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Biology

Em larga escala Knockdown Gene em Published: September 25, 2013 doi: 10.3791/50693
Automatic Translation
1, 2, 3
1Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts, Amherst, 2Neuroscience and Behavior Program, University of Massachusetts, Amherst, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Massachusetts, Amherst

Summary

Enquanto dsRNA alimentação em C. elegans é uma ferramenta poderosa para avaliar a função do gene, os protocolos atuais para telas de alimentação em grande escala resultar em eficiências knockdown variáveis. Descreve-se um protocolo melhorado para a realização em grande escala de RNAi telas de alimentação, que resulta em knockdown altamente eficaz e reprodutível de expressão do gene.

Abstract

RNA de interferência, alimentando vermes bactérias expressando dsRNAs tem sido uma ferramenta útil para avaliar a função do gene em C. elegans. Embora esta estratégia funciona bem quando um pequeno número de genes são direcionados para knockdown, telas de alimentação de grande porte mostram eficiência knockdown variáveis, o que limita sua utilidade. Temos Desconstruído protocolos knockdown RNAi publicados anteriormente e descobriram que a fonte primária do knockdown reduzida pode ser atribuída à perda de plasmídeos que codificam dsRNA das bactérias alimentadas aos animais. Com base nessas observações, temos desenvolvido um protocolo de alimentação dsRNA que reduz muito ou elimina a perda de plasmídeo para alcançar eficiente e de alta taxa de transferência knockdown. Demonstramos que este protocolo irá produzir robusto, batida reprodutível para baixo de C. elegans genes em vários tipos de tecidos, inclusive neurônios, e permitirá knockdown eficiente em telas de grande porte. Esse protocolo utiliza uma alimentação de dsRNA disponível comercialmentebiblioteca e descreve todos os passos necessários para duplicar a biblioteca e executar telas dsRNA. O protocolo não requer a utilização de equipamentos sofisticados, e, portanto, pode ser realizada por qualquer C. elegans laboratório.

Introduction

Historicamente, telas genéticas em C. elegans foram realizados pelo tratamento dos animais com um agente mutagénico químico tal como metanossulfonato de etilo para criar mutações aleatórias no DNA. Descendência ou seus netos de animais mutagenizadas são então isolados que exibem um fenótipo anormal desejado. A mutação responsável por causar o fenótipo é, então, identificado através de um procedimento de mapeamento de trabalho intensivo ou por sequenciar todo o genoma do verme mutante. Há muitas vantagens para a realização de tais telas mutagênese química como eles criam lesões permanentes dentro do genoma verme que pode resultar em ambos os fenótipos ganho de função e perda de função, mas o procedimento de mapeamento é lento e caro.

Interferência de RNA de cadeia dupla (dsRNAi) fornece um meio alternativo para identificar genes envolvidos em processos biológicos importantes. Neste método, o dsRNA correspondentes da sequência de codificação de um gene endógeno é introduzido no verme.O dsRNA é processado in vivo para gerar pequenas (21-22 nucleotídeos) RNAs que servem como guias para encontrar e ligar os mRNAs endógenos correspondentes, orientando-as para a destruição 1. Este procedimento é relativamente rápido, mas porque o dsRNA tem como alvo ARNm, em vez de ADN, apenas fenótipos redução de função são observadas utilizando esta abordagem.

Introdução de dsRNAs em um animal pode ser conseguida por injecção directa de dsRNA 2, por imersão em animais dsRNA 3, ou por alimentação de animais, bactérias que expressam ARNcd 4. Cada um destes métodos de entrega de provocar efeitos sistémicos knockdown como a maioria das células do animal expressar SID-1, um canal transmembranar capaz de importar dsRNA 5. Originalmente utilizada como uma abordagem genética reversa para knockdown a expressão de genes individuais, uma de cada vez, o desenvolvimento de duas bibliotecas de alimentação permite agora telas genéticos em grande escala. As bibliotecas de dsRNA comercialmente disponíveis contêm baclones cterial representando ou 55% ou 87% de todo o C. elegans genes 6, 7.

Infelizmente, em grande escala telas alimentação dsRNAi muitas vezes resultam em eficiência knockdown variáveis ​​8-10. Enquanto o nível absoluto de knockdown por RNAi não é facilmente medido, a eficiência knockdown reduzido observado em telas de grande porte deve ser causada por mRNAs específicos de genes residuais que escapam da degradação por RNAi. Este, por sua vez, pode ser um resultado direto da perda de dsRNA plasmídeo a partir de bactérias alimentadas aos animais nessas telas. Apoiar essa idéia, os animais alimentados com misturas de bactérias, em que apenas 50% das bactérias expressar dsRNAs contra um gene alvo, mostram dramaticamente reduzida (se houver) efeitos knockdown quando comparado ao grupo controle alimentado 11. A extensão do knockdown do gene torna-se uma preocupação crítica ao realizar telas dsRNAi como a maioria dos genes em C. elegans são haplosufficient e, assim, a expressão de genes deve ser reduzido em pelo menos 50% to causar de perda de função fenótipos 12.

