Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Groß Gene Knockdown in Published: September 25, 2013 doi: 10.3791/50693
Automatic Translation
1, 2, 3
1Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts, Amherst, 2Neuroscience and Behavior Program, University of Massachusetts, Amherst, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Massachusetts, Amherst

Summary

Während dsRNA Fütterung in C. elegans ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Genfunktionen, aktuellen Protokolle für große Bildschirme Fütterung führen zu variablen Zuschlags Effizienz zu beurteilen. Wir beschreiben eine verbesserte Protokoll für die Durchführung groß angelegte RNAi Fütterung Bildschirme, die in hochwirksame und reproduzierbare Zuschlags der Genexpression resultiert.

Abstract

RNA-Interferenz, indem Würmer Bakterien, die dsRNA ist ein nützliches Werkzeug, um Genfunktionen in C. bewerten elegans. Während diese Strategie funktioniert gut, wenn eine kleine Anzahl von Genen für die Zuschlags gezielte, Groß Fütterung Bildschirme zeigen variable Zuschlagswirkungsgrade, was ihre Verwendbarkeit einschränkt. Wir haben zuvor veröffentlichten Protokollen RNAi Zuschlags zerlegt und festgestellt, dass die Hauptquelle der reduzierten Zuschlags kann zum Verlust von dsRNA kodierende Plasmide aus den an die Tiere verfüttert werden Bakterien zugeschrieben werden. Basierend auf diesen Beobachtungen haben wir eine dsRNA Fütterungsprotokoll, das stark reduziert oder eliminiert Plasmid Verlust effiziente Hochdurchzuschlags erreichen entwickelt. Wir zeigen, dass dieses Protokoll wird robust, reproduzierbar Knock Down von C. produzieren elegans Gene in mehreren Gewebetypen, einschließlich Neuronen und eine effiziente Knockdown in Großbildschirme ermöglichen. Dieses Protokoll verwendet eine kommerziell erhältliche dsRNA ZufuhrBibliothek und beschreibt alle notwendigen Schritte, um die Bibliothek zu kopieren und auszuführen dsRNA-Bildschirme. Das Protokoll erfordert nicht die Verwendung von hoch entwickelten Geräten, und kann daher von einem C durchgeführt werden elegans Labor.

Introduction

Historisch genetische Screens in C. elegans durch die Behandlung von Tieren mit einem chemischen Mutagen wie Ethylmethansulfonat um zufällige Mutationen in DNA erstellen durchgeführt worden. Nachkommen-oder grandprogeny mutagenisierter Tiere werden dann isoliert, die Ausstellung eines gewünschten abnorme Phänotyp. Der zum Bewirken des Phänotyps verantwortlich Mutation in einem arbeitsintensiven Abbildungsverfahren oder durch Sequenzierung der mutierten Wurm gesamte Genom identifiziert. Es gibt viele Vorteile bei der Durchführung dieser chemischen Mutagenese-Läsionen, wie sie permanent innerhalb des Genoms, die Schnecke in beiden gain-of-function-und Verlust-von-Funktion Phänotypen erzeugen kann, aber die Zuordnungsverfahren ist langsam und teuer.

Doppelsträngige RNA-Interferenz (dsRNAi) stellt ein alternatives Mittel, um Gene in wichtigen biologischen Prozessen beteiligt sind. Bei diesem Verfahren wird entsprechend der dsRNA kodierende Sequenz eines endogenen Gens in das Schnecken eingeführt.Die dsRNA wird in vivo verarbeitet, um kleine (21-22 Nukleotid) RNAs, die als Führer zu finden und zu binden, die passenden endogenen mRNAs, anzusprechen, für die Zerstörung 1 dienen generieren. Dieses Verfahren ist relativ schnell, sondern weil dsRNA zielt mRNA statt DNA werden nur Reduktions-of-function-Phänotypen mit Hilfe dieses Ansatzes beobachtet.

Einführung von dsRNA in ein Tier durch direkte Injektion von dsRNA 2 erreicht werden, durch Einweichen in Tieren dsRNA 3, oder durch Füttern von Tieren Bakterien, 4 dsRNA exprimieren. Jede dieser Versandmethoden verursachen systemische Zuschlags Auswirkungen, da die meisten Zellen des Tieres äußern SID-1, eine Transmembrankanal importiert werden können dsRNA 5. Ursprünglich als Reverse Genetik Ansatz, um die Expression einzelner Gene ein zu einer Zeit Knockdown verwendet, die Entwicklung der beiden Speise Bibliotheken ermöglicht nun groß angelegte genetische Bildschirme. Die im Handel erhältlichen dsRNA Bibliotheken enthalten bacterial Klone, die entweder 55% oder 87% aller C. elegans Gene 6, 7.

Leider Groß dsRNAi Fütterung Bildschirme oft in variablen Zuschlagswirkungsgrade 8-10 führen. Während die absolute Höhe der Zuschlags durch RNAi ist nicht leicht zu messen, muss die in großen Bildschirmen beobachtet reduziert Zuschlags Effizienz durch Rest Gen-spezifischen mRNAs, die Verschlechterung zu entkommen durch RNAi verursacht werden. Dies könnte wiederum ein direktes Ergebnis der dsRNA Plasmid Verlust von Bakterien, Tieren in diesen Bildern zugeführt werden. Die Unterstützung dieser Idee, Tiere verfüttert Mischungen von Bakterien, in der nur 50% der Bakterien auszudrücken dsRNA gegen eine Zielgens, zeigen drastisch reduziert (wenn überhaupt) Knockdown-Effekte im Vergleich zu Tieren gefüttert 11 zu steuern. Das Ausmaß der Gen-Knockdown zu einem kritischen Anliegen bei der Durchführung dsRNAi-Bildschirme wie die meisten Gene in C. elegans sind haplosufficient und somit muss der Genexpression durch mindestens 50% t reduziert werden,o führen loss-of-function Phänotypen 12.

Wir haben bisher veröffentlichten Fütterungsprotokolle verwendet werden, um große Bildschirme durchführen und fand die gleiche Variable Zuschlags Effekte von anderen 10.08 ausgewiesen. Bei der Suche nach möglichen Ursachen, fanden wir, dass fast 60% der Tiere in den Bildschirm eingespeist Bakterien hatten die dsRNA-Plasmid verloren. Wir haben eine Bibliothek Vervielfältigung und Screening-Protokoll, die drastisch reduziert oder eliminiert Plasmid Verlust und verbessert die Zuschlags Effizienz entwickelt. Dieses Protokoll ist für die Durchführung von Großbildschirmen in C. elegans und können zum Screening einer von der kommerziell erhältlichen dsRNA Bibliotheken werden. Über dieses Protokoll, finden wir, dass praktisch 100% der zu den Tieren während der Bildschirm eingespeist Bakterien behalten die dsRNA-kodierenden Plasmid verursachen und robust und sehr penetrant Verlust der Funktion Phänotypen in allen untersuchten Geweben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hinweis: Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Gene für eine Vielzahl von biologischen Prozessen in einer Vielzahl von Gewebearten zu identifizieren, erforderlich. Als notwendige Qualitätskontrolle während des Bildschirms sind die Tiere gefüttert positiven und negativen Kontroll-dsRNA-exprimierenden Bakterien RNAi-Effekte in das Zielgewebe zu demonstrieren.

