Grootschalige Gene Knockdown in Published: September 25, 2013 doi: 10.3791/50693

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Kathryn N. Maher¹, Mary Catanese², Daniel L. Chase³

¹Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts, Amherst, ²Neuroscience and Behavior Program, University of Massachusetts, Amherst, ³Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Massachusetts, Amherst

Summary

Terwijl dsRNA voeden in C. elegans is een krachtig hulpmiddel om gen-functie, de huidige protocollen voor grootschalige voeden schermen resulteren in variabele knockdown efficiëntie te beoordelen. We beschrijven een verbeterde protocol voor het uitvoeren van grootschalige RNAi voeden schermen die resulteert in een hoogst doeltreffend en reproduceerbare neerhalen van genexpressie.

Abstract

RNA-interferentie door het voeren van wormen bacteriën uitdrukken dsRNAs is een nuttig instrument om gen-functie in C. beoordelen is geweest elegans. Hoewel deze strategie werkt goed wanneer een klein aantal genen zijn gericht op knockdown grootschalige voeden schermen tonen variabele knockdown efficiëntie, waardoor hun bruikbaarheid beperkt. We hebben eerder gepubliceerd RNAi knockdown protocollen ontleed en vonden dat de primaire bron van de verlaagde knockdown kan worden toegeschreven aan het verlies van dsRNA-coderende plasmiden van bacteriën aan de dieren gegeven. Op basis van deze bevindingen hebben we een dsRNA voeden protocol dat sterk vermindert of elimineert plasmide verlies efficiënte, hoge doorvoer knockdown bereiken ontwikkeld. We laten zien dat dit protocol robuust, reproduceerbaar klop zal produceren beneden van C. elegans genen in meerdere soorten weefsel, met inbegrip van neuronen, en zullen efficiënte knock-down in grootschalige schermen mogelijk te maken. Dit protocol maakt gebruik van een in de handel verkrijgbaar dsRNA voedingbibliotheek en beschrijft alle stappen die nodig zijn om de bibliotheek te dupliceren en uit te voeren dsRNA schermen. De protocol niet het gebruik van geavanceerde apparatuur vereisen en derhalve worden uitgevoerd door elke C. elegans lab.

Introduction

Historisch genetische schermen in C. elegans uitgevoerd door behandeling van dieren met een chemisch mutageen zoals ethylmethaansulfonaat van willekeurige mutaties in het DNA te maken. Nageslacht of grandprogeny van gemutageni dieren worden vervolgens geïsoleerd dat vertonen een gewenste abnormale fenotype. De mutatie die verantwoordelijk is voor het veroorzaken van het fenotype wordt vervolgens geïdentificeerd door middel van een arbeidsintensieve mapping procedure of door sequencing van het gehele genoom mutante worm. Er zijn vele voordelen aan het uitvoeren van dergelijke chemische mutagenese schermen die blijvende letsels binnen de worm genoom die kan leiden tot zowel gain-of-functie en verlies-van-functie fenotype te creëren, maar de mapping procedure is langzaam en duur.

Double-stranded RNA interference (dsRNAi) een alternatief middel om genen betrokken bij belangrijke biologische processen te identificeren. Bij deze werkwijze dsRNA overeenkomt met de coderende sequentie van een endogeen gen wordt ingebracht in de worm.Het dsRNA wordt verwerkt in vivo kleine (21-22 nucleotide) RNAs die dienen als leidraad kunnen vinden en binden de bijpassende endogene mRNA's te richten voor vernietiging ¹ genereren. Deze procedure is relatief snel, maar omdat dsRNA gericht mRNA plaats van DNA, zijn alleen reductie functieverlies fenotypen waargenomen met behulp van deze benadering.

