibliothèque ARNdb, agit de manière à dégrader à la fois à l'ampicilline et la carbénicilline, la réduction de la concentration de ces antibiotiques dans le temps. Lorsque la concentration de l'antibiotique devient suffisamment faible, les bactéries qui ne contiennent pas le plasmide peuvent survivre et remplir la culture. L'utilisation de ces cultures bactériennes mixtes dans les écrans d'ARN double brin doit être évitée, car ils montrent une activité de knockdown réduite et souvent ne causent pas de perte de fonction phénotypes 11. De manière surprenante, nous avons découvert que des niveaux élevés de perte de plasmide se produire même dans des cultures bactériennes cultivées dans des concentrations très élevées d'ampicilline (à 2 mg / ml). Alors que la carbénicilline est plus résistant à la dégradation par la β-lactamase, on a trouvé encore nécessaire d'utiliser des concentrations de carbénicilline qui étaient de 10 à 40 fois plus élevés que ceuxutilisé dans des écrans d'alimentation ARNdb précédemment publiés 8-10,26 faire en sorte que toutes les bactéries présentes dans la culture conservé le plasmide ARNdb.

Parce que la plupart des gènes dans C. elegans sont haplosufficient, il est extrêmement important que toutes les bactéries alimentation des animaux expriment l'ARN double brin. Cela garantit très efficace inactivation génique et augmente la probabilité d'observer des phénotypes perte de fonction dans les écrans de grande envergure.

Des contrôles positifs et négatifs:

Il est essentiel d'inclure les bactéries à la fois positifs et négatifs de contrôle dans chaque plaque d'alimentation lors de l'exécution écrans. Le contrôle négatif est particulièrement important si des tests de comportement seront utilisés pour identifier les gènes d'intérêt. Pour un contrôle négatif, nous utilisons des bactéries contenant le vecteur pL4440 vide. Pour un contrôle positif, il est préférable d'utiliser des bactéries qui expriment ARNdb contre un gène qui provoque le phénotype knockdown souhaitée. Toutefois, si aucun de ces gènes sont saventn, un contrôle positif pour effet de choc doit être utilisé qui provoque un phénotype facilement observable. Lors du choix d'un tel gène, la préférence soit donnée à des gènes qui sont exprimés dans le type de tissu ciblé dans l'écran. Par exemple, dans les écrans d'alimentation d'ARNdb pour phénotypes neuronaux, un gène neuronal doit être choisi en tant que contrôle positif. Un effet knockdown observable chez les animaux nourris sur les bactéries de contrôle positif indique que l'ingérence ARNdb travaille dans le type de tissu désiré.

Il est préférable que la personne en marquant les plaques d'alimentation pour les phénotypes est aveugle à l'emplacement du puits témoins positifs. L'examinateur doit être capable d'identifier facilement le bien positif dans chaque plaque de 96 puits. Pour les tests de comportement, il est utile de marquer le bien négatif en premier avant de numériser les puits restants.

Débit:

En utilisant ce protocole, une personne doit être en mesure de mettre en place et d'un écran 16, des plaques à 12 puitspar jour. Pour déplacer efficacement grâce à la bibliothèque, nous testons généralement chaque puits de chaque plaque bibliothèque qu'une seule fois au cours d'un écran. Tous les puits qui a marqué comme positif sont enregistrées et sont à nouveau testés en triple exemplaire. Nous exigeons que les puits positifs retester dans les trois nouveaux essais. Le plasmide est ensuite purifié à partir de la bactérie et de l'insert est séquence pour identifier positivement le gène. Si mutants nuls sont disponibles pour le gène, nous les commandons et tester les animaux nulles pour défaut de comportement identifiés dans l'écran.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des fonds des Instituts nationaux de la santé MH097163. Certaines souches ont été fournis par la CCG, qui est financé par le Bureau NIH des programmes d'infrastructure de recherche (P40-OD010440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
96-well Falcon flat bottom plate Fisher Scientific 353072 sterile
adhesive foil USA Scientific 2923-0100
Nunc omniplate Fisher Scientific 267060
2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock USA Scientific 5678-0285 autoclavable
Lids for deep well plates USA Scientific 5665-6101
50 ml combitips USA Scientific 4796-5000 individually wrapped
Reservoir USA Scientific 2977-8500 autoclavable
12-well plates USA Scientific CC7682-7512 individually wrapped
dsRNA feeding library OpenBiosystems RCE1181 store -80 °C
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-5
Tetracycline Fisher Scientific BP912-100
Carbenicillin allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com
Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A Affymetrix 10906 for worm plates
Equipment
Brayer roller USA Scientific 9127-2940
B–kel 96-pin replicator Fisher Scientific 05-450-9 autoclavable
microshaker Thomas Scientific 1231A93 3 mm orbit
12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl) USA Scientific 7112-0510
12 channel multichannel pipet (30-300 μl) USA Scientific 7112-3300
Repeater Plus manual pipettor USA Scientific 4026-0201

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Biologie du Développement numéro 79 Caenorhabditis elegans (C. elegans) Techniques Gene sacrifiés, L'interférence ARN double brin inactivation génique l'écran d'alimentation à grande échelle
À grande échelle Gene Knockdown dans<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilisation ARNdb alimentation bibliothèques pour générer des phénotypes robustes perte de fonction
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