Andere veröffentlichte Protokolle Zufuhr wachsen dsRNA-exprimierenden Bakterien in Gegenwart von entweder 50 &mgr; g / ml Ampicillin oder 25 &mgr; g / ml Carbenicillin 8-10. Wir haben festgestellt, dass Bakterien unter diesen beiden Bedingungen gezüchtet verlieren die dsRNA Plasmid mit einer hohen Frequenz. Tatsächlich haben wir gefunden, dass auch bei Bakterien werden über Nacht in sehr hohen Konzentrationen (bis zu 2 mg / ml) Ampicillin mehr als 50% der Bakterien gezüchtet Plasmid enthalten, nicht mehr. Während das Wachstum in Carbenicillin allgemeinen zu höheren Retention von Plasmid führte, betrug 25 &mgr; g / ml nicht ausreicht, um das Plasmid Verlust zu verhindern. Stattdessen fanden wir, dass Carbenicillin Konzentrationgen von 500 ug / ml waren erforderlich, um das Plasmid Verlust während des Wachstums in Flüssigkulturen und 2 mg / ml Carbenicillin erforderlich war, um Plasmid-Verlust zu blockieren, wenn Bakterien wurden auf festen Agar-Substraten aufgewachsen blockieren.

Da Plasmid Bindung ist entscheidend für den Erfolg des Zuschlags wird nur verwendet, wenn Carbenicillin dsRNA Bakterien sind in diesem Protokoll kultiviert. Wir haben sorgfältig die Konzentration von Carbenicillin in den in diesem Protokoll beschriebenen Bakterienwachstum Kulturen optimiert, um sicherzustellen, dass Bakterien, die das Plasmid nicht enthalten, nicht in diesen Kulturen wachsen. Jedoch als Qualitätskontrollmaßnahme Plasmid Verlust an mehreren Schritte des Protokolls bestimmt. Um eine effiziente Zuschlags gewährleisten, müssen mehr als 80% der Bakterien auf jedem dieser Schritte dsRNA Plasmid enthalten. Wenn mehr als 20% der Bakterien in jedem Schritt des Protokolls haben die dsRNA-Plasmid verloren, überprüfen die Qualität der Carbenicillin eingesetzt. Carbenicillin sollte frisch am Tag der Verwendung hergestellt werden. Vorbereiten Frisch Carbenicillin und wiederholen Sie die Kultur.

1. Wie Plasmid Verlust zu bestimmen

  1. Entfernen Sie eine kleine Probe von Bakterien (wie an jedem relevanten Schritt beschrieben) und es zu 450 ul sterilem Wasser hinzufügen.
  2. Verwenden Sie 100 ul dieser verdünnten Probe weiter 1:10, 1:100 und 1:1000 Verdünnungen mit sterilem Wasser, Mischen der Lösungen gründlich zwischen Verdünnung erstellen.
  3. Verbreiten Sie 100 ul jeder Verdünnung auf LB und LB AMP-Platten und Inkubation dieser Platten über Nacht bei 37 ° C
  4. Am nächsten Tag, identifizieren Sie die LB-Platte, die zwischen 100 und 500 Bakterienkolonien enthält. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf dieser Platte und an der entsprechenden LB AMP Platte (mit der gleichen Verdünnung von Bakterien).
  5. Bestimmen Sie Plasmid-Verlust aus diesen Koloniezahlen. Der prozentuale Anteil der Bakterien, die nicht enthalten das Plasmid mit Gleichung 1 berechnet, und sollte weniger als 15% für eine effektive dsRNA niederschlagen können.

</ Html"Formel 1" src = "/ files/ftp_upload/50693/50693eq1.jpg" />

2. Machen Doppelte Bibliothek Platten

Übersicht: Die dsRNA-Bibliothek wird vom Hersteller (OpenBiosystems) als 10.566 Bakterienklone in 96-Well-Platten kommen. Lagern Sie die Platten sofort in -80 ° C Gefrierschrank. Die ursprüngliche Bibliothek Platten dupliziert und alle Zuführen Bildschirme werden die doppelten Bibliotheksplatten als Quelle der Bakterien zu verwenden. Es ist ratsam, speichern Sie das Original und Duplikat Bibliotheksplatten in separaten Gefrierfächer. Zur einfachen Handhabung ist das Duplizieren von nur 10 Bibliotheksplatten pro Tag empfohlen.

  1. Bibliothek entfernen Platte (n) von -80 ° C Gefrierschrank und die Siegelfolie entfernen, während Kulturen sind immer noch eingefroren. Ersetzen Kunststoffabdeckung des Bibliotheksplatte und legen Sie die Platte auf einer ebenen Fläche, um bei Raumtemperatur (nicht mehr als 30 min) auftauen.

Hinweis: Wir haben festgestellt, dass ein signifikanter percentage von Bakterien in jeder Vertiefung der ursprünglichen Bibliothek gefunden Platten enthalten keine Plasmid. Da jedoch die Bibliothek Bakterien sind eine kostbare Ressource ist es nicht empfehlenswert, für Plasmid-Verlust in den ursprünglichen Bibliothek Kulturen zu testen.

