Summary
而喂养的dsRNA在C线虫是一种功能强大的工具来评估基因功能，为大规模饲养屏幕当前的协议导致变量击倒效率。我们描述了一种改进的协议用于进行大规模的RNAi馈送屏幕，导致基因表达的高度有效的和可再现的击倒。
Abstract
通过喂食虫细菌表达dsRNA的RNA干扰一直是一个有用的工具，以评估在C基因功能线虫 。虽然这种策略效果很好，当少数基因的有针对性的击倒，大规模饲养的屏幕显示出不同击倒效率，这限制了它们的效用。我们已经解构先前公布的RNAi敲低的协议，发现降低击倒的主要来源可以归因于双链RNA编码的质粒从输送到动物的细菌的损失。基于这些观察，我们已经开发出一种dsRNA的喂养方案，大大减少或消除质粒的损失，实现高效率，高通量击倒。我们表明，该协议将产生稳定，可重复敲C的下降线虫基因在多种组织类型，包括神经元，并且将允许在大型屏幕有效击倒。该协议使用市售的dsRNA喂养图书馆和描述要复制的库和执行的dsRNA屏幕所需的所有步骤。该协议不需要使用任何复杂的设备，并因此可以通过任何C下执行线虫实验室。
Introduction
从历史上看，遗传筛选中C。线虫已经被治疗动物用化学诱变剂例如乙基甲磺酸酯向DNA中创建随机突变进行。后代诱变的动物或grandprogeny然后分离出具有所期望的异常表型。负责引起表型的突变，然后通过一个劳动密集的映射过程或通过测序突变体蠕虫的整个基因组鉴定。有许多优势，进行这样的化学诱变屏幕，因为它们创建了蠕虫的基因组内的永久损伤，可能导致获得性功能的功能丧失和两个表型，但该映射过程是缓慢和昂贵。
双链RNA干扰（dsRNAi）提供鉴定参与重要生物学过程的基因替代的方法。在该方法中，dsRNA的匹配的内源基因的编码序列导入该蠕虫。所述dsRNA 在体内处理，生成较小（21-22核苷酸）的RNA充当导游来查找和绑定匹配的内源mRNA，针对他们毁灭1。这个过程是比较快的，但是由于双链RNA靶向的mRNA而不是DNA，还原功能只表型都采用这种方法观察到。
导入的dsRNA导入动物可以通过直接注射的dsRNA 2来实现，由或喂养表达dsRNA的4只动物的细菌浸泡动物中的dsRNA 3。每一种分娩方式引起全身击倒效果的动物大部分细胞表达的SID-1，能够导入的dsRNA 5的跨膜通道。本来作为一个反向遗传学的方法拦截单个基因的一个表达的时间，两个进料库的发展现在允许大规模的遗传筛选。在市售的dsRNA库包含巴代表所有三任55％或87％cterial克隆线虫基因6,7。
不幸的是，大规模的dsRNAi喂养的屏幕往往会造成变量击倒效率8-10。而击倒通过RNAi的绝对水平是不容易测量的，在大型屏幕中观察到的减少击倒效率必须由逸出降解通过RNAi残余基因特异性的mRNA而引起。这，反过来，可能是从细菌中这些屏幕饲喂给动物的dsRNA质粒丧失的直接结果。支持这样的想法，动物喂食细菌的混合物，其中只有50％的细菌表达针对靶基因的dsRNA，显示显着减少（如果有的话）时相比，控制馈动物11拦截效果。执行dsRNAi屏幕为大多数基因在C.当基因敲除的程度成为一个关键问题线虫是haplosufficient，因此基因的表达必须由至少50％T降低Ø造成损失的功能表型12。
我们使用先前公布的喂养方案来执行大型屏幕和报告发现别人8-10相同的变量击倒效果。在寻找可能的原因，我们发现，近60％的喂养动物在屏幕的细菌失去了双链RNA的质粒。我们已经开发了一个库中的重复和筛选方案，大大减少或消除质粒的损失，大大提高击倒效率。该协议适用于C。进行大规模的屏线虫 ，可用于筛选市售的dsRNA的库中的任一个。使用此协议，我们发现，基本上100％的画面中喂养动物的细菌保留了双链RNA编码的质粒，造成强大的和高渗透剂功能丧失表型检测的所有组织。
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Protocol
注意：该协议可以被用来确定在各种组织类型的所需的各种生物过程的基因。由于屏幕中一个必要的质量控制，动物被喂正反两方面的控制双链RNA表达的细菌，以证明在目标组织的RNAi效应。
其他已发表 馈送协议生长的dsRNA表达菌中为50μg/ ml的氨苄青霉素或25微克/毫升羧苄青霉素8-10的存在。我们已经发现，在这些条件生长的细菌失去了双链RNA的质粒在高频率。事实上，我们发现，即使当细菌在非常高的浓度（高达2毫克/毫升）的氨苄青霉素的细菌的50％以上的过夜生长不再含有质粒。而生长在羧苄青霉素通常导致更高的保留质粒，25微克/毫升不足以防止质粒丢失。相反，我们发现，羧苄西林浓度被要求的500微克/毫升的增长，系统蒸发散在液体培养基和2毫克/毫升羧苄青霉素被要求阻止质粒亏损时，细菌生长在固体琼脂基质中阻止质粒丢失。