Usamos protocolos de alimentação publicados anteriormente para executar telas em grande escala e encontrou os mesmos efeitos knockdown variáveis ​​relatados por outros 8-10. Em uma pesquisa de possíveis causas, descobrimos que quase 60% das bactérias alimentação de animais na tela tinha perdido o plasmídeo dsRNA. Nós desenvolvemos um protocolo de duplicação e triagem de biblioteca que reduz drasticamente ou elimina a perda de plasmídeo e melhora a eficiência knockdown. Este protocolo é adequado para a realização de telas de grande escala em C. elegans e pode ser utilizado para rastrear qualquer uma das bibliotecas de dsRNA disponíveis comercialmente. Usando este protocolo, descobrimos que essencialmente 100% das bactérias administradas aos animais durante o ecrã reter o dsRNA plasmídeo e causar perda robusto e altamente penetrante de fenótipos funcionais em todos os tecidos examinados.

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Protocol

Nota: Este protocolo pode ser utilizado para identificar os genes necessários para uma variedade de processos biológicos, em uma variedade de tipos de tecidos. Como um controlo de qualidade necessários durante a tela, os animais são alimentados tanto positivas como negativas bactérias expressando dsRNA de controlo para demonstrar os efeitos de RNAi no tecido alvo.

Outros protocolos de alimentação publicados crescer as bactérias que expressam ARNcd na presença de qualquer um de 50 ug / ml de ampicilina ou 25 ug / ml de carbenicilina 8-10. Descobrimos que as bactérias cultivadas em qualquer uma dessas condições perder o plasmídeo dsRNA em alta freqüência. Com efeito, verificou-se que, mesmo quando as bactérias são cultivadas durante a noite em concentrações muito elevadas (até 2 mg / ml) de ampicilina mais do que 50% das bactérias não contêm plasmídeo. Embora o crescimento de carbenicilina geralmente resultou em maior retenção do plasmídeo, 25 ug / ml não foi suficiente para prevenir a perda de plasmídeo. Em vez disso, descobrimos que concentra carbenicilinações de 500 ug / ml, e foram obrigados a bloquear a perda de plasmideo durante o crescimento em culturas líquidas e 2 mg / ml de carbenicilina foi necessária para bloquear a perda do plasmídeo, quando as bactérias foram cultivadas em substratos de agar sólido.

Devido a retenção de plasmídeo é crítico para o sucesso de knockdown, apenas carbenicilina é utilizado quando as bactérias são cultivadas dsRNA neste protocolo. Temos cuidadosamente optimizadas, a concentração de carbenicilina utilizado nas culturas de crescimento de bactérias descritas neste protocolo para assegurar que as bactérias que não contêm o plasmídeo não crescem nestas culturas. No entanto, como uma medida de controlo de qualidade, a perda do plasmídeo é determinada em vários passos do protocolo. Para garantir knockdown eficiente, mais do que 80% das bactérias em cada uma dessas etapas pode conter dsRNA plasmídeo. Se mais do que 20% das bactérias em qualquer etapa do protocolo ter perdido o plasmídeo de dsRNA, verificar a qualidade da carbenicilina utilizado. Carbenicilina deve ser preparado no dia em que é usado. Preparar carbenicilina fresco e repetir a cultura.

1. Como determinar a perda do plasmídeo

  1. Retirar uma pequena amostra de bactérias (conforme descrito em cada passo relevante) e adicioná-lo aos 450 ul de água estéril.
  2. Use 100 ml desta amostra diluída para criar ainda mais 1:10, 1:100, 1:1000 e diluições utilizando água estéril, misturando as soluções completamente entre diluição.
  3. Espalhar 100 ul de cada diluição em placas de LB e LB AMP e incubar estas placas durante a noite a 37 ° C.
  4. No dia seguinte, a placa de identificação de LB que contém entre 100 e 500 colónias bacterianas. Contar o número de colónias sobre esta placa e na placa de LB AMP correspondente (contendo a mesma diluição de bactérias).
  5. Determinar a perda de plasmídeo a partir destas contagens de colónias. A percentagem de bactérias que não contêm o plasmídeo é calculada utilizando a equação 1, e deve ser inferior a 15% por eficaz dsRNA knock down.

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2. Fazendo placas Duplicate Biblioteca

Resumo: A biblioteca dsRNA chegará do fabricante (OpenBiosystems) como 10.566 clones bacterianas em placas de 96 poços. Armazene as placas imediatamente em freezer -80 ° C. As placas da biblioteca de origem será duplicado e todas as telas de alimentação vai utilizar as placas duplicadas biblioteca como fonte de bactérias. É aconselhável guardar o original e duplicado placas de biblioteca em freezers separados. Para se recomenda a facilidade de manuseamento, a duplicação de apenas 10 placas da biblioteca por dia.

  1. Remova a placa de biblioteca (s) de -80 ° C congelador e retire o selo de alumínio, enquanto culturas ainda estão congelados. Recoloque a tampa de plástico da placa da biblioteca e colocou o prato sobre uma superfície plana para descongelar à temperatura ambiente (não mais do que 30 min).

Nota: Temos notado que um p significativoercentagem de bactérias encontradas em cada poço das placas de bibliotecas originais não contêm plasmídeo. No entanto, porque as bactérias são uma biblioteca recurso precioso, não é recomendado para testar a perda de plasmideo nas culturas de bibliotecas originais.