  1. Mit einer Mehrkanal-Pipette 150 ul Bibliothek Vervielfältigung Medien in jede Vertiefung einer leeren 96-Loch-Flachbodenplatte Duplikat.
  2. Mischen Sie die Bibliothek aufgetauten Bakterienkulturen durch Auf-und Abpipettieren vier bis fünf Mal mit einer Mehrkanalpipette auf 100 ul eingestellt. Entfernen Sie dann 10 ul jeder Mischkultur und übertragen in die entsprechenden Wells der doppelten Platte. Weiter zu Kulturen aus Bibliotheksplatte zu übertragen, um die Platte zu kopieren, bestimmte Pipettenspitzen für jede Übertragung ändern.
  3. Nachdem alle Kulturen aus einer Bibliothek Platte übertragen worden, die Vertiefungen der ursprünglichen Bibliothek Platte mit neuer Folie mit einem Brayer Rolle, um eine gründliche Abdichtung zu gewährleisten. Ersetzen Sie den Kunststoffdeckel auf der Platte undlegen Sie sie aufrecht in einem -80 ° C Gefrierschrank, bis die Kulturen haben (mindestens 30 min) wieder eingefroren. Dann bewegen Sie die Original-Bibliotheksplatten wieder in eine Bibliothek Aufbewahrungsbox.
  4. Schütteln Sie doppelte Bibliothek Plattenkulturen Flach für 8-10 h bei 37 ° C (450 rpm auf einem microshaker, Orbit 3 mm).
  5. Bestimmen Sie Plasmid-Verlust in jedes Duplikat Bibliotheksplatte. Wir fanden, dass ein hoher Anteil der Bakterien in jeder Vertiefung der ursprünglichen Bibliothek Platte nicht dsRNA Plasmid enthalten. Es ist wichtig, daß diese Bakterien nicht zum Wachstum in der doppelten Bibliothek beizutragen. Ihr Wachstum zu verhindern, ist eine hohe Konzentration von Carbenicillin in der Bibliothek Vervielfältigung Medien (3 mg / ml) verwendet. Nach Kultur der Doppelplatte mit diesen Bedingungen haben wir festgestellt, dass mehr als 90% der Bakterien enthalten dsRNA Plasmid. Entfernen Sie 10 ul Probe aus einer repräsentativen Kultur auch jedes Duplikat Platte und es zu 450 ul sterilem Wasser hinzufügen. Mit Hilfe dieser verdünnten Proben, bestimmen Plasmid-Verlust in jedes Duplikat BibliothekPlatte nach Schritte 1.1-1.4. Wenn bedeutende Plasmid Verlust beobachtet (> 20% der Bakterien in der Bibliothek keine doppelte Plasmid enthalten), ein Remake des Kulturmedien mit frischen Carbenicillin und wiederholen Protokoll von Schritt 2.1.
  6. Nach der Inkubation, legen Sie eine neue Folie Klebefolie direkt über die doppelte Plattenvertiefungen, und legen Sie die Platte Deckel über dieser Folie. Legen Sie die doppelte Bibliotheksplatten aufrecht in einem -80 ° C Gefrierschrank (mindestens 30 min), bis eingefroren. Einmal gefroren, bewegen die Platten auf das Duplikat Bibliothek Aufbewahrungsbox für langfristige Lagerung.

3. Machen temporären Kopien der Bibliothek auf Omniplates

Überblick: Um zu beginnen, um Lebensmittel für eine dsRNA Bildschirm herzustellen, werden Bakterien aus doppelten Bibliotheksplatten solide Agar omniplates führt und über Nacht gewachsen. Um Plasmid-Verlust auf festen Medien zu verhindern, enthalten omniplates bei 2 mg / ml Carbenicillin. Die Bakterien auf diesen Platten kann für einen Zeitraum verwendet werden,von einer Woche, und zeigen keine Plasmid Verlust. Wir haben kein Plasmid Verlust Bakterien auf omniplates länger als eine Woche gezüchtet getestet.

  1. Entfernen Sie doppelte Bibliothek Platte (n) von -80 ° C Gefrierschrank und nehmen Sie die Folienabdichtung, während die Kulturen sind immer noch eingefroren. Nach dem Entfernen der Folie, ersetzen Kunststoffabdeckung der Platte und den doppelten Bibliotheksplatte auf eine ebene Fläche, um bei Raumtemperatur (nicht mehr als 30 min) auftauen.
  2. Sterilisieren Sie die Boekel 96 Pin-Replikator. Die Stifte eines sauberen Replikator sollte mit destilliertem Wasser gespült und dann vor jedem Gebrauch sterilisiert. Um den Replikator zu sterilisieren, legen Sie sie in ein Ethanol-Bad (3/4 in tief in einem Pyrex-Schale) und brennen Sie die Ethanol Beschichtung der Stifte dran mit einem Bunsenbrenner dann. Lassen Sie die Flamme zu löschen, und wiederholen.
  3. Legen Sie die sterilisiert Replikator in die Vertiefungen der Platte aufgetaut doppelte und verwenden Sie es, um die Kulturen vorsichtig rühren. Kleine Volumina der Kultur wird auf die Stifte der Replikator haften.
    4. <li> vorsichtig entfernen Replikator aus den Vertiefungen der Duplikatplatte und legen Sie sie (Pins nach unten) sanft auf der Oberfläche des omniplate, man aufpassen, nicht auf die Agar-Oberfläche zu durchstoßen. Verlassen den Replikator auf der Oberfläche des omniplate für 3-4 sec, so dass Bakterien aus den Stiften der Replikator werden auf die Agar-Oberfläche übertragen.
  4. Entfernen Sie den Replikator und ermöglichen das geringe Volumen (2-3 ul) Bakterienkultur in den Agar zu absorbieren. Die omniplates für 15-18 h invertiert bei 37 ° C inkubieren Diese omniplates kann am nächsten Morgen zur 96-Loch-Flüssigkulturen zu impfen werden. Alternativ omniplates enthaltenden Bakterienkolonien über Nacht bis zu sieben Tage bei 4 ° C gelagert werden
  5. Um replica-Übertragung zusätzliche doppelte Platten, spülen Sie die Replikator-Tipps mit sterilem Wasser und wiederholen Sie den Sterilisationsprozess, indem Sie den Replikator in Ethanol und zweimal flamm es, wie zuvor. Nach der Sterilisation kann die Replikators auf der nächsten Duplikat Platte verwendet werden.

4. Herstellung von Bakterien für die Fütterung Worms

Obersicht: Bakterien für die Zuführung Würmer werden als 1 ml Flüssigkulturen (in einer 96-Well-Format) mit Hilfe von Bakterien aus den omniplates vorbereitet. Diese flüssigen Kulturen werden über Nacht zu gesättigten nonlogarithmic Bakterienkulturen zu erzeugen. Wachstum über Nacht wird sichergestellt, dass alle Kulturen werden ähnliche Konzentrationen von Bakterien enthalten und daher alle Würmer die gleiche Menge der Nahrung zugeführt werden. Kein Plasmid Verlust während dieses Wachstums zu beachten.