因为质粒是保留拦截成功的关键，只有羧苄青霉素时使用dsRNA的细菌培养在这个协议。我们已经仔细优化在此协议中描述的细菌的生长培养物中使用的羧苄青霉素的浓度，以确保细菌不含有质粒没有在这些培养物中生长。然而，作为质量控制措施，质粒丢失可以在几个步骤的协议来确定。为了确保有效的击倒，80％以上的细菌在每一个步骤中都必须包含双链RNA的质粒。如果细菌在协议的任何步骤的20％以上已经失去了双链RNA的质粒，检查所使用的羧苄青霉素的质量。羧苄青霉素应新鲜它被使用的当天制备。准备新鲜的羧苄青霉素和重复文化。
1。如何确定质粒亏损
- 除去细菌的一个小样本（如在每个步骤相关描述），并将其添加到450微升无菌水。
- 用100微升这种稀释的样品用无菌水混合溶液稀释彻底之间建立进一步的1:10 1:100和1:1000系列稀释。
- 传播100μl的每个稀释到LB和LB AMP板，并在37℃下过夜孵育这些板
- 第二天，识别LB平板，它包含100和500的细菌菌落之间。计数菌落对这个板块和相应的LB AMP板数（包含相同的稀释细菌）。
- 确定从这些菌落数质粒丢失。菌不含有该质粒是用式1计算的，应该对有效的dsRNA击倒小于15％的百分比。
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2。做重复的库板
概述：dsRNA的库将从制造商（OpenBiosystems），为在96孔板中10566的细菌克隆到达。在-80℃冷冻储存立刻板块。原始库板将被复制和所有馈送屏幕将使用重复的库板为细菌的来源。这是明智的存储正本和副本的库板在单独的冰柜。对于建议便于搬运，重复10只，每天的库板。
- 从-80℃冰箱中取出的库板（S），取出铝箔封口，同时培养仍然处于冻结状态。更换库板的塑料盖，将板在一个水平面上，在室温下解冻（不超过30分钟）。
注：我们注意到一个显著p在原始库板的每个孔中的细菌的ercentage不含有质粒。然而，因为库的细菌是一种珍贵的资源，不建议在原始文库培养物来测试质粒丢失。
- 使用多道移液器，加150微升库复制媒体的一个空的96孔平底重复的板的各孔中。
- 通过上下吹打四到五倍使用多道移液器设置为100微升混合解冻库的细菌培养物。然后取出10微升每个混合培养，并转移到重复板的相应孔中。继续从库板转移的文化复制制版一定要改变每次传输的枪头。
- 之后从图书馆板所有文化已经转移，覆盖原来的库板采用BRAYER辊，以确保彻底的封新胶粘薄膜的水井。重新装上塑料盖子上盘和将其直立在-80℃冷冻，直到培养物已再冷冻（至少30分钟）。然后将原来的库板回库储存箱。
- 摇重复的库板的文化平8-10小时，在37℃（450转上microshaker，轨道3毫米），。
- 确定在每个重复的库板的质粒丢失。我们发现，这种细菌在原始库板的每个孔中的高比例不含有双链RNA的质粒。这些细菌不利于生长在重复的文库是很重要的。为了防止它们的生长，高浓度的羧苄青霉素用于在库中复制媒体（3毫克/毫升）。使用这些条件的复制盘的培养后发现，90％以上的细菌含有双链RNA的质粒。从每个重复板的代表性培养井中取出10微升样品，并将其添加到450微升无菌水。使用这些稀释的样品，确定在每个重复文库质粒丢失按照步骤1.1-1.4板。如果观察到显著质粒损失（>菌中复制的库的20％不含有质粒），用新鲜的羧苄青霉素重拍培养基中，并从步骤2.1重复协议。
- 温育后，直接将一个新的箔粘合片在重复的板孔中，并放置在板的盖子移到该箔。将重复的库板直立在-80°C冰箱（至少30分钟），直到冰冻。一旦冻结，移动板，用于长期存储重复的库的存储箱。
3。上Omniplates使得图书馆的临时副本
概述：要开始准备食物的dsRNA的屏幕，从重复的库板的细菌被转移到固体琼脂omniplates和过夜培养。为了防止丢失质粒在固体培养基上，omniplates含有羧苄青霉素在2毫克/毫升。可以使用一段在这些平皿上的细菌一个星期，并显示没有质粒的损失。我们并没有在生长在omniplates超过一周时间测试细菌质粒丢失。
- 从-80℃冰箱中取出重复的库板（S），然后取下铝箔封口，而文化仍然处于冻结状态。去除箔后，更换板的塑料盖，并设置重复的库板在一个水平面上，在室温下解冻（不超过30分钟）。
- 消毒布克尔96针复制。一个干净的复制的标签应用蒸馏水冲洗，然后在每次使用前灭菌。消毒复制器，将其放入乙醇浴（3/4深在耐热盘），然后烧乙醇涂引脚关闭使用本生灯。使火焰熄灭，然后重复。
- 将灭菌复制到解冻的重复板的孔中，并用它来轻轻搅动培养物。小体积的培养将坚持以复制的引脚。 <LI>小心地从重复板的孔中删除复制，并把它（引脚向下）轻轻地omniplate的表面，小心不要刺破琼脂表面。保留复制的omniplate表面上3-4秒，这样从复制器的引脚细菌被转移到琼脂表面。