  1. Usando uma pipeta de canais múltiplos, adicionar 150 ul de meio duplicação biblioteca para cada poço de uma placa de 96 poços de fundo plano placa duplicada vazio.
  2. Misturar as culturas bacterianas biblioteca descongeladas por pipetagem para cima e para baixo 4-5 vezes utilizando uma pipeta multicanal definido para 100 ul. Em seguida, retire 10 ml de cada cultura mista e transferir para os poços correspondentes da placa duplicada. Continue a transferir culturas de placa biblioteca para duplicar placa certificando-se de mudar as pontas de pipeta para cada transferência.
  3. Depois de todas as culturas a partir de uma chapa de biblioteca foram transferidos, cobrir os poços da placa de biblioteca original com nova folha adesiva usando um rolo brayer para garantir uma vedação completa. Colocar a tampa de plástico na placa ecolocá-la na posição vertical num congelador a -80 ° C até as culturas foram novamente congelado (pelo menos 30 minutos). Em seguida, mova as placas biblioteca original de volta em uma caixa de armazenamento de biblioteca.
  4. Agitar duplicados culturas em placas de biblioteca planas para 8-10 horas a 37 ° C (450 rpm num microshaker, órbita 3 mm).
  5. Determinar a perda de plasmídeo em cada placa biblioteca duplicado. Nós descobrimos que uma proporção elevada das bactérias em cada poço da placa de biblioteca original não continha dsRNA plasmídeo. É importante que estas bactérias, não contribuem para o crescimento da biblioteca duplicado. Para prevenir o seu crescimento, uma alta concentração de carbenicilina é usado nos meios biblioteca duplicação (3 mg / ml). Depois de uma cultura de placa de duplicação usando estas condições descobriu-se que mais de 90% das bactérias contêm dsRNA plasmídeo. Retirar 10 mL da amostra a partir de uma cultura bem representativa de cada uma das placas em duplicado e adicioná-lo aos 450 ul de água estéril. Utilizando estas amostras diluídas, determinar a perda de plasmídeo em cada biblioteca duplicadoplaca de acordo com os passos 1,1-1,4. Se for observada perda plasmídeo significativa (> 20% das bactérias na biblioteca duplicata não contêm plasmídeo), refazer o meio de cultura fresco carbenicilina e repita protocolo do passo 2.1.
  6. Após a incubação, colocar uma nova folha adesiva folha diretamente sobre os poços da placa de duplicados, e coloque as tampas de placa sobre este papel alumínio. Colocar as placas de biblioteca duplicados na posição vertical em um congelador a -80 ° C (pelo menos 30 minutos) até congelada. Uma vez congeladas, as placas mover-se para a caixa de armazenamento de biblioteca duplicado para armazenamento a longo prazo.

3. Fazer cópias temporárias da Biblioteca em Omniplates

Resumo: Para começar a preparar comida para uma tela de dsRNA, bactérias de placas biblioteca duplicados são transferidos para omniplates ágar sólidos e cresceu durante a noite. Para evitar a perda de plasmídeo em meios sólidos, omniplates contêm carbenicilina a 2 mg / ml. As bactérias nessas placas pode ser usado por um períodode uma semana, e não apresentam qualquer perda de plasmídeo. Não foram testadas quanto à perda do plasmídeo em bactérias cultivadas em omniplates superiores a uma semana.

  1. Remova a placa de biblioteca duplicado (s) de -80 ° C congelador e retire o selo de alumínio, enquanto as culturas ainda estão congelados. Depois de retirar o papel alumínio, substituir tampa de plástico da placa e colocou o prato biblioteca duplicado em uma superfície nivelada para descongelar à temperatura ambiente (não mais do que 30 min).
  2. Esterilizar o Boekel 96 pin replicador. Os pinos de um replicador de limpeza deve ser lavado com água destilada e em seguida esterilizado antes de cada utilização. Para esterilizar o replicador, coloque-o em um banho de etanol (3/4 no fundo de um pirex) e, em seguida, queimar o etanol revestindo os pinos fora de usar um bico de Bunsen. Permitir que o chama para extinguir e repita.
  3. Coloque o replicador esterilizados nas cavidades da placa duplicada descongeladas e usá-lo para agitar suavemente as culturas. Pequenos volumes de cultura irá aderir aos pinos do replicador.
    4. <li> Retire cuidadosamente o replicador dos poços da placa de duplicata e colocá-lo (pinos para baixo) suavemente na superfície do omniplate, tomando cuidado para não perfurar a superfície do ágar. Deixar o replicador na superfície do omniplate para 3-4 segundos de modo a que as bactérias a partir dos pinos do replicador são transferidas para a superfície do agar.
  4. Remover o replicador e permitir que o volume pequeno (2-3 ul) da cultura bacteriana de absorver no ágar. Incubar as omniplates invertidos para 15-18 hr a 37 ° C. Estes omniplates pode ser usado na manhã seguinte para inocular 96 culturas bem líquidos. Alternativamente, omniplates contendo colónias bacterianas durante a noite pode ser armazenado até sete dias a 4 ° C.
  5. Para de transferência de réplica placas duplicadas adicionais, lavar as pontas replicador com água estéril e repita o processo de esterilização, colocando o replicador em etanol e flamejante duas vezes, como antes. Uma vez esterilizados, o replicador pode ser utilizado na próxima placa duplicada.

4. Preparação de bactérias para alimentação Worms

OÍNTESE: Bacteria para vermes alimentação são preparados como 1 ml culturas líquidas (em um formato de 96 poços) usando bactérias das omniplates. Estas culturas líquidas são cultivadas durante a noite para gerar culturas bacterianas nonlogarithmic saturadas. Crescimento durante a noite garante que todas as culturas irão conter concentrações semelhantes de bactérias e, por conseguinte, todos os vermes serão alimentados com a mesma quantidade de alimento. Sem perda de plasmídeo durante este crescimento deve ser observada.