  1. Dispense 1 ml der Bakterienwachstumsmedien in jede Vertiefung 2 ml Deep-Well-Platte mit 96 Vertiefungen mit einer Wiederholungspipette und 50 ml Combitip.
  2. Platzieren sterile Replikator auf die Oberfläche omniplates enthaltenden Bakterienkolonien erzeugt in Schritten 3.1-3.6 dabei sicher, dass Stifte in Kontakt mit jeder der 96 Bakterienkolonien.
  3. Den Replikator vorsichtig bewegen sich von der Oberfläche des omniplate in das tiefe Loch-Platte dabei sicher, dass die Stifte nicht die Seiten der Tiefbrunnen kratzen, bis in Wachstumsmedium eingetaucht. Bewegen Sie denReplikator langsam in einem Quadrat Bewegung nach der Innenwand des Tiefbrunnenplatte, um die Bakterien in das Wachstumsmedium zu entfernen. Seien Sie vorsichtig, nicht zu spritzen und Quer verschmutzen Brunnen.
  4. Kontrollvertiefungen: Für jede 96-Well-Kulturplatte tief fügen Sie ein dsRNA-exprimierenden Bakterien ein Ende gut, als Positivkontrolle für den erwarteten Phänotyp Zuschlags fungieren wird und Bakterien mit leeren dsRNA-Vektor (pL4440) hinzufügen, als Negativkontrolle zum anderen auch . Wir erneut Streifen Kontroll-dsRNA-exprimierenden Bakterien einmal pro Woche auf LB-Platten mit Tetracyclin (15 ug / ml) und Carbenicillin (2 mg / ml), so dass die Bakterien noch frisch und Plasmid zu behalten.
  5. Mit einer sterilen Impföse entfernen einen einzigen, gut isolierte Kolonie von der Steuerplatte (etwa die gleiche Menge an Bakterien, die durch den Replikator überführt) und eine leere impfen auch in der tiefen Kulturplatte. Notieren Sie die Position der gut, die geimpft wurde. Alternativ kann die Schleife mit Bakterien ceine in ein Eppendorf-Röhrchen mit 250 &mgr; l Wachstumsmedium bewegt werden, verwirbelt und dann verwendet, um mehrere Vertiefungen zu inokulieren.
  6. Schütteln Sie die Deep-Well-Platten in einer flachen Position bei 650 rpm auf microshaker (Orbit: 3 mm) bei 37 ° C über Nacht. Die Kulturen werden bis zum nächsten Morgen gesättigt. Trotzdem sollte die Konzentration des Carbenicillin in diesen Kulturen verwendete Plasmid Verlust zu verhindern.
  7. Bestimmen Sie Plasmid-Verlust in den 1 ml Übernachtkulturen. Die Kulturen werden direkt verwendet werden, um Würmer für den Bildschirm zu füttern. Es ist wichtig, dass über 80% der Bakterien in jeder Kultur enthalten dsRNA Plasmid. Bestimmen Sie Plasmid-Verlust für zwei repräsentative Kulturen gemäß den Schritten von 1,1 bis 1,4. Erwartung: Mehr als 90% der Bakterien in jeder Kultur wird dsRNA Plasmid enthalten. Wir haben noch nie signifikante Plasmid Verlust bei diesen Übernachtkulturen, auch wenn zur Sättigung wachsen gelassen beobachtet. Allerdings, wenn signifikante Plasmid Verlust beobachtet (> 20%), das Remake Wachstumsmedien mit frischen Carbenicillin und repProtokoll essen aus Schritt 4.1. Kulturen können vom Original omniplates neu gestartet werden, solange die omniplates weniger als 1-2 Wochen alt.
  8. Einmal verwendet, um 1 ml Kulturen starten, werden die omniplates bei 4 ° C gelagert, bis der Bildschirm ist abgeschlossen und kann als Nahrungsquelle verwendet, um alle Retest Kulturen starten.
  9. Nach Inkubation über Nacht der Kulturen, mit einem 12-Kanal-Mehrkanalpipette zu 150 ul Bakterienkultur aus dem tiefen Loch-Platte zu entfernen und stoßen auf die Oberfläche des Futterplatte. Es ist wichtig, die Oberfläche des Agars bei der Übertragung als Würmer graben und nicht ziehen auf die dsRNA-exprimierenden Bakterien eindringen. Übertragung vier Vertiefungen in einer Zeit (Abbildung 1) erfolgen. Um dies zu tun, legen Pipettenspitzen an jedem dritten Kanal der Mehrkanalpipette (da es nur 4 Vertiefungen pro Reihe in der Förderschild). Nach jedem Satz von 4 Vertiefungen übertragen wird, um neue, sterile Pipettenspitzen ändern. Jede 96 Deep-Well-Kulturplatte werden 96 Spitzen erfordernfür die Übertragung zu acht 12-Well-Platten Zufuhr.
  10. Shop Platten ausgesät aufrecht in der dunklen Nacht, so können Bakterien in den Agar zu absorbieren.

5. Gene L1 verhaftet C. elegans-Larven

Übersicht: L1-Larven festgenommen werden verwendet, um synchronisiert Wurm Kulturen auf die dsRNA Futterplatten starten. Diese Larven werden durch Bleichen Populationen von schwangeren Erwachsenen, gesunde Eier zu isolieren und dann damit die Eier in S-komplette Medien ohne Nahrung schlüpfen erzeugt. In Abwesenheit von Lebensmitteln die geschlüpften Larven L1 wird die Entwicklung zu verhaften, wodurch eine synchrone Bevölkerung von L1-Larven. Während der Bildschirm, bereiten Sie frisches L1-Larven festgenommen jede Woche, da diese ausgehungerten Tiere krank werden im Laufe der Zeit und muss entsorgt werden. Die Wahl des genetischen Hintergrund der dsRNA in einer Vorschub Stamm verwendeten Tiere können je nach Anwendung variieren, für die neuronale Bildschirme ERI-1, 15B-lin-Mutanten werden empfohlen.

  1. Wählen 10-20 L4 larvae zu sechs separaten NGM-Platten, die einen Rasen von OP50 Bakterien und warten 6-7 Tage, bis die Platten enthält viele frisch gelegte Eier und schwangeren Erwachsenen.
  2. Tiere und Eier entfernen von den Platten durch Zugabe von 3 ml Wasser auf der Oberfläche jeder Platte und mit einem behandschuhten Finger, um die Eier, Bakterien und Tiere aus der Oberfläche jeder Platte in das Wasser zu entfernen. Seien Sie sicher, dass alle Bereiche der Platte zu bedecken, wobei besonderes Augenmerk auf dem Bakterienrasen. Entfernen Sie die Wasser, Bakterien, Würmer und Eier von jeder Platte mit einer Glaspipette und Transfer in ein steriles 50 ml konischen Röhrchen.
  3. Fügen Sie weitere 3 ml Wasser auf die Oberfläche jeder Platte, und Abpipettieren über die Oberfläche, um alle restlichen Bakterien, Würmer und Eier zu entfernen. Fügen Sie diese Lautstärke auf den 50 ml konischen Röhrchen.
  4. Spin der konischen Röhrchen bei 1.500 rpm für 1 min in einer Tischzentrifuge. Würmer und Eier sollte der Boden des Röhrchens pelletieren und die Bakterien sollte ausgesetzt bleiben. Alle, aber 4 ml vorsichtig absaugender Flüssigkeit aus der Röhre sicher, dass die pelletierten Würmer und Eier zu verhindern.
  5. Resuspendieren Sie das Pellet Wurm im Restwasser und übertragen in ein steriles 15 ml konischen Röhrchen mit Hilfe einer Glaspipette. Bringen Sie das Volumen auf 10 ml mit sterilem Wasser.
  6. Spin bei 1500 UpM 1 min wie zuvor. Saugen Sie den Überstand 200 ul Wasser verlassen, um nicht den Wurm / egg Pellet stören.
  7. 10 ml Wasser zu dem konischen, um die Würmer und Eier zu waschen und Spin nach wie vor auf zusätzliche Bakterien zu entfernen.

beachten: Schritte 5,8-5,11 Würmer und Eier werden zu einem Bleichmittel-Lösung ausgesetzt. Bleach wird Würmer zerstören und lassen Eier relativ unversehrt. Wenn jedoch Eier werden in Bleichlösung zu lange, werden sie auch zerstört werden. Einen Timer, als Bleichmittel in Schritt 5.8 gegeben, sicher zu sein, dass Eier nicht auf Bleichmittel für mehr als 10 Minuten ausgesetzt bleiben.