- 取出复制，并允许细菌培养体积小（2-3微升）吸收到琼脂。在37℃下倒置15-18小时的omniplates这些omniplates可第二天早上接种到96孔的液体培养。另外，含过夜细菌菌落omniplates可以存储长达七天，在4°C。
- 到副本传输额外的复制版，冲洗复制技巧用无菌水，并通过将复制器在乙醇和燃烧两次，和以前一样重复灭菌过程。一旦消毒，复制器可用于下一个重复的板块。
4。对于饲养蠕虫准备细菌
Ø概述：细菌供给蠕虫利用从omniplates菌制备为1 ml液体培养基（在96孔格式）。这些液体培养物生长过夜，产生饱和nonlogarithmic细菌培养。过夜生长可确保所有培养物将包含相似浓度的细菌，因此，所有蠕虫将被送入食物的量相同。没有这个生长过程中的质粒丢失应得到遵守。
- 分配1毫升细菌生长培养基的成2毫升深孔96孔板中使用重复移液器和50毫升Combitip每个孔中。
- 将无菌复制到包含生成的细菌菌落omniplates表面的步骤3.1-3.6作出肯定的是引脚与每个96细菌菌落接触。
- 小心地从omniplate的表面移动复制到深井制版肯定的是，销不刮的深水井的两边，直到沉浸在生长介质。移动复制器慢慢在方形运动的深孔板中撞出细菌进入生长培养基的内壁以下。注意不要溅到和交叉污染水井。
- 对照孔：对于每一个96孔深孔培养板中加入的dsRNA表达细菌一口井，将作为阳性对照的预期敲除表型和阴性对照添加包含空dsRNA的载体（pL4440）细菌到另一个井。我们重新条纹控制dsRNA的表达每周一次细菌在含四环素（15微克/毫升）和羧苄青霉素（2毫克/毫升），以使细菌保持新鲜和保持质粒的LB平板上。
- 用无菌接种环从控制板（约在复制传送的细菌数量相同）中删除单井隔离菌落，接种一空井在深孔培养板。记录已接种的孔的位置。另外，与细菌c中的循环一个被移动到含有250微升生长培养基的Eppendorf管中，涡旋混合，然后用于接种多口井。
- 撼动深孔板中以650转上microshaker平坦的位置（轨道：3毫米），在37℃过夜。文化将在第二天早上饱和。无论如何，在这些文化中使用的羧苄青霉素的浓度应防止质粒丢失。
- 确定在1毫升过夜培养质粒丢失。培养物将被直接用于饲料蠕虫的画面。重要的是，80％以上的细菌在各培养物含有双链RNA的质粒。确定质粒丢失两个有代表性的文化按照步骤1.1-1.4。后市展望：超过90％的细菌在每一种文化都包含双链RNA的质粒。在即使发展到饱和状态这些过夜培养我们从来没有观察到显著质粒丢失。但是，如果观察到显著质粒损失（> 20％），用新鲜的羧苄青霉素和代表重拍生长培养基从步骤4.1吃的协议。培养物可以从原始omniplates只要omniplates少于1-2周龄的重新启动。
- 一旦用于启动1毫升文化，到omniplates被存储在4℃下，直到屏幕完成并且可以用作食物来源，开始任何再试验培养物。
- 培养过夜孵育后，用一个12通道多道移液器从深孔板取出150微升细菌培养，并喷射到进料板的表面。它不转让，蠕虫会挖洞，而不是吃的双链RNA表达菌中刺破琼脂的表面是很重要的。传输可以在一个时间（ 图1）来完成四口井。要做到这一点，将移液器吸头的多道移液器的每第三个通道（因为有每行只有4口井在送料盘）。后每组4口井被转移，变更为新的，无菌的枪头。每一个深96孔培养板，需要96个转移到8个12孔喂养板。
- 商店接种板直立在黑暗中过夜使细菌能吸收到琼脂。
5。生成的L1 C.被捕线虫幼虫
概述：L1-被捕幼虫用于启动对dsRNA的喂养板同步虫文化。通过漂白妊娠成人的人群隔离健康的卵子，然后使卵子孵出的S-完整的媒体没有食物产生这些幼虫。在没有食物的L1孵出幼虫会停滞发育，产生的L1幼虫的同步人口。在屏幕上，准备新鲜的L1-被捕幼虫每个星期，因为这些饥饿的动物生病随着时间的推移，必须丢弃。在一个双链RNA馈送菌株中使用的动物的遗传背景的选择可以根据应用而变化，对神经元的屏幕ERI-1;林-15B突变体被推荐。
- 挑选10-20 L4拉rvae含有OP50细菌草坪，等待6-7天，直到板六个独立NGM板包含许多新鲜产卵和妊娠成年人。
- 加入3毫升水，以每块板的表面从所述板除去动物和鸡蛋和用戴手套的手指，从各板的表面撞出鸡蛋，细菌和动物下水。一定要覆盖板的各个领域，特别注意细菌的草坪。使用玻璃吸管每块板去除水中的细菌，蠕虫和鸡蛋，传输至一个无菌的50ml锥形管中。
- 加入另外3毫升的水，以每块板的表面，上下吹打在表面以去除所有剩余的细菌，蠕虫和鸡蛋。此卷添加到50ml锥形管中。
- 旋转的锥形管在1,500 rpm进行1分钟的台式离心机。蠕虫和蛋应沉淀到管的底部和细菌应保持暂停。小心吸所有，但4毫升从管，一定要避免沉淀的蠕虫和鸡蛋的液体。