  1. Repartir 1 ml de meio de crescimento bacteriano em cada poço de 2 ml de poços profundos de placas de 96 poços usando uma pipeta de repetição e 50 ml Combitip.
  2. Coloque replicador estéril sobre a superfície do omniplates contendo colônias de bactérias geradas nas etapas 3,1-3,6 assegurando que os pinos estão em contato com cada um dos 96 colônias bacterianas.
  3. Mover cuidadosamente o replicador da superfície do omniplate na placa de poço profundo assegurando que os pinos não raspar as partes laterais dos poços profundos até imersos em meio de crescimento. Mova oreplicador lentamente num movimento quadrado seguinte a parede interior da placa de poços profundos para desalojar as bactérias para o interior do meio de crescimento. Tenha cuidado para não espirrar e cross contaminar poços.
  4. Os poços de controlo: Para cada placa de cultura de 96 poços profundos bem adicionar um ARNcd que expressam bactérias a uma cavidade que irá actuar como um controlo positivo para o fenótipo esperado knockdown e adicionar as bactérias que contêm o vector vazio dsRNA (pL4440) como um controlo negativo para o outro bem . Nós re-sequência de controlo de bactérias, uma vez por semana em placas de LB contendo tetraciclina (15 ug / ml) e carbenicilina (2 mg / ml), de modo que as bactérias permanecem frescos e reter o plasmídeo que expressa ARNcd.
  5. Utilizando uma ansa de inoculação estéril remover uma única colónia bem isolado a partir da placa de controle (aproximadamente a mesma quantidade de bactérias transferidas pelo replicador) e inocular um poço vazio na placa de cultura de fundo. O registo da posição do bem que tenha sido inoculada. Alternativamente, o laço com bactérias cum ser transferida para um tubo de Eppendorf contendo 250 uL meios de crescimento, centrifugadas e em seguida usada para inocular vários poços.
  6. Agitar as placas de profundidade bem numa posição plana a 650 rpm em microshaker (órbita de 3 mm) a 37 ° C durante a noite. As culturas serão saturado pela manhã seguinte. Independentemente disso, a concentração de carbenicilina utilizados nestas culturas deve evitar a perda de plasmídeo.
  7. Determinar a perda de plasmídeo em um culturas ml durante a noite. As culturas irão ser utilizados directamente para alimentar vermes para a tela. É importante que mais de 80% das bactérias em cada cultura conter dsRNA plasmídeo. Determinar a perda de plasmídeo para duas culturas representativas de acordo com os passos 1,1-1,4. Expectativa: Mais de 90% das bactérias em cada cultura conterá dsRNA plasmídeo. Nós nunca observaram perda plasmídeo significativo nestas culturas durante a noite, mesmo quando cultivadas a saturação. No entanto, se for observada perda plasmídeo significativa (> 20%), refazer os meios de crescimento usando carbenicilina fresco e repcomer protocolo a partir do passo 4.1. As culturas podem ser reiniciado a partir dos omniplates originais desde que os omniplates estão a menos de 1-2 semanas de idade.
  8. Uma vez utilizado para iniciar culturas de 1 ml, os omniplates são armazenadas a 4 ° C até que a tela é completada e pode ser usado como uma fonte de alimento para iniciar quaisquer culturas reteste.
  9. Após incubação durante a noite de culturas, utilizar uma pipeta multicanal de 12 canais para remover 150 mL de cultura bacteriana a partir da placa de fundo e assim ejectar sobre a superfície da placa de alimentação. É importante não para perfurar a superfície do agar durante a transferência como vermes vão toca e não se alimentam de bactérias expressando dsRNA. A transferência pode ser feita de quatro poços de cada vez (Figura 1). Para fazer isso, coloque as pontas de pipeta em cada terceiro canal da pipeta multicanal (como há apenas 4 poços por linha na placa de alimentação). Após cada conjunto de 4 poços é transferido, mudar para novos, pontas para pipetas esterilizadas. Cada placa de 96 poço profundo cultura exigirá 96 dicaspara a transferência de oito placas de 12 poços de alimentação.
  10. Loja placas semeadas na posição vertical na noite escura para que as bactérias podem absorver no agar.

5. Gerando L1 Preso C. elegans Larvas

Resumo: larvas L1-presos são usados ​​para iniciar culturas vermes sincronizados nas placas de alimentação de dsRNA. Estas larvas são gerados pelo branqueamento populações de adultos grávidos isolar ovos saudáveis ​​e, em seguida, permitindo que os ovos para chocar em meio S-completa sem alimentos. Na falta de alimentação das larvas L1 eclodidos irá prender o desenvolvimento, a geração de uma população de larvas L1 síncrono. Durante a tela, prepare larvas prendeu-L1 fresco toda semana como estes animais esfomeados ficam doentes ao longo do tempo e deve ser descartado. A escolha da base genética dos animais utilizados em uma tensão de alimentação dsRNA pode variar dependendo da aplicação, para telas neuronais eri-1; mutantes lin-15B são recomendados.