  1. Entfernen Sie alle 200 ul des Überstands, wieder die Vermeidung der Pellet, dann fügen Sie 10ml Bleichlösung und starten einen Timer.
  2. Würmer und Eier in Bleichlösung Inkubation für 3-4 min, gelegentlich Mischen durch Inversion. Dann drehen sich mit 1500 rpm für 45 sec in einer Tischzentrifuge. Sucht einem Pellet auf die Unterseite des Rohres sollte jedoch kleiner und kompakter als die ursprüngliche Pellet und könnte auf einem gelben Aussehen.
  3. Saugen Sie den Bleichlösung verlassen 200 ul hinter so dass das Pellet nicht zu stören.
  4. In weitere 10 ml frischem Bleichlösung und invertieren wie zuvor. Wenn der Timer liest 10 Minuten, drehen Sie wieder und saugen Sie den Bleichlösung, so dass 200 ul hinter und schnell 10 ml sterilem Wasser. Prüfen Sie die Lösung unter einem Binokular. Die Larven und viele der Erwachsenen sollte in der Bleichlösung aufgelöst zu haben, so dass meist Eier hinter sich.
  5. Spin wie zuvor für 45 sec und der Überstand erneut absaugen, so dass das Pellet nicht zu stören. Dieses Pellet sollte in erster Linie Eier enthalten und wird sehr locker sein.
  6. Anot hinzufügenihr 10 ml Wasser, Invertzucker zu mischen, Spin und saugen ein wenig Wasser hinter sich zu lassen. Es ist wichtig, so viel Bleichlösung wie möglich zu entfernen.
  7. 4 ml S-komplette Medien der konischen Röhre, suspendieren die Eier übertragen und in einen sterilen 100 ml Erlenmeyerkolben. Der Kolben wird in einer 20 ° C-Inkubator auf einem Schüttler bewegt nur schnell genug ist, um die Inhalte des Kolbens zu wirbeln. Dadurch wird eine ausreichende Belüftung sorgen, um die L1-Larven zu unterstützen, wenn sie schlüpfen. Innerhalb von 15 Stunden alle Eier ausgebrütet sollte Herstellung eines Synchron Bevölkerung von L1-Larven festgenommen haben.

Arrested L1-Larven sollte jede Woche frisch gemacht werden während einer Bildschirm. Nachdem die erste Partie gemacht worden ist, können nachfolgende Chargen durch Zugabe von 500 verhaftet L1-Larven (von der vergangenen Woche die Batch) zu jedem der vier Standard, entkernt 6 cm Platten (mit 100 ul-Nacht-Kultur von OP50) gestartet werden kann, und bei 20 inkubiert ° C für 4 Tage. Am vierten Tag sollten die Platten enthaltenviele Eier und schwangeren Erwachsenen und kann gebleicht werden, um frische Eier für mehr synchronisiert L1-Larven vorzubereiten.

6. Übertragen verhaftet L1-Larven auf Futterplatten

Überblick: Um eine dsRNA-Bildschirm durchführen, werden verhaftet 20-30 L1-Larven auf dsRNA Fütterung Platten übertragen. Frühe Knockdown-Effekte wie Larvenfestnahme oder Letalität beobachtet, nachdem die Tiere haben sich auf dsRNA-exprimierenden Bakterien für 2-3 Tage gefüttert werden. Je nach auf dem Bildschirm durchgeführt, je nach Wunsch entweder Phänotypen in den ursprünglichen Tiere auf der Futterplatte (P0 Tiere) oder in ihren Nachkommen (F1 Tiere) beobachtet werden. Die Darstellung der Phänotyp wird von einer Anzahl von Variablen einschließlich des perdurance des Proteins durch das Gen, dessen Expression abgerissen und der Zeit während der Entwicklung, in dem das Gen von Interesse kodiert wird benötigt abhängen. Ab dsRNA Futterkulturen mit nur 20-30 Tiere sollten Beobachtung sowohl P0 und F1 Phänotypen ermöglichen, bevor einimals erschöpfen die Nahrungsquelle.

Um 20 bis 30 Tiere ganz einfach in Fütterungsplatten, zuerst bestimmen die Konzentration von L1 verhaftet Tiere in der verhaftet L1 Kultur.

  1. Mischen Sie den Erlenmeyerkolben mit dem L1-Larven festgenommen, um die Tiere zu vertreiben.
  2. Entfernen Sie ein 10 ul Aliquot Ort und tropfenweise auf eine ungesetzte 6 cm NGM Platte in 4-5 fällt die Mitte der Platte darauf achten, dass alle Medien aus der Pipette ausgestoßen.
  3. Mit dem Ende der Pipettenspitze verteilt die Punkte der Wurm Suspension auf eine einzige durchgehende Linie von Flüssigkeit, die den Durchmesser der Platte erstreckt bilden.
  4. Mit einem Binokular, zählen alle Tiere ab einem Ende der Linie von Flüssigkeit und bis zum anderen Ende, bevor die Flüssigkeit in die Platte aufgenommen hat und die Tiere verteilen. Dies kann konstant Neuausrichtung des Binokular erfordern bestimmte, dass keine Tiere verpasst zu sein.
  5. Wiederholen Sie dies für drei separate 10 ulAliquots und der Mittelwert der drei Zahlen, die durchschnittliche Anzahl der Würmer pro ul Schnecken Suspension zu bestimmen und Aufzeichnen dieser Nummer direkt auf den Erlenmeyerkolben.

7. Beginnen Sie mit der Fütterung Bildschirm

Überblick: Um die dsRNA-Bildschirm zu beginnen, sind 20-30 verhaftet L1-Larven in jede Vertiefung der 12-Well-Platten, die Fütterung einer dünnen Rasen von dsRNA-exprimierenden Bakterien aufgenommen. Zuführen von Platten enthalten Standard Nematoden Wachstumsmedium (NGM) und mit 500 ug / ml Carbenicillin (Plasmid Verlust zu verhindern) und 1 mM IPTG (dsRNA zur Expression zu induzieren) ergänzt. Tiere sind bei 20 ° C zu füttern und für mehrere Tage entwickeln Zwei typische Fütterungsregime für die Tiere sind 3 Tage, wenn sie eine P0-Bildschirm und 6-7 Tage bei der Durchführung eines F1-Bildschirm. Die Dauer der Zufuhr kann jedoch abhängig von den spezifischen Phänotypen in dem Bildschirm gesucht variiert werden.