- 重悬沉淀蠕虫中残留的水，并用玻璃吸管转移到一个无菌的15毫升锥形管中。使体积至10ml无菌水。
- 如之前的转速为1500 rpm离心1分钟。吸出上清液留下200μl水，以免打扰蠕虫/卵沉淀。
- 加入10毫升的水，以锥形洗虫和虫卵和以前一样旋转，以去除额外的细菌。
注：步骤5.8-5.11虫和虫卵被暴露在漂白液。漂白剂会破坏虫和虫卵留相对安然无恙。然而，如果鸡蛋被留在漂白溶液太长，它们也将被破坏。设置当漂白剂在步骤5.8添加了一个计时器可以肯定，鸡蛋不保持接触漂白超过10分钟。
- 删除所有，但200微升上清液，再次避免了沉淀，再加入10毫升漂白溶液和启动一个定时器。
- 孵育3-4分钟蠕虫和鸡蛋的漂白粉溶液，偶尔颠倒混合。然后旋转以1,500 rpm持续45秒在台式离心机。寻找在管的底部上的沉淀物，它应该是更小和更紧凑的比原颗粒和可能采取的一个黄色的外观。
- 吸出漂白剂溶液离开200μl的后面，以便不打扰颗粒。
- 添加另一个10毫升新鲜漂白液和之前反转。当计时器显示的是10分钟，再旋转，吸出的漂白粉溶液，留下200微升的背后，迅速加入10毫升无菌水。检查在解剖显微镜下的解决方案。幼虫和许多成年人应该溶解在漂白液，留下大部分鸡蛋落后。
- 如前旋转45秒，然后再次吸出上清液，以便不打扰颗粒。这种颗粒应包含主要的鸡蛋，将是非常宽松的。
- 添加ANOT她10毫升的水，颠倒混合，旋转和吸留一点水后面。它以除去尽可能多的漂白剂溶液，作为可能是重要的。
- 加入4 mL S-完整的媒体到锥形管，重悬卵并转移到一个无菌的100ml锥瓶中。将烧瓶置于20℃培养箱中在振荡器上设置移动刚刚足够快，以使烧瓶中的内容，以漩涡。这将提供足够的通气支持L1幼虫，当他们孵化。在15小时所有的鸡蛋都应该有孵化生产的L1被捕幼虫的同步人口。
屏幕中被捕的L1幼虫应作出新的每周。一旦第一批已经作出，后续的批次可以通过添加500被捕L1幼虫（由前一周的批），以每四个标准，接种6厘米板（含OP50 100μL过夜培养）的启动，并孵育20 °C为4天。第四天板应该包含很多鸡蛋和妊娠成人和可漂白准备新鲜鸡蛋更同步L1幼虫。
6。传输被捕L1幼虫喂养上板
概述：要执行的dsRNA屏幕，20-30 L1被捕幼虫转移到双链RNA喂养板。动物们喂食dsRNA的表达菌2-3天后早期击倒效果，如幼虫逮捕或致死将被观察到。取决于所进行的画面上，期望表型可能要么在原动物放置在馈送盘（P0动物），或在它们的后代（F1动物）被观察到。表型的演讲将取决于许多变量，包括通过其表达撞倒的基因和在目的基因需要在开发过程中的时间编码的蛋白质的perdurance。开始的dsRNA喂养文化，只有20-30动物应该之前旁听既P0和F1的表型imals排气的食物来源。
20-30动物很容易地转移到进料板，首先要确定L1的浓度被捕动物被捕L1文化。
- 含混合被捕L1幼虫分发动物的锥形瓶中。
- 在4-5删除将10μl和地方滴上非种子选手6厘米NGM板落下板的中心确保所有的媒体从吸管中排出。
- 使用移液管尖的端部传播蠕虫悬浮液的点，形成的液体的单个连续线横跨板的直径。
- 使用解剖显微镜下，计数所有的动物开始于液体的线的一端，并继续向另一端之前的液体吸收到板和动物的分散。这可能需要的解剖范围不断重新定位可以肯定，没有动物被错过。
- 为三个独立的10微升重复此等分和平均3号以确定每微升虫悬浮液的蠕虫的平均数目，并直接在锥形烧瓶中记录该号码。
7。开始喂养屏幕
概述：为了开始所述dsRNA屏幕20-30被捕L1幼虫加到包含一个薄的dsRNA表达细菌草坪12孔馈送板的每个孔中。馈送板包含标准线虫生长培养基（NGM），并补充有500微克/毫升羧苄青霉素（以防止质粒损失）和1mM IPTG（诱导的双链RNA的表达）。动物被允许在20°C养活并发展了好几天两个典型的喂养方案动物已经过期3天进行的F1画面时执行P0屏幕和6-7天的时候。馈送的持续时间，但是，可以根据寻求在屏幕中的特定的表型变化。
- 使用L1被捕幼虫和无菌水的悬浮准备这样禄含2,000蠕虫/毫升。每个12孔送料盘将需要120微升这种蠕虫病毒悬液。调匀，以确保均匀分布的动物及动物转移到一个无菌的贮存器移液。
- 使用多道移液器设置与技巧在每一个第三的位置（ 见图1）转让10微升的蠕虫病毒液直接滴进料板的菌苔。小心不要刺破琼脂的表面，如蠕虫会钻入琼脂，而不是吃的双链RNA表达的细菌。
- 混音在水库蠕虫溶液（轻轻晃动了大约）每两行喂养板后，蠕虫迅速解决。继续配药蠕虫暂停，直到所有进料板有虫。检查几口井早就下的解剖范围，确保每口井是越来越20-30蠕虫。
- 店内板直立在20℃培养箱加湿箱。第二天，后禾RM悬浮液已被吸收到板，翻转板，并返回到雪茄盒在20℃下对这些板块的动物可以在3天后（P0为表型）进行观察后再次6天（F1的表型）。