  1. Escolha 10-20 L4 larvae seis pratos separados NGM contendo um gramado de OP50 bactérias e esperar 6-7 dias até que as placas contém muitos ovos recém-colocadas e adultos grávidas.
  2. Retirar os animais e ovos das placas por adição de 3 ml de água para a superfície de cada chapa e usar um dedo de luva para desalojar os ovos, bactérias e animais a partir da superfície de cada placa para a água. Certifique-se de cobrir todas as áreas da placa, com especial atenção para o gramado bacteriana. Remover a água, bactérias, vermes e ovos de cada placa utilizando uma pipeta de vidro e transferir para um tubo de 50 ml estéril cónica.
  3. Adicionar mais 3 ml de água para a superfície de cada placa, pipetando para cima e para baixo ao longo da superfície para remover todas as restantes bactérias, vermes e ovos. Adicionar este volume para o tubo cônico de 50 ml.
  4. Girar o tubo cónico a 1.500 rpm durante 1 minuto numa centrífuga de topo de mesa. Vermes e ovos devem sedimentar para o fundo do tubo e as bactérias devem permanecer suspensas. Aspirar cuidadosamente todos, mas 4 mlde o líquido a partir do tubo tendo a certeza de evitar os vermes peletizadas e ovos.
  5. Ressuspender o sedimento de vírus em água residual e transferir para um tubo de 15 ml estéril, cónico com uma pipeta de vidro. Levar o volume até 10 ml com água estéril.
  6. Gire a 1.500 rpm por 1 min como antes. Aspirar o sobrenadante deixando 200 mL de água, de modo a não perturbar o sedimento verme / ovo.
  7. Adicionar 10 ml de água para o cônico para lavar os vermes e ovos e girar como antes para remover bactérias adicionais.

Nota: Nos pontos 5,8-5,11 vermes e ovos são expostos a uma solução de água sanitária. Bleach vai destruir vermes e deixar os ovos relativamente ileso. No entanto, se os ovos são deixados na solução de lixívia muito tempo, eles irão também ser destruído. Definir um temporizador quando alvejante é adicionado no passo 5.8 para ter certeza de que os ovos não permanecem expostos a água sanitária por mais de 10 min.

  1. Remova todos, mas 200 mL do sobrenadante, novamente evitando a pelota, em seguida, adicione 10ml de solução de água sanitária e iniciar um temporizador.
  2. Incubar vermes e ovos em solução de água sanitária por 3-4 min, ocasionalmente mistura por inversão. Em seguida girar a 1.500 rpm durante 45 segundos em uma centrífuga de mesa. Olhar para um sedimento no fundo do tubo, que deve ser menor e mais compacta do que a pastilha original e pode assumir uma aparência amarela.
  3. Aspirar a solução de lixívia deixando 200 ul trás de modo a não perturbar o sedimento.
  4. Adicione mais solução de água sanitária fresco 10 ml e inverter como antes. Quando o cronômetro lê 10 min, girar novamente e aspirar a solução de água sanitária, deixando 200 mL para trás e rapidamente adicionar 10 ml de água estéril. Examinar a solução sob um microscópio de dissecação. As larvas e muitos dos adultos que se dissolveram na solução de lixívia, deixando para trás na maior parte dos ovos.
  5. Girar antes como durante 45 segundos, e de novo aspirar o sobrenadante, de modo a não perturbar o sedimento. Este pellet deve conter principalmente ovos e vai ser muito solto.
  6. Adicionar anotela 10 ml de água, inverter para misturar, rotação e aspirado deixando um pouco de água para trás. É importante remover a solução de lixívia, tanto quanto possível.
  7. Adicionar 4 ml de S-completas de comunicação para o tubo cónico, ressuspender os ovos e transferir para um balão de Erlenmeyer de 100 ml estéril. Colocar o balão numa incubadora a 20 ° C em um conjunto de agitador de movimento rápido o suficiente para fazer com que o conteúdo do balão a rodar. Isto irá proporcionar arejamento suficiente para suportar as larvas L1 quando chocam. Dentro de 15 horas todos os ovos devem ter eclodido produzindo uma população sincronizada de larvas L1 preso.

Larvas L1 Preso deve ser feita a cada semana durante uma tela. Uma vez que o primeiro lote tenha sido feito, os lotes subsequentes pode ser iniciado por adição de 500 larvas preso L1 (a partir do lote da semana anterior) para cada um dos quatro padrões, semeadas placas de 6 cm (contendo 100 ul de cultura durante a noite de OP50), e incubou-se a 20 ° C durante 4 dias. No quarto dia, as placas devem contermuitos ovos e adultos grávidas e pode ser branqueada para preparar ovos frescos para as larvas L1 mais sincronizados.

6. Transferindo Preso L1 larvas em placas de alimentação

Resumo: Para executar uma tela de dsRNA, 20-30 larvas L1 presos são transferidos para placas de alimentação de dsRNA. Efeitos precoces knockdown como parada larval ou letalidade será observado após animais alimentados com bactérias dsRNA expressando por 2-3 dias. Dependendo da tela conduzida, fenotipos desejados pode ser observada tanto nos animais originais colocadas sobre a placa de alimentação (animais P0) ou na sua descendência (animais F1). A apresentação do fenótipo irá depender de um número de variáveis, incluindo o perdurance da proteína codificada pelo gene cuja expressão é derrubado e o tempo durante o desenvolvimento, em que é exigido o gene de interesse. Começando culturas alimentares dsRNA com apenas 20-30 animais devem permitir a observação de ambos P0 e F1 fenótipos antes de umanimais produtores esgotar a fonte de alimento.

Para transferir facilmente 20-30 animais para placas de alimentação, primeiro determinar a concentração de L1 preso animais na cultura L1 preso.