  1. Verwenden Sie die Suspension von L1-Larven festgenommen und steriles Wasser, um eine so bereitenLösung enthält 2.000 Würmer / ml. Jeder 12-Well-Platte Fütterung wird 120 ul dieser Wurm Aussetzung erforderlich. Mischen Sie gründlich, um eine gleichmäßige Verteilung der Tiere sicherzustellen, und übertragen Sie die Tiere in einen sterilen Behälter zum Pipettieren.
  2. Mit der Mehrkanalpipette mit Tipps in jeder dritten Position (siehe Abbildung 1) Transfer 10 ul der Wurm-Lösung direkt auf dem Bakterienrasen der Futterplatten. Achten Sie darauf, nicht die Oberfläche des Agar durchbohren, wie Würmer werden in den Agar graben und nicht ernähren sich von den dsRNA-exprimierenden Bakterien.
  3. Remix der Wurm Lösung im Behälter (durch leichtes Schwappen es etwa) nach jeweils zwei Reihen von Futterplatten, Würmer schnell absetzen. Das Dosieren der Wurm Aussetzung, bis alle Platten Fütterung Würmer. Untersuchen Sie ein paar Brunnen früh unter dem Binokular, um sicherzustellen, dass jeder gut ist immer 20-30 Würmer.
  4. Shop Platten aufrecht in einer Feuchtkammer in einem 20 ° C Inkubator. Am nächsten Tag nach der WOrm Suspension in die Platte aufgenommen, kehren die Platten und zum Humidor bei 20 ° C Nach 3 Tagen (für P0 Phänotypen) Tiere können auf diesen Platten beobachtet werden und wieder nach 6 Tagen (für F1 Phänotypen).

Hinweis: Die Bakterien, die für die Fütterung Platte nach 7 Tagen Wachstum bleiben Wurm wurden für Plasmid-Verlust getestet und nahezu 100% behielt die dsRNA-Plasmid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

P0 Zuschlags Phänotypen beginnt nach 2-3 Tagen der Fütterung der Tiere dsRNA exprimierenden Bakterien erscheinen. Einige frühe Larven Phänotypen gehören Verhaftung und Letalität und sollte in 2-3% aller Brunnen Fütterung beobachtet werden. Diese gleichen Phänotypen wird auch in der F1-Generation Tieren beobachtet werden. Die Anwesenheit von F1 Eier, die nicht zu schlüpfen ist eine weitere gemeinsame F1 Phänotyp, und gemeinsam werden diese drei Phänotypen in fast 10% aller Brunnen in F1 Bildschirmen beobachtet werden.

Wir verwendeten die hier beschriebenen Protokoll zum Zuschlags Effekte für mehrere Gene in einer Vielzahl von Gewebetypen sowohl P0 und F1 Phänotypen exprimiert untersuchen. Da wollten wir auch für die Zuschlags Effekte in Nervengewebe zu testen, verwendeten wir eri-1; lin-15B-Mutanten in unseren Bildschirmen. Mutationen in eri-1 und lin-15B, zusammen mit Mutationen in rrf-3, wurden in Bildschirme für Mutationen, die zu erhöhter Empfindlichkeit RNAi 8,13,14 verursacht identifiziert.

EGL-30, dpy-17, pat-10 und unc-4. Zwei dieser Gene, egl-30 und unc-4 werden im Nervensystem 15-17, ein Gen, pat-10, ist im Körper Muskel-Wand 18 ausgedrückt, und die vierte Gen exprimiert, dpy-17, ausgedrückt in Hypodermiszellen 19. Wenn wir eri-1 zugeführt wird; lin-15B Tiere Bakterien, die die leeren pL4440 Plasmid enthielt aber eine dsRNA nicht ausdrücken, haben wir nicht beobachten, keine morphologischen oder Verhaltensfehler (2A, Tabelle 1).

egl-30 kodiert die C. elegans Ortholog des G-Protein-Untereinheit Gaq. egl-30-Null-Mutanten Verhaftung während der frühen Entwicklung der Larven, aber einige null Fliehenden und hypomorphen loss-of-function egl-30-Mutanten wachsen zu erwachsenen Stadium werden und sind defekt in Fortbewegung und Eiablage-Verhalten 20. Wannwir L1 Bühne eri-1 zugeführt wird; lin15B Larven Bakterien, die egl-30 dsRNA, fanden wir, dass die Larven wuchsen an Erwachsene, die klare Mängel in Fortbewegung und Eiablage-Verhalten zeigte geworden. Nach drei Tagen, 100% der Tiere gegen egl-30 zugeführt dsRNA wurden gelähmt und nicht in der Lage, Eier zu legen (2B, Tabelle 1). Wir haben nicht den Larven Verhaftung Phänotyp in unserem dsRNA Zuschlags Experimente, die in der EGL-30 (ad810) null Tieren beobachtet wird beobachten. Dies ist vermutlich, weil die Tiere, die wir auf L1 egl-30 dsRNA Bakterien überzogen hatte bereits die frühen Entwicklungsbedarf für EGL-30 geleitet. Dies unterstreicht den Vorteil der Fütterung Bildschirme: Late-Stage-Phänotypen nach Genen, die auch während der Entwicklung spielen eine lebenswichtige Rolle zu beachten.

dpy-17 für einen Nagelhautbildung in C benötigt Kollagen-Protein kodiert elegans 19. dpy-17-Null-Mutanten kürzer und dicker als Wildtyp-anim sindALS. Wir haben keine morphologischen Defekte in P0-17 Tiere dpy dsRNA gefüttert beobachten. , 98% der F1-Tiere zeigten jedoch die Dpy Phänotyp (2C, Tabelle 1). Das Fehlen von kurz und dick P0 Tiere zeigt, dass dpy-17-Gen-Funktion in frühen Larvenstadien für die richtige Körpermorphologie erforderlich. Während dpy-17 wurde nicht in anderen Bildschirme gezielte Fütterung wurde, es nach unten durch dsRNA Injektion 21 geklopft wurde. Interessant ist, dass nur 30% der Nachkommen von dsRNA injizierten Tieren zeigte die Dpy Phänotyp, was darauf hindeutet, dass die hier beschriebenen Fütterungsprotokoll ist effizienter als die arbeitsintensiver Injektion Ansatz, zumindest für einige Gene.

pat-10 kodiert Körperwandmuskel-Troponin C, ein Protein, das vier EF-Hand-Motive, die Calcium-18 zu binden. Wir fanden, dass 100% der eri-1; lin-15B Tiere verfüttert pat-10 dsRNA wurde innerhalb von 3 Tagen gelähmt und legte keine Eier führenden toa letalen Phänotyp (2D, Tabelle 1).

unc-4 kodiert für ein Protein, das in homeodomain ventralen Kabel motorischen Neuronen exprimiert und ist für die ordnungsgemäße synaptischen Eingangs Wahl 22,23 erforderlich. Wir haben uns für unc-4 als Test-Gen, da es sich als resistent gegenüber früheren dsRNA Fütterungsstrategien 8,24 sein. Unc-4-Mutanten zeigen einen Defekt im Bewegungsverhalten. Als Ergebnis der Defekte in der synaptischen Konnektivität, sind unc-4-Mutanten nicht wieder 22,23. Im Vergleich zu Wildtyp-Tiere, die frei in einer sinusförmigen Bewegung zurück, wenn auf den Kopf stieß, unc-4 Null-Mutanten nicht zurück und stattdessen ihre Körpermitte angeordnet Vertrag fest, was zu einer dorsalen Biegung, die wird oft so extrem, dass der Kopf und der Schwanz des Tier berühren, indem der Körper in einer aufgewickelten Position. Wir fanden, dass 68% der Tiere verfüttert unc-4 dsRNA-exprimierenden Bakterien aus unserer Bibliothek Vorbereitung zeigte Mängel in backing. Dies ist eine dramatische Verbesserung der Zuschlagseffizienz im Vergleich zu der 0% Träger Defekt mit zuvor veröffentlichten Protokollen 8 (Tabelle 1) beobachtet wird, wenn RRF-3 Tiere gefüttert unc-4 dsRNA.