注意：术后7天虫生长留在送料盘的细菌已经过测试，质粒丢失和近100％保留了双链RNA的质粒。
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Representative Results
P0敲除表型将开始出现后饲养动物的dsRNA表达菌2-3天。一些早期的表型包括幼虫逮捕和杀伤力，并应在所有饲养井的2-3％进行观察。这些相同的表型也将在F1代动物中观察到。 F1鸡蛋是不能孵化的存在是另一种常见的F1表型，并在一起，这三个表型将在近10％的F1屏幕所有孔的观察。
我们使用这里描述的协议，以检查对表达于多种组织类型为P0和F1的表型的多个基因敲低效果。因为我们也想测试在神经组织击倒效果，我们使用ERI-1，在我们的屏幕上的lin-15B突变体。在ERI-1和lin-15B的突变，以及在RRF-3的突变，确定了在导致增强的灵敏度的RNAi 8,13,14屏幕的突变。
：EGL-30，DPY-17，PAT-10和UNC-4。两个这样的基因，EGL-30和UNC-4，表达于神经系统15-17，一个基因，PAT-10，表示在体壁肌18和第四基因，DPY-17，是表示在皮下细胞19。当我们给ERI-1;包含空pL4440质粒，但林-15B动物细菌不表达dsRNA的，我们没有观察到任何形态或行为上的缺陷（ 图2A，表1）。
EGL-30，编码C。 G蛋白亚基的线虫同源基因GAQ。EGL-30在早期幼体发育无效突变逮捕，但有些空逃跑者和丧失功能的减效EGL-30突变体成长为成年阶段，是有缺陷的运动和产卵行为20。何时我们给L1阶段ERI-1; lin15B幼虫细菌表达EGL-30的dsRNA，我们发现，幼虫成长为成年人这表明在运动和产卵行为明确的缺陷。三天后，动物100％饲喂双链RNA对EGL-30被瘫痪，无法产卵（ 图2B，表1）。我们并没有观察到在我们这是EGL-30（AD810）空动物中观察到的双链RNA敲除实验幼虫逮捕的表型。这大概是因为在L1动物我们镀到EGL-30 dsRNA的细菌已经通过对EGL-30早期发育的要求。这突出的喂养屏幕的优势：晚期可表现型的基因发展的过程中也起到至关重要的作用进行观察。
DPY-17编码所需的角质层形成C中的胶原蛋白线虫19。DPY-17无效突变体比野生型ANIM短和胖阿尔斯。我们并没有观察到饲喂DPY-17的dsRNA P0动物的任何形态缺陷。然而，98％的F1动物表现出DPY表型（ 图2C，表1）。的又矮又胖P0动物缺乏表明DPY-17基因的功能是需要在早期幼虫阶段进行适当的身体形态。虽然DPY-17还没有得到有针对性的在其他饲养的屏幕，它是由双链RNA注射21撞倒。有趣的是，只有30％的dsRNA的后代注射的动物表现出的DPY表型，这表明在此描述的馈送协议比劳动密集型注入的方式更有效，至少对于某些基因。
PAT-10编码体壁肌肌钙蛋白C，含有结合钙18 4 EF手图案的蛋白质。我们发现，100％ERI-1，喂PAT-10的dsRNA 的lin-15B动物变成了3天之内瘫痪，并没有下蛋领先吨OA致死表型（ 图2D，表1）。
UNC-4编码表示的腹侧脊髓运动神经元的一个同源结构域蛋白，并需要适当的突触输入的选择22,23。我们选择了UNC-4作为测试的基因，因为它已被证明是耐以前的dsRNA喂养策略8,24。UNC-4突变体显示出在运动行为缺陷。由于在突触连接的缺陷所致，UNC-4突变体无力回22,23。相对于野生型动物，自由早在正弦运动在头上打了招呼的时候，UNC-4无效突变不回来，而是他们的合同中间体紧密，造成背部弯曲，往往变得如此极端，的头部和尾部动物接触，把身体盘绕位置。我们发现，动物的68％，饲喂UNC-4的dsRNA表达细菌从我们的文库制备显示，巴缺陷他妈的。这是在敲低效率的显着改善时相比，使用先前公布的协议，8（ 表1），观察到当RRF-3的动物饲喂UNC-4的dsRNA的0％背缺陷。
图1。流程图，用于图书馆的重复和大型画面。甄别协议过程中产生的每个96或12孔板中被指示，以及用于传送板之间的细菌的方法。星号表示在哪个应该细菌质粒的损失进行测试的步骤。 点击这里查看大图 。
图2。 C的双链RNA敲除表型表达于各种组织类型的线虫基因。 A）控制动物喂食含有pL4440空载体的细菌。黑色箭头表示一个年轻的成年动物的位置。白色箭头表示的一组产下的卵的位置。图为自由活动动物就证明了他们的正常的身体姿势。 二）动物喂食的dsRNA对EGL-30。请注意，所有的动物都采用了硬质外观典型瘫痪的动物。还要注意在平板上完全没有下蛋的。 三）动物喂食的dsRNA对DPY-17。需要注意的是成年动物在野外（一个带箭头标记）比在面板A. d所示成年动物更短，胖）动物喂食的dsRNA对PAT-10。请注意，所有的动物都瘫痪了，但仍然可以将其头部肌肉喂细菌的清除近头部所示，箭头标记。比例尺1毫米。