  1. Misture o Erlenmeyer contendo as larvas L1 preso para distribuir os animais.
  2. Retire uma alíquota de 10 mL e local gota a gota para uma chapa unseeded NGM 6 cm de 4-5 cai no centro da placa certificando-se de que todas as mídias é expulso da pipeta.
  3. Usando a extremidade da ponta da pipeta espalhar os pontos de suspensão verme para formar uma única linha contínua de líquido que atravessa o diâmetro da placa.
  4. Usando um microscópio de dissecação, a contagem de todos os animais a partir de uma extremidade da linha de líquido e continuando para a outra extremidade antes de o líquido absorvido pela placa e os animais dispersar. Isto pode exigir a reorientação constante do escopo dissecar para ter certeza de que nenhum animal são perdidas.
  5. Repita isso por três separados 10 mlalíquotas e calcular a média dos três números para determinar o número médio de vermes por mL de suspensão verme e registrar este número diretamente no Erlenmeyer.

7. Comece a tela Feeding

Resumo: Para iniciar a tela de dsRNA, 20-30 larvas L1 presa são adicionados a cada poço de placas de 12 poços de alimentação contendo uma relva fina de bactérias que expressam ARNcd. Placas de alimentação conter padrão meios de crescimento de nemátodos (NGM) e suplementadas com 500 ug / ml de carbenicilina (para evitar a perda de plasmídeo) e IPTG 1 mM (para induzir a expressão do dsRNA). Os animais são deixados a desenvolver e alimentar durante vários dias a 20 ° C. Dois regimes típicos de alimentação para os animais são três dias ao executar uma tela P0 e 6-7 dias ao executar uma tela F1. A duração da alimentação, no entanto, podem ser variadas, dependendo das características fenotípicas específicas pretendidas no ecrã.

  1. Use a suspensão de larvas L1 preso e água estéril para preparar um modolução contendo 2.000 worms / ml. Cada placa de alimentação 12, bem exigirá 120 ul desta suspensão de vírus. Misturar cuidadosamente para garantir uma distribuição uniforme dos animais e transferir os animais para um reservatório esterilizado por pipetagem.
  2. Utilizando a pipeta multicanal configurado com pontas em cada terceira posição (ver Figura 1) transferência de 10 mL da solução verme directamente sobre a camada de bactérias das placas de alimentação. Tome cuidado para não perfurar a superfície do ágar, como vermes vão enterrar-se no agar e não se alimentam de bactérias expressando dsRNA.
  3. Remix A solução verme no reservatório (delicadamente chapinha ele sobre) a cada duas fileiras de placas de alimentação, como worms resolver rapidamente. Continue dispensando a suspensão verme até que todas as placas de alimentação têm vermes. Examine alguns poços no início sob o escopo de dissecação para garantir que cada poço está ficando 20-30 worms.
  4. Armazene as placas verticais em uma caixa em um umidificado 20 ° C incubadora. No dia seguinte, após o worm suspensão foi absorvido pela placa, inverter as placas e retornar para o humidificador a 20 ° C. Animais nestas placas pode ser observado após 3 dias (para os fenótipos P0) e, novamente, após 6 dias (para os fenótipos F1).

Atenção: As bactérias que permanecem na placa de alimentação, após 7 dias de crescimento sem fim têm sido testados para a perda do plasmídeo e quase 100% retido no plasmídeo dsRNA.

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Representative Results

P0 fenótipos knockdown vão começar a aparecer depois de 2-3 dias de alimentação de animais expressando dsRNA bactérias. Alguns fenótipos precoces incluem prisão de larvas e letalidade e deve ser observado em 2-3% de todas as cavidades de alimentação. Estes mesmos fenótipos irá também ser observada em animais de geração F1. A presença de ovos de F1 que não para chocar é outro fenótipo F1 comum e, juntos, esses três fenótipos será observado em cerca de 10% de todos os poços em telas de F1.

Utilizou-se o protocolo descrito aqui para examinar os efeitos de knockdown de vários genes expressos numa variedade de tipos de tecido, tanto para P0 e fenótipos F1. Porque nós também queria testar os efeitos knockdown no tecido neuronal, usamos eri-1; mutantes lin-15B em nossas telas. Mutações no eri-1 e lin-15B, junto com mutações no rrf-3, foram identificados em telas para as mutações que causam maior sensibilidade para RNAi 8,13,14.

EGL-30, dpy-17, pat-10 e UNC-4. Dois destes genes, egl-30 e UNC-4, são expressas no sistema nervoso 15-17, um gene pat-10, é expresso no músculo da parede do corpo 18, e o quarto gene, dpy-17, é expresso em células hipodérmicas 19. Quando alimentado eri-1; lin-15B animais bactérias que continham o plasmídeo pL4440 vazio, mas não se pronunciou dsRNA, não observamos quaisquer defeitos morfológicos ou comportamentais (Figura 2a, Tabela 1).

egl-30, codifica o C. elegans ortólogo da proteína G subunidade Gaq. EGL-30 mutantes nulos prisão durante o desenvolvimento larval no início, mas alguns fugitivos nulos e hypomorphic perda de função EGL-30 mutantes crescer para se tornar a fase adulta e estão com defeito na locomoção e comportamentos que põem ovos 20. Quandoalimentamos fase L1 eri-1; bactérias larvas lin15B expressar EGL-30 dsRNA, descobrimos que as larvas cresceu para se tornar adultos que apresentavam defeitos claros na locomoção e comportamento de postura. Depois de três dias, 100% dos animais alimentados com dsRNA contra EGL-30 estavam paralisados ​​e incapazes de pôr ovos (Figuras 2B, Tabela 1). Não observamos o fenótipo prisão larval em nossos experimentos knockdown dsRNA que é observado em EGL-30 (ad810) animais nulos. Isto é provavelmente porque os animais L1 nós banhado em EGL-30 bactérias dsRNA já havia passado a exigência inicial de desenvolvimento para EGL-30. Isso destaca uma vantagem de telas de alimentação: fenótipos em estágio final pode ser observado para os genes que também desempenham um papel vital durante o desenvolvimento.