Figur 1
Fig. 1 ist. Flussdiagramm für Bibliothek Vervielfältigung und großen Bildschirm. Jeder 96 oder 12-Well-Platte während der Screening-Protokoll erzeugt wird angegeben, zusammen mit der verwendet wird, um Bakterien zwischen den Platten übertragen Methode. Sternchen zeigen die Schritte, bei der Bakterien sollte Plasmidverlust getestet werden. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Figur 2
2. dsRNA Zuschlags Phänotypen von C. elegans-Gene in verschiedenen Gewebetypen exprimiert. A) Kontrolltiere gefüttert Bakterien, die pL4440 leeren Vektor. Schwarze Pfeil zeigt die Position einer jungen erwachsenen Tier. Weiße Pfeil zeigt die Position einer Gruppe von gelegten Eiern. Foto zeigt sich frei bewegenden Tieren, wie durch ihre normale Körperhaltung zeigt. B) Tiere gefüttert dsRNA gegen egl-30. Beachten Sie, dass alle Tiere haben eine starre Aussehen typisch für gelähmte Tiere angenommen. Beachten Sie auch die vollständige Abwesenheit von gelegten Eier auf dem Teller. C) Tiere gefüttert dsRNA gegen dpy-17. Beachten Sie, dass erwachsene Tiere auf dem Feld (ein mit Pfeil markiert) sind kürzer und dicker als die in Panel A. D gezeigt erwachsenen Tier) Tiere gefüttert dsRNA gegen pat-10. Beachten Sie, dass alle Tiere sind gelähmt, kann aber immer noch den Kopf bewegen, um Muskeln zu ernähren, wie durch das Clearing von Bakterien in der Nähe des Kopfes angedeutet, mit Pfeil markiert. Maßstab 1 mm.

Plasmid-oder dsRNA-Gen durch gezielte feeding Tissue Expression von Zielgens Prozent Tiere mit Terminal-Phänotyp
pL4440 (negative Kontrolle) Wildtyp für alle Verhaltensweisen
egl-30 Nervensystem 100% Egl und gelähmt
dpy-17 Haut 98% Dpy
pat-10 Körperwand Muskel 100% gelähmt
unc-4 Nervensystem 68% Backing Defect

Tabelle 1. Terminal-Phänotyp der Tiere gegen Gene in verschiedenen C ausgedrückt gefüttert dsRNA elegans Gewebe. n = 100 für alle Gene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Wir haben ein Protokoll, das einen im Handel erhältlichen Futter dsRNA-Bibliothek verwendet, um große Bildschirme in C durchzuführen beschrieben elegans. Wir bieten alle Anweisungen, die Bibliothek zu kopieren und es effektiv zu nutzen. Wir zeigen, dass dieser Ansatz in der Lage ist, Gene in verschiedenen biologischen Prozessen in verschiedenen Geweben der Tiere beteiligt sind. Während die Phänotypen wir hier beschreiben, sind leicht zu beobachten (UNC, Egl und Dpy), kann dieses Protokoll angepasst, um Gene, die für nahezu alle biologischen Prozess erforderlich gesucht werden. Zum Beispiel haben wir dieses Protokoll verwendet, um Gene, die für die Neurotransmission in der Schnecke 25 erforderlich identifizieren. Tiere, die einmal auf Bakterien, die dsRNA zugeführt (in der Regel 3 Tage P0 Bildschirme, 6-7 Tage F1-Bildschirme), können sie von der Zufuhrplatte entfernt und für jede Verhaltens Phänotyp getestet werden.

Plasmid-Verlust:

Wir fanden, dass die reduzierten Zuschlags Effizienz während beobachtetGroßbildschirme dsRNA kann direkt mit dem Verlust von dsRNA Plasmid von den den Schnecken zugeführt Bakterien zugeschrieben werden. Plasmid Verlust tritt in das Bakterienwachstum Kulturen, weil β-Lactamase, auf der dsRNA-Bibliothek Plasmid codiert wird, wirkt sowohl Ampicillin Carbenicillin und abbauen, wodurch die Konzentration dieser Antibiotika über die Zeit. Wenn die Konzentration des Antibiotikums ausreichend niedrig wird, können Bakterien, die das Plasmid enthalten, nicht überleben und Füllen der Kultur. Die Verwendung solcher gemischten Bakterienkulturen in dsRNA-Bildschirme sind zu vermeiden, da sie zeigen, reduzierter Aktivität und Zuschlags oft nicht dazu führen loss-of-function Phänotypen 11. Überraschenderweise haben wir festgestellt, dass hohe Konzentrationen von Plasmid-Verlust sogar in Bakterienkulturen in sehr hohen Konzentrationen an Ampicillin (bis zu 2 mg / ml) gezüchtet auftreten. Während Carbenicillin resistenter gegen den Abbau durch β-Lactamase, fanden wir noch notwendig, um Konzentrationen von Carbenicillin, die 10-40 mal höher als diejenigen waren verwendenin zuvor veröffentlichten dsRNA Zufuhr 8-10,26 Bildschirmen verwendet, um sicherzustellen, dass alle Bakterien in der Kultur zurückgehalten dsRNA Plasmid.

Da die meisten Gene in C. elegans haplosufficient sind, ist es von entscheidender Bedeutung, dass alle an Tiere verfüttert Bakterien dsRNA exprimieren. Dies stellt sicher, hocheffiziente Gen Knockdown und erhöht die Wahrscheinlichkeit der Beobachtung loss-of-function-Phänotypen in großen Bildschirmen.