| 通过FE针对性的dsRNA质粒或基因eding | 靶向基因的组织表达 | ％的动物表型终端 |
| pL4440（阴性对照） | 野生型的所有行为 | |
| EGL-30 | 神经系统 | 100％EGL和瘫痪 |
| DPY-17 | 皮下组织 | 98％DPY |
| PAT-10 | 体壁肌肉 | 100％瘫痪 |
| UNC-4 | 神经系统 | 68％的支持缺陷 |
表1中。动物的表型终端馈送的dsRNA对表达于各种C.基因线虫组织。 N = 100的所有基因。
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Discussion
我们已经描述了使用市售的dsRNA喂养库在C中进行大规模的屏幕协议线虫 。我们提供复制的库，并有效地使用它的所有指令。我们表明，这种方法能够鉴定参与在动物的不同组织中的不同生物过程的基因。虽然我们在这里描述的表型是容易观察到（UNC，EGL，和DPY），该协议可以适于以搜索所需的几乎任何生物过程的基因。例如，我们已经用这种协议来确定所需的神经传递的蠕虫25种基因。一旦动物都喂以细菌表达的双链RNA（通常3天为P0屏幕，6-7天，对于F1的屏幕），它们可以被从馈送板除去，并测试任何行为表型。
质粒丢失：
我们发现，在减压击倒效率观察大屏幕的dsRNA可直接归因于双链RNA的质粒从供给到蠕虫细菌的损失。质粒丢失发生在细菌生长的培养物，因为β-内酰胺酶，编码的dsRNA的文库质粒，作用是既降低氨苄青霉素和羧苄青霉素，减少随着时间的推移这些抗生素的浓度。当抗生素的浓度变得足够低，细菌不含有该质粒能存活并填充培养。必须避免使用在双链RNA的屏幕这样的混合细菌培养物，因为它们显示出降低的击倒活性和往往不会引起损失的功能表型11。令人惊讶的是，我们发现，高浓度的质粒损失即使在非常高的浓度氨苄青霉素（高达2毫克/毫升）的生长的细菌培养物出现。而羧苄青霉素是降解β-内酰胺酶更耐，我们仍然认为有必要使用羧苄青霉素的浓度下分别为10-40倍，比那些更高在先前公布的dsRNA馈送屏幕8-10,26用于确保在培养的所有细菌保留了双链RNA的质粒。
因为大多数基因在C线虫是haplosufficient，这是极为重要的，喂养动物所有的细菌表达dsRNA的。这可确保高效的基因敲除，并增加观察功能丧失表型的大型屏幕的可能性。
阳性和阴性对照：
这是关键的执行屏幕时，包括阳性和阴性对照菌在每次喂奶板。阴性对照是特别重要的，如果行为测试将被用来识别感兴趣的基因。对于阴性对照，我们使用包含空载体pL4440细菌。对于阳性对照，它是最好使用表达双链RNA对基因导致所需的敲除表型细菌。但是，如果没有这样的基因是知道N，应使用的阳性对照击倒，导致一个容易观察到的表型。当选择这样的基因，应优先考虑到所表达的目标在屏幕中的组织类型的基因。例如，在双链RNA馈送屏幕用于神经元表型，神经元基因的选择应作为阳性对照。在动物上的阳性对照菌喂养可观察到敲低效果将表明，该双链RNA干扰是工作在期望的组织类型。
最好是，如果得分馈送板为表型的人是盲目的阳性对照孔的位置。的筛选应该能够轻松识别正面以及在每个96孔板。进行行为分析是有帮助的扫描剩余井之前先得分负很好。
吞吐量：
使用此协议，一个人应该能够设置和屏幕16，12孔板每天。要通过图书馆有效地移动，我们一般的屏幕测试期间，每个库板每孔只有一次。该记录为正任井记录，并重新测试，一式三份。我们要求的阳性孔复试在所有三个重考。质粒随后从细菌中纯化和插入进行测序来正确识别的基因。如果无效突变可用于基因，我们将责令他们和测试空动物在屏幕中确定的行为缺陷。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这项工作是由卫生部MH097163的国家机构的资金支持。某些菌株是由政府总部大楼，这是由研究基础设施计划的美国国立卫生研究院办公室（P40-OD010440）提供资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| 96-well Falcon flat bottom plate | Fisher Scientific | 353072 | sterile |
| adhesive foil | USA Scientific | 2923-0100 | |
| Nunc omniplate | Fisher Scientific | 267060 | |
| 2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock | USA Scientific | 5678-0285 | autoclavable |
| Lids for deep well plates | USA Scientific | 5665-6101 | |
| 50 ml combitips | USA Scientific | 4796-5000 | individually wrapped |
| Reservoir | USA Scientific | 2977-8500 | autoclavable |
| 12-well plates | USA Scientific | CC7682-7512 | individually wrapped |
| dsRNA feeding library | OpenBiosystems | RCE1181 | store -80 °C |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Tetracycline | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Carbenicillin | allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com | ||
| Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A | Affymetrix | 10906 | for worm plates |
| Equipment | |||
| Brayer roller | USA Scientific | 9127-2940 | |
| B–kel 96-pin replicator | Fisher Scientific | 05-450-9 | autoclavable |
| microshaker | Thomas Scientific | 1231A93 | 3 mm orbit |
| 12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl) | USA Scientific | 7112-0510 | |
| 12 channel multichannel pipet (30-300 μl) | USA Scientific | 7112-3300 | |
| Repeater Plus manual pipettor | USA Scientific | 4026-0201 | |
References
- Mello, C. C., Conte, D. Jr
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Jose, A. M., Smith, J. J., Hunter, C. P. Export of RNA silencing from C. elegans tissues does not require the RNA channel SID-1. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2283-2288 (2009).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
- Simmer, F., et al. Genome-wide RNAi of C. elegans using the hypersensitive rrf-3 strain reveals novel gene functions. PLoS Biol. 1, 77-84 (2003).
- Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat. Genet. 33 (1), 40-48 (2003).
- Sieburth, D., et al. Systematic analysis of genes required for synapse structure and function. Nature. 436 (7050), 510-517 (2005).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), (2001).
- Hodgkin, J. Karyotype, ploidy, and gene dosage. WormBook. , 1-9 (2005).
- Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436 (7050), 593-597 (2005).
- Lackner, M. R., Nurrish, S. J., Kaplan, J. M. Facilitation of synaptic transmission by EGL-30 Gqalpha and EGL-8 PLCbeta: DAG binding to UNC-13 is required to stimulate acetylcholine release. Neuron. 24 (2), 335-346 (1999).
- Bastiani, C. A., Gharib, S., Simon, M. I., Sternberg, P. W. Caenorhabditis elegans Galphaq regulates egg-laying behavior via a PLCbeta-independent and serotonin-dependent signaling pathway and likely functions both in the nervous system and in muscle. Genetics. 165 (4), 1805-1822 (2003).
- Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. J. Neurosci. 21 (6), 2001-2014 (2001).
- Terami, H., et al. Genomic organization, expression, and analysis of the troponin C gene pat-10 of Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 146 (1), 193-202 (1999).
- Novelli, J., Page, A. P., Hodgkin, J. The C terminus of collagen SQT-3 has complex and essential functions in nematode collagen assembly. Genetics. 172 (4), 2253-2267 (2006).
- Brundage, L., et al. Mutations in a C. elegans Gqalpha gene disrupt movement, egg laying, and viability. Neuron. 16 (5), 999-1009 (1996).
- Gönczy, P., et al. Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature. 408 (6810), 331-336 (2000).
- Miller, D. M., et al. elegans unc-4 gene encodes a homeodomain protein that determines the pattern of synaptic input to specific motor neurons. Nature. 355, 841-845 (1992).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. Mutations in the Caenorhabditis elegans unc-4 gene alter the synaptic input to ventral cord motor neurons. Nature. 355, 838-841 (1992).
- Johnson, N. M., Behm, C. A., Trowell, S. C. Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome. Gene. 359, 26-34 (2005).
- Wani, K. A., et al. D1 dopamine receptor signaling is modulated by the R7 RGS protein EAT-16 and the R7 binding protein RSBP-1 in Caenoerhabditis elegans motor neurons. PLoS One. 7 (5), e37831 (2012).
- Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi screening to identify postembryonic phenotypes in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3442 (2012).