dpy-17 codifica uma proteína necessária para a formação de colagénio na cutícula C. elegans 19. DPY-17 mutantes nulos são mais curtos e mais gorda do que o tipo selvagem animals. Não foram observadas quaisquer defeitos morfológicos em animais alimentados dpy P0-17 dsRNA. No entanto, 98% dos animais F1 apresentaram o fenótipo dpy (Figura 2C, a Tabela 1). A falta de animais P0 curto e gordura indica que a função do gene dpy-17 é exigido no início dos estágios larvais de morfologia corporal. Enquanto dpy-17 não tem sido alvo de outras telas de alimentação, foi derrubado por injeção dsRNA 21. Interessantemente, apenas 30% da progenitura de dsRNA injectado os animais apresentaram o fenótipo dpy, sugerindo que o protocolo de alimentação aqui descrito é mais eficiente do que a abordagem mais injecção de trabalho intensivo, pelo menos para alguns genes.

pat-10 codifica corpo muscular parede troponina C, uma proteína que contém quatro motivos EF mão que se ligam de cálcio 18. Descobrimos que 100% dos eri-1; animais lin-15B alimentados pat-10 dsRNA ficou paralisado no prazo de 3 dias, e não colocaram nenhum ovo líder toA fenótipo letal (Figura 2D, Tabela 1).

unc-4 codifica uma proteína expressa em homeodomínio ventrais neurônios motores da medula e é necessário para a adequada escolha de entrada sináptica 22,23. Escolhemos unc-4 como um gene teste, pois provou ser resistente a dsRNA estratégias de alimentação anteriores 8,24. Mutantes UNC-4 apresentam um defeito no comportamento locomoção. Como resultado de defeitos na conectividade sináptica, unc-4 mutantes são incapazes de voltar 22,23. Em comparação com os animais do tipo selvagem que voltar livremente em um movimento sinusoidal quando cutucou na cabeça, unc-4 mutantes nulos não volta e, ao invés contratar seu midbody com força, causando uma flexão dorsal que muitas vezes se torna tão extrema que a cabeça ea cauda da toque animal, colocar o corpo numa posição enrolada. Descobrimos que 68% dos animais alimentados com unc-4 bactérias dsRNA expressando de nossa preparação biblioteca mostrou defeitos de backing. Esta é uma melhoria significativa na eficiência do knockdown quando comparada com o defeito de apoio 0% observada quando o RRF-3 animais são alimentados unc-4 ARNcd utilizando protocolos previamente publicados 8 (Tabela 1).

Figura 1
Figura 1. Fluxograma para a duplicação da biblioteca e ecrã grande escala. Cada 96 ou placa de 12 poços gerado durante o protocolo de rastreio é indicado, juntamente com o método utilizado para a transferência de bactérias, entre as placas. Os asteriscos indicam as etapas em que as bactérias devem ser testados para perda de plasmídeo. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2
Figura 2. dsRNA fenótipos knockdown de C. elegans genes expressos em vários tipos de tecidos. A) Os animais controle alimentado bactérias contendo pL4440 vazio vetor. Seta preta indica a posição de um animal adulto jovem. Seta branca indica a posição de um grupo de ovos postos. A fotografia mostra mover livremente animais como evidenciado por sua postura corporal normal. B) Os animais alimentados com dsRNA contra EGL-30. Note-se que todos os animais têm adotado uma aparência rígida típico de animais paralisados. . Observe também a completa ausência de ovos postos na placa C) Os animais alimentados com dsRNA contra dpy-17. Note-se que os animais adultos no campo (um marcado pela seta) são mais curtos e mais gorda do que o animal adulto mostrado no painel A. D) Os animais alimentados com dsRNA contra pat-10. Note-se que todos os animais são paralisados, mas pode ainda mover os músculos na cabeça para alimentar, como indicado pela compensação de bactérias perto da cabeça, marcado por uma seta. Bar escala de 1 mm.

dsRNA plasmídeo ou gene alvo de feeding A expressão tecidual do gene alvo Animais por cento com fenótipo de terminal
pL4440 (controle negativo) tipo selvagem para todos os comportamentos
EGL-30 sistema nervoso 100% Egl e Paralisado
dpy-17 hipoderme 98% dpy
pat-10 o músculo da parede do corpo 100% Paralisado
unc-4 sistema nervoso 68% Backing Defeito

Tabela 1. Fenótipo Terminal de animais alimentados com dsRNA contra genes expressos em vários C. elegans tecidos. n = 100 para todos os genes.

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Discussion

Nós descrevemos um protocolo que utiliza uma biblioteca de alimentação dsRNA comercialmente disponível para realizar telas de grande escala em C. elegans. Nós fornecemos todas as instruções para duplicar a biblioteca e para usá-lo de forma eficaz. Nós demonstramos que este método é capaz de identificar genes envolvidos em diferentes processos biológicos em diferentes tecidos do animal. Enquanto os fenótipos aqui descritos são facilmente observáveis ​​(Unc, Egl, e dpy), este protocolo pode ser adaptada para procurar genes necessários para quase qualquer processo biológico. Por exemplo, utilizamos esse protocolo para identificar genes necessários para a neurotransmissão no verme 25. Uma vez que os animais foram alimentados com as bactérias que expressam ARNcd (tipicamente 3 dias para as telas P0, 6-7 dias para as telas F1), que pode ser removido a partir da placa de alimentação e testado para qualquer fenótipo comportamental.

Perda de plasmídeo:

Descobrimos que as reduzidas eficiências knockdown observado durantetelas de dsRNA em grande escala poderia ser diretamente atribuído à perda de dsRNA plasmídeo da bactéria alimentados para os vermes. Perda de plasmídeo ocorre em culturas de crescimento bacteriano devido β-lactamase codificada no plasmídeo biblioteca dsRNA, actua para degradar tanto a ampicilina e carbenicilina, reduzindo a concentração destes antibióticos ao longo do tempo. Quando a concentração de antibiótico se torna suficientemente fraca, bactérias que não contêm o plasmídeo podem sobreviver e preencher a cultura. O uso de tais culturas bacterianas mistas em telas de dsRNA deve ser evitada, uma vez que mostram atividade knockdown reduzida e muitas vezes não causar de perda de função fenótipos 11. Surpreendentemente, descobriu-se que níveis elevados de perda de plasmídeo ocorrer mesmo em culturas bacterianas cultivadas em concentrações muito elevadas de ampicilina (até 2 mg / ml). Enquanto carbenicilina é mais resistente à degradação por β-lactamase, que ainda se necessária a utilização de concentrações de carbenicilina que foram 10-40 vezes mais elevada do que aquelesutilizado na anteriormente publicados telas alimentação dsRNA 8-10,26 para assegurar que todas as bactérias em cultura retido o plasmídeo dsRNA.

Porque a maior parte dos genes em C. elegans são haplosufficient, é extremamente importante que todas as bactérias alimentadas aos animais expressar dsRNA. Isso garante knockdown gene altamente eficiente e aumenta a probabilidade de se observar a perda de função fenótipos em telas de grande escala.

Os controlos positivos e negativos:

É crítico para incluir bactérias de controlo, tanto positivos e negativos em cada placa de alimentação ao realizar telas. O controlo negativo é particularmente importante se os testes de comportamento vai ser utilizado para identificar genes de interesse. Para um controle negativo usamos bactérias contendo o pL4440 vetor vazio. Para um controlo positivo, o melhor é utilizar bactérias que expressam ARNcd contra um gene que provoca o fenótipo desejado knockdown. No entanto, se nenhum desses genes são conhecidasn, um controlo positivo para knockdown deve ser utilizado, que causa um fenótipo facilmente observável. Quando a escolha de um tal gene, deverá ser dada prioridade aos genes que são expressos no tipo de tecido alvo no ecrã. Por exemplo, em telas de alimentação de dsRNA para fenótipos neuronais, um gene neuronal deve ser escolhido como um controlo positivo. Um efeito do knockdown observável nos animais alimentados com a bactéria de controlo positivo vai indicar que a interferência ARNcd está a trabalhar no tipo de tecido desejado.

É melhor se a pessoa atingir as placas de alimentação para os fenótipos é cego para a localização dos poços de controlo positivo. A máquina de raios X deve ser capaz de identificar facilmente o poço positivo em cada placa de 96 poços. Para os ensaios de comportamento é útil para marcar o bem negativo primeiro antes de digitalizar os poços restantes.

Rendimento:

Usando este protocolo, uma pessoa deve ser capaz de configurar e tela 16, placas de 12 poçospor dia. Para mover de forma eficiente através da biblioteca, geralmente testar cada poço da placa de cada biblioteca apenas uma vez durante uma tela. Quaisquer poços que marcou como positivo são registrados e são testados em triplicata. Exigimos que os poços positivos reteste em todos os três retestes. O plasmídeo é então purificado a partir de bactérias e a inserção é sequenciado para identificar positivamente o gene. Se mutantes nulos estão disponíveis para o gene, que irá pedir que eles e testar os animais nulos para o defeito comportamental identificado na tela.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por fundos dos Institutos Nacionais de Saúde MH097163. Algumas cepas foram fornecidos pelo CGC, que é financiado pelo Escritório de Investigação NIH Programas de Infra-estrutura (P40-OD010440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
96-well Falcon flat bottom plate Fisher Scientific 353072 sterile
adhesive foil USA Scientific 2923-0100
Nunc omniplate Fisher Scientific 267060
2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock USA Scientific 5678-0285 autoclavable
Lids for deep well plates USA Scientific 5665-6101
50 ml combitips USA Scientific 4796-5000 individually wrapped
Reservoir USA Scientific 2977-8500 autoclavable
12-well plates USA Scientific CC7682-7512 individually wrapped
dsRNA feeding library OpenBiosystems RCE1181 store -80 °C
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-5
Tetracycline Fisher Scientific BP912-100
Carbenicillin allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com
Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A Affymetrix 10906 for worm plates
Equipment
Brayer roller USA Scientific 9127-2940
B–kel 96-pin replicator Fisher Scientific 05-450-9 autoclavable
microshaker Thomas Scientific 1231A93 3 mm orbit
12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl) USA Scientific 7112-0510
12 channel multichannel pipet (30-300 μl) USA Scientific 7112-3300
Repeater Plus manual pipettor USA Scientific 4026-0201

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Biologia do Desenvolvimento edição 79 Caenorhabditis elegans (C. elegans) Técnicas de Gene Knockdown, A interferência dsRNA knockdown do gene tela de alimentação em grande escala
Em larga escala Knockdown Gene em<em&gt; C. elegans</em&gt; Usando bibliotecas de alimentação dsRNA para gerar fenótipos robustos perda de função
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