Positive und negative Kontrollen:

Es ist wichtig, sowohl positive als auch negative Kontrolle Bakterien in jeder Fütterung Platte bei der Durchführung Schirme gehören. Die negative Kontrolle ist besonders wichtig, wenn Verhaltenstests verwendet werden, um Gene von Interesse zu identifizieren. Für eine negative Kontrolle verwenden wir Bakterien, die das Leervektor pL4440. Für eine positive Kontrolle, ist es am besten, um Bakterien, die dsRNA gegen ein Gen, das die gewünschte Zuschlags Phänotyp verursacht ausdrücken zu verwenden. Wenn jedoch keine solche Gene sind, wissenn, sollte eine positive Kontrolle für die Zuschlags verwendet werden, die eine leicht beobachtbaren Phänotyp verursacht. Bei der Auswahl eines solchen Gens, der Vorzug zu Gene, die in dem Gewebetyp des Bildschirms gezielt exprimiert werden gegeben werden. Beispielsweise in der dsRNA Zufuhr Bildschirme für neuronaler Phänotypen, eine neuronale Gen als positive Kontrolle gewählt werden. Ein Zuschlags beobachtbaren Effekt bei Tieren Fütterung auf die positive Kontrolle Bakterien an, dass die dsRNA-Interferenz in der gewünschten Gewebetyp funktioniert.

Am besten ist es, wenn die Person, die Punktwertung der Futterplatten für Phänotypen ist blind für die Lage der positiven Kontrolle Brunnen. Der Screener sollte in der Lage, leicht die positiven sowie in jedem 96-Well-Platte sein. Für Verhaltenstests ist es hilfreich, auch die negative erste vor dem Scannen die restlichen Brunnen punkten.

Durchsatz:

Über dieses Protokoll sollte eine Person in der Lage, 16, 12-Well-Platten einrichten und Bildschirmpro Tag. Um effizient durch die Bibliothek bewegen, wir in der Regel jedes gut jeder Bibliothek Platte testen nur einmal während einem Bildschirm. Alle Brunnen, die als positiv bewertet werden aufgezeichnet und sind in dreifacher Ausfertigung erneut getestet. Wir verlangen, dass die positiven Vertiefungen erneut testen in allen drei Wiederholungsprüfungen. Das Plasmid wird dann von den Bakterien gereinigt und das Insert sequenziert, um das Gen positiv zu identifizieren. Wenn Null-Mutanten sind für das Gen vorliegen, werden wir sie bestellen und testen Sie die Null-Tiere für die Verhaltensfehler auf dem Bildschirm identifiziert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Mittel aus den National Institutes of Health MH097163 unterstützt. Einige Stämme wurden von der CGC, die von der NIH Office of Research Infrastructure Programme (P40-OD010440) gefördert wird.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
96-well Falcon flat bottom plate Fisher Scientific 353072 sterile
adhesive foil USA Scientific 2923-0100
Nunc omniplate Fisher Scientific 267060
2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock USA Scientific 5678-0285 autoclavable
Lids for deep well plates USA Scientific 5665-6101
50 ml combitips USA Scientific 4796-5000 individually wrapped
Reservoir USA Scientific 2977-8500 autoclavable
12-well plates USA Scientific CC7682-7512 individually wrapped
dsRNA feeding library OpenBiosystems RCE1181 store -80 °C
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-5
Tetracycline Fisher Scientific BP912-100
Carbenicillin allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com
Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A Affymetrix 10906 for worm plates
Equipment
Brayer roller USA Scientific 9127-2940
B–kel 96-pin replicator Fisher Scientific 05-450-9 autoclavable
microshaker Thomas Scientific 1231A93 3 mm orbit
12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl) USA Scientific 7112-0510
12 channel multichannel pipet (30-300 μl) USA Scientific 7112-3300
Repeater Plus manual pipettor USA Scientific 4026-0201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mello, C. C., Conte, D. Jr Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
  2. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  3. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
  4. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
  5. Jose, A. M., Smith, J. J., Hunter, C. P. Export of RNA silencing from C. elegans tissues does not require the RNA channel SID-1. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2283-2288 (2009).
  6. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  7. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
  8. Simmer, F., et al. Genome-wide RNAi of C. elegans using the hypersensitive rrf-3 strain reveals novel gene functions. PLoS Biol. 1, 77-84 (2003).
  9. Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat. Genet. 33 (1), 40-48 (2003).
  10. Sieburth, D., et al. Systematic analysis of genes required for synapse structure and function. Nature. 436 (7050), 510-517 (2005).
  11. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), (2001).
  12. Hodgkin, J. Karyotype, ploidy, and gene dosage. WormBook. , 1-9 (2005).
  13. Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).
  14. Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436 (7050), 593-597 (2005).
  15. Lackner, M. R., Nurrish, S. J., Kaplan, J. M. Facilitation of synaptic transmission by EGL-30 Gqalpha and EGL-8 PLCbeta: DAG binding to UNC-13 is required to stimulate acetylcholine release. Neuron. 24 (2), 335-346 (1999).
  16. Bastiani, C. A., Gharib, S., Simon, M. I., Sternberg, P. W. Caenorhabditis elegans Galphaq regulates egg-laying behavior via a PLCbeta-independent and serotonin-dependent signaling pathway and likely functions both in the nervous system and in muscle. Genetics. 165 (4), 1805-1822 (2003).
  17. Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. J. Neurosci. 21 (6), 2001-2014 (2001).
  18. Terami, H., et al. Genomic organization, expression, and analysis of the troponin C gene pat-10 of Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 146 (1), 193-202 (1999).
  19. Novelli, J., Page, A. P., Hodgkin, J. The C terminus of collagen SQT-3 has complex and essential functions in nematode collagen assembly. Genetics. 172 (4), 2253-2267 (2006).
  20. Brundage, L., et al. Mutations in a C. elegans Gqalpha gene disrupt movement, egg laying, and viability. Neuron. 16 (5), 999-1009 (1996).
  21. Gönczy, P., et al. Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature. 408 (6810), 331-336 (2000).
  22. Miller, D. M., et al. elegans unc-4 gene encodes a homeodomain protein that determines the pattern of synaptic input to specific motor neurons. Nature. 355, 841-845 (1992).
  23. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. Mutations in the Caenorhabditis elegans unc-4 gene alter the synaptic input to ventral cord motor neurons. Nature. 355, 838-841 (1992).
  24. Johnson, N. M., Behm, C. A., Trowell, S. C. Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome. Gene. 359, 26-34 (2005).
  25. Wani, K. A., et al. D1 dopamine receptor signaling is modulated by the R7 RGS protein EAT-16 and the R7 binding protein RSBP-1 in Caenoerhabditis elegans motor neurons. PLoS One. 7 (5), e37831 (2012).
  26. Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi screening to identify postembryonic phenotypes in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3442 (2012).

Tags

Entwicklungsbiologie Caenorhabditis elegans (C. elegans) Gene Knockdown-Techniken, DsRNA Störungen Gen-Knockdown Groß Fütterung Bildschirm
Groß Gene Knockdown in<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwenden dsRNA Fütterung Bibliotheken zu Robust Loss-of-function Phänotypen generieren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maher, K. N., Catanese, M., Chase,… More

Maher, K. N., Catanese, M., Chase, D. L. Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes. J. Vis. Exp. (79), e50693, doi:10.3791/50693 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter