Method Article

Büyük ölçekli Gen demonte olarak C. elegans Sağlam Kayıp fonksiyon-fenotipleri oluşturmak için DsRNA Besleme Kitaplıklar kullanma

DOI:

10.3791/50693

⸱

September 25th, 2013

 ,  , 
1Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts, Amherst, 2Neuroscience and Behavior Program, University of Massachusetts, Amherst, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Massachusetts, Amherst

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DsRNA C. beslerken elegans büyük ölçekli besleme ekranlar için geçerli protokoller değişken devirme verimleri elde gen fonksiyonunu değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Bu gen ifadesinin oldukça etkili ve yeniden üretilebilir bir devirme ile sonuçlanan büyük ölçekli RNAi besleme ekranları yerine getirmek için geliştirilmiş bir protokol açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DsRNAlar ifade solucanlar bakterileri besleyerek RNA girişim C gen fonksiyonunu değerlendirmek için yararlı bir araç olmuştur elegans. Genlerin küçük bir sayıda demonte için hedeflenen bu stratejisi iyi çalışıyor olsa da, büyük ölçekli besleme ekranları kendi programını sınırlar, değişken knockdown verimliliğini gösterir. Daha önce yayınlanan RNAi yok etme protokolleri deconstructed ve indirgenmiş Nakavt birincil kaynağı hayvanlara beslenen bakterilerden dsRNA kodlayan plazmidlerin kaybına bağlı olabilir bulduk. Bu gözlemlere dayanarak, biz büyük ölçüde azaltır veya verimli, yüksek verim elde etmek için demonte plazmid kaybı ortadan kaldıran bir DsRNA besleme protokol geliştirdik. Biz bu protokol C. aşağı sağlam, tekrarlanabilir darbe üretecek olduğunu göstermek nöronlar elegans da dahil olmak üzere çok sayıda doku türleri içinde, genler, ve büyük ölçekli ekranlarında etkili demonte izin verecektir. Bu protokol, bir ticari olarak temin edilebilir besleme dsRNA kullanankütüphane ve kütüphane çoğaltmak ve DsRNA ekranları gerçekleştirmek için gereken tüm adımları açıklar. Protokol, bir karmaşık ekipman kullanımını gerektirmez ve bu nedenle herhangi bir C. tarafından yapılabilir laboratuvar elegans.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. Tarihsel olarak, genetik ekranlar elegans DNA içinde rasgele mutasyona oluşturmak için, örneğin etil metansülfonat gibi bir kimyasal mutajen ile hayvanların tedavi edilmesi ile gerçekleştirilmiştir. Mutagenize edilmiş hayvanların soyu veya grandprogeny sonra sergilediğini arzu edilen bir anormal bir fenotip izole edilir. Fenotipe neden sorumlu mutasyon daha sonra bir emek-yoğun bir eşleme prosedürü ile ya da mutant solucan tüm genom sekanslama ile tanımlanır. Orada, kazanım fonksiyon-of ve zarar fonksiyon-fenotipler neden olabilir solucan genomu içinde kalıcı lezyonlar oluşturmak gibi kimyasal mutagenez ekranlar performans için pek çok avantajı v....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: Bu protokol, doku tiplerinin çeşitli biyolojik süreçlerin çeşitli için gerekli olan genleri tanımlamak için kullanılabilir. Ekranın sırasında gerekli kalite kontrol olarak, hayvanlar hedef dokuda RNAi etkilerini göstermek için kontrol dsRNA eksprese eden bakteriler beslemeli hem pozitif hem de negatif.

Diğer besleme yayınlanmış protokoller 50 ug / ml ampisilin ve 25 ug / ml karbenisilin 8-10 ya da mevcudiyetinde dsRNA eksprese eden bakteriler büyür. Biz, bu durumlardan herhangi biri altında yetişen bakteri yüksek frekansta dsRNA plazmid kaybetmek bulduk. Gerçekten de, bakteriler, ampisilin, çok yüksek konsantrasyo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P0 knockdown fenotipleri DsRNA bakterileri ifade hayvanların beslenmesi 2-3 gün sonra görünmeye başlayacaktır. Bazı erken fenotipleri larva tutuklama ve öldürücülüğü içerir ve tüm beslenme kuyuların% 2-3 dikkat edilmelidir. Bu aynı fenotipleri de F1 üretimi hayvanlarda gözlenecektir. Yumurtadan başarısız F1 yumurta varlığı başka ortak F1 fenotip ve birlikte, bu üç fenotipleri F1 ekranlarında tüm kuyuların yaklaşık 10% olarak görülecektir.

Biz P0 ve F1 fenotipleri hem de doku tiplerinin çeşit.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz C. büyük ölçekli ekranlar gerçekleştirmek için piyasada mevcut DsRNA besleme kitaplığı kullanan bir protokol tanımlanmıştır elegans. Biz kütüphane çoğaltmak ve etkili bir şekilde kullanmak için tüm talimatları sağlar. Bu yaklaşım, hayvanın farklı dokularda farklı biyolojik proseslerde yer alan genleri tanımlamak mümkün olduğunu göstermektedir. Burada tarif fenotipleri (UNC, Egl ve dpy) kolayca gözlemlenebilir olsa da, bu protokol, hemen hemen herhangi bir biyolojik işlem için gerekli olan genlerin .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Sağlık MH097163 National Institutes fonları tarafından desteklenmiştir. Bazı suşlar Araştırma Altyapı Programları NIH Ofisi (P40-OD010440) tarafından finanse CGC tarafından sağlanmıştır.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent/Material
96-well Falcon düz tabanlı plaka Fisher Scientific353072steril
yapışkan folyoUSA Scientific2923-0100
Nunc omniplateFisher Scientific267060
2.0 ml derin 96 kuyulu polipropilen MasterblockUSA Scientific5678-0285Derin
kuyu plakaları içinUSA Scientific5665-6101
50 ml kombiuçlarUSA Scientific4796-5000ayrı ayrı sarılmış
RezervuarUSA Scientific2977-8500otoklavlanabilir
12 oyuklu plakalarUSA ScientificCC7682-7512ayrı ayrı sarılmış
dsRNA besleme kitaplığıAçık BiyosistemlerRCE1181mağaza -80 & C
AmpisilinFisher ScientificBP1760-5
TetrasiklinFisher ScientificBP912-100
Karbenikilinteslimat için 2-4 hafta izin verir www.biochemicaldirect.com
Bakteriyolojik Agar Ultra saf sınıf A Affymetrix10906sonsuz plakalar
Equipment
Brayer silindiriUSA Scientific9127-2940
B– kel 96 pinli çoğaltıcıFisher Scientific05-450-9otoklavlanabilir
mikro çalkalayıcıThomas Scientific1231A933 mm yörünge
12 kanallı çok kanallı pipet (0.5-10 μ l)USA Scientific7112-0510
12 kanallı çok kanallı pipet (30-300 μ l)USA Scientific7112-3300
Repeater Plus manuel pipetleyiciUSA Scientific4026-0201
otoklavlanabilir Kapaklar için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mello, C. C., Conte, D. Jr Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
  2. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  3. Tabar....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA InterferenceC elegansdsRNA FeedingPlasmid LossGene KnockdownHigh ThroughputWorm FeedingPhenotypic ScreeningBacterial LibraryTissue Specificity

Related Articles