Introductie van dsRNA in een dier kan worden verkregen door directe injectie van dsRNA ^2, door het weken dieren dsRNA ^3, of door het voeren van dieren bacteriën die dsRNA ⁴ drukken. Elk van deze verzendwijzen veroorzaken systemische knockdown effecten meeste cellen van het dier tot expressie SID-1, een transmembraan kanaal kan importeren dsRNA ^5. Oorspronkelijk gebruikt als reverse genetics benadering van de expressie van individuele genen een knockdown tegelijk de ontwikkeling van twee voeden bibliotheken maakt nu grootschalige genetische screens. De in de handel verkrijgbare dsRNA bibliotheken bevatten bacterial klonen die hetzij 55% of 87% van C. elegans genen ^{6, 7.}

Helaas, grootschalige dsRNAi voeden schermen vaak resulteren in variabele knockdown efficiëntie ^8-10. Hoewel het absolute niveau van knockdown door RNAi is niet gemakkelijk te meten, moet het lagere rendement knockdown waargenomen bij grootschalige schermen worden veroorzaakt door resterende gen-specifieke mRNA dat degradatie te ontsnappen door RNAi. Dit zou op zijn beurt een direct gevolg van dsRNA plasmide verlies van bacteriën toediening aan dieren in deze schermen. Ondersteuning van dit idee, dieren die mengsels van bacteriën, waarbij slechts 50% van de bacteriën tot expressie dsRNA tegen een gerichte gen vertonen drastisch verminderd (indien aanwezig) knockdown effecten vergeleken met gevoede dieren ¹¹ besturen. De mate van gen knockdown wordt een zorgpunt bij het ​​uitvoeren dsRNAi schermen zoals de meeste genen in C. elegans zijn haplosufficient en dus genexpressie worden verminderd met ten minste 50% to leiden tot verlies-van-functie fenotypen ^12.

We hebben eerder gepubliceerd voeding protocollen die worden gebruikt om grootschalige schermen voeren en vond dezelfde variabele knock-down effecten gemeld door anderen ^8-10. In een zoektocht naar mogelijke oorzaken, vonden we dat bijna 60% van de bacteriën gevoed aan dieren in het scherm de dsRNA plasmide verloren had. We hebben een bibliotheek duplicatie en screening protocol dat drastisch vermindert of elimineert plasmide verlies en sterk verbetert knockdown efficiëntie ontwikkeld. Dit protocol is geschikt voor het uitvoeren van grootschalige schermen C. elegans en kan worden gebruikt om ofwel een van de commercieel beschikbare dsRNA screenen. Met dit protocol, vinden we dat in wezen 100% van de bacteriën toediening aan dieren tijdens het scherm steeds de dsRNA-coderend plasmide en veroorzaken robuust en zeer penetrant functieverlies fenotypen in alle onderzochte weefsels.

Protocol

Opmerking: Dit protocol kan worden gebruikt om genen die voor een verscheidenheid van biologische processen in verschillende weefseltypen identificeren. Als noodzakelijke kwaliteitscontrole tijdens het scherm dieren gevoed zowel positieve als negatieve controle-dsRNA expressie bacteriën RNAi effecten in het doelweefsel tonen.

Andere gepubliceerde protocollen voeding groeien dsRNA-expressie bacteriën in de aanwezigheid van een 50 ug / ml ampicilline of 25 ug / ml carbenicilline ^8-10. Wij hebben gevonden dat bacteriën onder een van deze omstandigheden gekweekt verliezen dsRNA plasmide bij hoge frequentie. We hebben inderdaad gevonden dat zelfs wanneer bacteriën overnacht gekweekt in zeer hoge concentraties (tot 2 mg / ml) ampicilline meer dan 50% van de bacteriën plasmide meer bevatten. Terwijl groei carbenicilline algemeen resulteerde in hogere retentie van plasmide, 25 ug / ml was niet voldoende om plasmide te voorkomen. In plaats daarvan vonden we dat carbenicilline concentratiegen 500 ug / ml moesten plasmide verliezen blokkeren tijdens groei in vloeibare kweken en 2 mg / ml carbenicilline moest plasmide verliezen blokkeren wanneer bacteriën werden gekweekt op vaste agar substraten.

Omdat retentie plasmide is cruciaal voor het succes van knockdown wordt alleen gebruikt wanneer carbenicilline dsRNA bacteriën gekweekt in dit protocol. Wij hebben zorgvuldig geoptimaliseerde de concentratie carbenicilline in de bacteriegroei kweken beschreven in dit protocol opdat bacteriën die geen plasmide bevatten groeien niet in deze culturen. Echter, als een kwaliteitscontrole maatregel wordt plasmide verlies bepaald bij verschillende stappen van het protocol. Om efficiënte knockdown waarborgen, moet meer dan 80% van de bacteriën bij elk van deze stappen dsRNA plasmide. Als meer dan 20% van de bacteriën op een stap van het protocol de dsRNA plasmide hebben verloren, controleren de kwaliteit van de carbenicilline gebruikt. Carbenicilline moeten worden vers bereid op de dag het wordt gebruikt. Bereiden verse carbenicilline en herhaal de cultuur.

1. Hoe te Plasmid Loss bepalen

1. Verwijderen van een kleine steekproef van bacteriën (zoals beschreven bij elke belangrijke fase) toevoegen aan 450 pi steriel water.
2. Gebruik 100 ul van deze verdunde monster te creëren verdere 1:10, 1:100 en 1:1000 seriële verdunningen met steriele water, het mengen van de oplossingen grondig tussen verdunning.
3. Verdeel 100 pi van elke verdunning op LB LB AMP platen en incubeer deze platen overnacht bij 37 ° C.
4. De volgende dag, identificeren de LB plaat die bevat tussen 100 en 500 bacteriële kolonies. Tel het aantal kolonies op de plaat en op de bijbehorende LB AMP platen (die dezelfde verdunning van bacteriën).
5. Bepaal plasmide verlies van deze kolonie telt. Het percentage bacteriën die geen plasmide bevatten wordt berekend met vergelijking 1, en moet minder dan 15% effectief dsRNA down.

"Vergelijking 1" src = "/ files/ftp_upload/50693/50693eq1.jpg" />

2. Het maken van Duplicate Bibliotheek Plates

Overzicht: De dsRNA bibliotheek aankomen uit de fabrikant (OpenBiosystems) als 10.566 bacteriële klonen in platen met 96 putjes. Bewaar de platen direct in -80 ° C vriezer. De oorspronkelijke bibliotheek platen zullen worden gedupliceerd en al het voeden schermen zullen de dubbele bibliotheek platen gebruiken als de bron van bacteriën. Het is raadzaam om slaan de oorspronkelijke bibliotheek en dubbele platen in afzonderlijke diepvriezers. Voor het gemak van de behandeling, het dupliceren van slechts 10 bibliotheek platen per dag wordt aanbevolen.

1. Verwijder bibliotheek plaat (s) van -80 ° C vriezer en verwijder de folie afdichting terwijl culturen zijn nog steeds bevroren. Vervang plastic afdekking van de bibliotheek plaat en zet de plaat op een vlakke ondergrond te ontdooien op kamertemperatuur (niet langer dan 30 min).

Opmerking: We hebben gemerkt dat een significante percentage bacteriën in elk putje van de oorspronkelijke bibliotheek platen geen plasmide. Omdat de bibliotheek bacteriën een kostbaar wordt afgeraden testen plasmide verlies in de oorspronkelijke bibliotheek culturen.

2. Met behulp van een multichannel pipet, voeg 150 ul van bibliotheek duplicatie media aan elk putje van een lege 96-well vlakke bodem dubbele plaat.
3. Meng de ontdooide bibliotheek bacterieculturen door en neer te pipetteren 4:56 keer met een meerkanaalspipet op 100 pl. Verwijder vervolgens 10 pi van elke gemengde cultuur en over te dragen aan de overeenkomstige putjes van dubbele plaat. Blijven culturen te brengen van bibliotheek plaat te dupliceren plaat maken zeker pipet tips voor elke overdracht veranderen.
4. Na alle culturen uit een bibliotheek plaat zijn overgedragen, hebben betrekking op de putjes van de oorspronkelijke bibliotheek plaat met nieuwe plakfolie met een brayer roller om een ​​grondige afdichting te garanderen. Plaats de plastic deksel op de plaat enplaats hem rechtop in een -80 ° C vriezer totdat de kweken (minimaal 30 minuten) hebben ingevroren. Verplaats dan de oorspronkelijke bibliotheek platen terug in een bibliotheek opbergdoos.
5. Schud duplicaat bibliotheek plaat culturen vlak voor 8-10 uur bij 37 ° C (450 rpm op een microshaker, baan 3 mm).
6. Bepaal plasmide verlies in elke duplo bibliotheek plaat. We vonden dat een groot deel van de bacteriën in elk putje van de oorspronkelijke bibliotheek plaat dsRNA plasmide bevatte. Het is belangrijk dat deze bacteriën niet bijdragen aan de groei van de dubbele bibliotheek. Om hun groei te voorkomen, wordt een hoge concentratie carbenicilline in de bibliotheek duplicatie media (3 mg / ml). Na de cultuur van de duplicatie plaat met behulp van deze voorwaarden hebben we vastgesteld dat meer dan 90% van de bacteriën bevatten dsRNA plasmide. Verwijder 10 ul monster uit een representatieve cultuur goed van elke dubbele plaat toevoegen aan 450 pi steriel water. Met deze verdunde monsters bepalen plasmide verliezen in elke duplo bibliotheekplaat volgens stappen 1.1-1.4. Indien significante plasmide verlies wordt waargenomen (> 20% van de bacteriën in de dubbele bibliotheek niet plasmide bevatten), remake van de cultuur media met verse carbenicilline en herhaal protocol vanaf stap 2.1.
7. Na incubatie plaats een nieuwe folie zelfklevend vel direct over het duplicaat putjes, en plaats de plaat deksels op deze folie. Plaats de dubbele bibliotheek platen rechtop in een -80 ° C vriezer (minimaal 30 min) tot bevroren. Eenmaal bevroren, bewegen de platen aan de dubbele opslag bibliotheek doos voor opslag op lange termijn.

3. Het maken van tijdelijke kopieën van de bibliotheek op Omniplates

Overzicht: Om te beginnen om voedsel te bereiden voor een dsRNA scherm, bacteriën uit dubbele bibliotheek platen worden overgebracht naar vaste agar omniplates en overnacht gegroeid. Om plasmide verlies op vaste media te voorkomen, bevatten omniplates carbenicilline bij 2 mg / ml. De bacteriën op deze platen worden gedurende een periodevan een week, en tonen geen plasmide verlies. We hebben niet getest plasmide verliezen in bacteriën gekweekt op omniplates langer dan een week.

1. Verwijder dubbele bibliotheek plaat (s) van -80 ° C vriezer en verwijder de folie afdichting terwijl de culturen zijn nog steeds bevroren. Na het verwijderen van de folie, vervangt plastic hoes van de plaat en zet de dubbele bibliotheek plaat op een vlakke ondergrond te ontdooien op kamertemperatuur (niet langer dan 30 min).
2. Steriliseer de Boekel 96 pin replicator. De pennen van een schone replicator worden gespoeld met gedestilleerd water en gesteriliseerd voor elk gebruik. Om de replicator steriliseren, plaats deze in een ethanol bad (3/4 in diep in een Pyrex schotel) en vervolgens branden de ethanol het coaten van de pennen uit met een bunsenbrander. Laat de vlam te doven en herhaal.
3. Plaats de gesteriliseerde replicator in de putjes van de ontdooide dubbele plaat en gebruik deze om voorzichtig roer de culturen. Kleine volumes van de cultuur zal zich houden aan de pinnen van de replicator.
<li> Verwijder voorzichtig de replicator uit de bronnen van de dubbele plaat en plaats het (pinnen naar beneden) voorzichtig op het oppervlak van de omniplate, zorg dat u de agar oppervlak niet te doorboren. Laat de replicator op het oppervlak van de omniplate 3-4 seconden zodat bacteriën uit de pennen van de replicator overgebracht op het agar oppervlak.
4. Verwijder de replicator en laat het kleine volume (2-3 ul) bacteriekweek te absorberen in de agar. Incubeer de omniplates omgekeerde 15-18 uur bij 37 ° C. Deze omniplates kunnen de volgende ochtend worden gebruikt om 96 goed vloeibare culturen te enten. Alternatief kan omniplates die overnacht bacteriekolonies worden opgeslagen tot zeven dagen bij 4 ° C.
5. Om replica-overdracht extra dubbele platen, spoel de replicator tips met steriel water en herhaal het sterilisatieproces door het plaatsen van de replicator in ethanol en vlammende het twee keer, zoals voorheen. Eenmaal gesteriliseerd, kan de replicator worden gebruikt op de volgende dubbele plaat.

4. Voorbereiding van Bacteriën voor Feeding Worms

Overzicht: Bacteriën voor toevoeren wormen worden bereid met 1 ml vloeibare kweken (in een 96 putjes) met bacteriën uit de omniplates. Deze vloeibare culturen worden overnacht gegroeid tot verzadigde nonlogarithmic bacterieculturen genereren. Nacht kweken zodat alle culturen Vergelijkbare concentraties bacteriën bevatten en daarom alle wormen dezelfde hoeveelheid voedsel worden gevoed. Geen plasmide verlies tijdens deze groei moet worden nageleefd.

1. Breng 1 ml van bacteriële groeimedia in elk putje van 2 ml deep-well plaat met 96 putjes met een herhaling pipet en 50 ml Combitip.
2. Plaats steriele replicator op het oppervlak van omniplates die bacteriële kolonies generated in stappen 3.1-3.6 door te controleren of pennen in contact met elk van de 96 bacteriële kolonies.
3. Beweeg voorzichtig de replicator van het oppervlak van de omniplate in de diepe put plaat maken van bepaalde dat de pennen niet schraap de zijkanten van de diepe putten tot ondergedompeld in groeimedia. Verplaats dereplicator langzaam in een vierkant beweging na de binnenwand van de diepe putjesplaat de bacteriën los in het kweekmedium. Wees voorzichtig niet te spetteren en cross besmetten putten.
4. Controleputjes: Voor elke 96-well diepe put cultuur plaat voeg een dsRNA-uiting van bacteriën om een goed, dat zal fungeren als een positieve controle voor de verwachte knockdown fenotype en bacteriën met lege dsRNA vector (pL4440) toevoegen als een negatieve controle naar een ander goed . We opnieuw strook control dsRNA-expressie bacteriën eenmaal per week op LB-platen met tetracycline (15 ug / ml) en carbenicilline (2 mg / ml), zodat de bacteriën vers blijft en behouden plasmide.
5. Met behulp van een steriele entnaald verwijderen goed geïsoleerde een enkele kolonie van de controle plaat (ongeveer dezelfde hoeveelheid bacteriën overgedragen door de replicator) en te enten een lege goed in de diepe put cultuur plaat. Noteer de positie van de bron die is geïnoculeerd. Als alternatief, de lus met bacteriën ceen aan een Eppendorf buis met 250 ui groeimedia worden verplaatst, gewerveld en vervolgens gebruikt om verscheidene putjes inoculeren.
6. Schud de diepe putjes in een vlakke positie bij 650 rpm op microshaker (baan: 3 mm) bij 37 ° C gedurende de nacht. De culturen wordt verzadigd door de volgende ochtend. Ongeacht, moet de concentratie carbenicilline in deze kweken plasmide te voorkomen.
7. Determine plasmide verlies de1 ml overnachtcultures. De culturen zal rechtstreeks worden gebruikt om wormen te voeden voor het scherm. Belangrijk is dat meer dan 80% van de bacteriën in elke cultuur bevatten dsRNA plasmide. Bepaal plasmide verlies voor twee representatieve culturen volgens stappen 1.1-1.4. Verwachting: Meer dan 90% van de bacteriën in elke cultuur zal dsRNA plasmide bevatten. We hebben nog nooit significant plasmide verlies waargenomen in deze 's nachts culturen, zelfs wanneer ze groeien tot verzadiging. Echter, als significant plasmide verlies wordt waargenomen (> 20%), de remake groeimedia met verse carbenicilline en repeten protocol vanaf stap 4.1. Culturen kunnen worden gestart vanuit de originele omniplates zolang de omniplates minder dan 1-2 weken oud.
8. Eenmaal gewend aan 1 ml culturen starten, worden de omniplates bewaard bij 4 ° C totdat het voltooid is en kan worden gebruikt als een bron van voedsel aan een hertest culturen te starten.
9. Na overnacht incubatie van culturen gebruikt een 12-kanaals multichannel pipet 150 ul bacteriekweek uit de diepe well plaat en uitwerpen op het oppervlak van de toevoerplaat. Het is belangrijk het oppervlak van de agar niet doorboren tijdens de overdracht als wormen hol en niet voeden de dsRNA-expressie bacteriën. Overdracht kan vier putjes tegelijk (figuur 1). Om dit te doen, plaatst pipet tips op elke derde kanaal van de multichannel pipet (aangezien er slechts 4 putten per rij in de voeding plaat). Na elke set van 4 putten wordt overgedragen, te wijzigen om nieuwe, steriele pipet tips. Elke 96 deep-well cultuur plaat zal 96 tips nodigvoor overdracht naar acht 12-well platen voeden.
10. Store gezaaid borden rechtop in het donker 's nachts, zodat bacteriën kunnen absorberen in de agar.

5. Genererende L1 Gearresteerd C. elegans Larven

Overzicht: L1-larven gearresteerd worden gebruikt om gesynchroniseerd worm culturen op de dsRNA voeden platen beginnen. Deze larven worden gegenereerd door bleken populaties van zwangere volwassenen te isoleren gezonde eieren en vervolgens waardoor de eieren uit te broeden in S-complete media zonder voedsel. Aangezien voedsel de uitgekomen larven L1 arrestatie ontwikkeling, het genereren van een synchrone populatie L1 larven. Tijdens het scherm, bereiden vers-L1 gearresteerd larven elke week als deze uitgehongerde dieren ziek worden in de tijd en moet worden weggegooid. De keuze van de genetische achtergrond van de dieren die bij de dsRNA voeden stam kan variëren, afhankelijk van de toepassing, voor neuronale schermen ERI-1; lin-15B mutanten worden aanbevolen.

1. Pick 10-20 L4 larvae tot zes afzonderlijke NGM platen met een grasveld van OP50 bacteriën en wacht 6-7 dagen tot de platen bevat veel vers gelegde eieren en zwangere volwassenen.
2. Verwijder dieren en eieren van de platen door toevoeging van 3 ml water aan het oppervlak van elke plaat en gebruik een gehandschoende vinger om de eieren, bacteriën en dieren los van het oppervlak van elke plaat in het water. Zorg ervoor dat alle gebieden van de plaat, met speciale aandacht voor de bacteriële gazon. Verwijder het water, bacteriën, wormen en eieren van elke plaat met een glazen pipet en over te dragen aan een steriele 50 ml conische buis.
3. Voeg een 3 ml water aan het oppervlak van elke plaat en neer te pipetteren over het oppervlak alle resterende bacteriën, wormen en eieren te verwijderen. Voeg dit volume aan de 50 ml conische buis.
4. Spin de conische buis bij 1500 rpm gedurende 1 minuut in een tafelblad centrifuge. Wormen en eieren moeten pellet op de bodem van de buis en de bacterieculturen gesuspendeerd blijven. Zorgvuldig aspireren allemaal maar 4 mlvan de vloeistof uit de buis zorg ervoor dat de gepelleteerde wormen en eieren voorkomen.
5. Resuspendeer de worm pellet in het afvalwater en over te dragen aan een steriele 15 ml conische buis met een glazen pipet. Breng het volume op 10 ml met steriel water.
6. Spin bij 1500 rpm gedurende 1 minuut als hiervoor. Zuig het supernatant verlaten 200 ul water, zodat er geen de worm / ei pellet te verstoren.
7. Voeg 10 ml water aan het conische de wormen en eieren wassen en spin als hiervoor extra bacteriën te verwijderen.

op het volgende: stappen 5,8-5,11 wormen en eieren worden blootgesteld aan een bleekmiddel oplossing. Bleach zal wormen te vernietigen en laat de eieren relatief ongedeerd. Echter, als de eieren nog in bleekwateroplossing te lang zij vernietigd worden. Een timer wanneer bleekmiddel wordt toegevoegd in stap 5.8 zeker van dat eieren niet blijven blootgesteld aan de bleek meer dan 10 minuten.

8. Verwijder alle 200 ul van de bovenstaande vloeistof, opnieuw de pellet vermijden, voeg dan 10ml bleekwater oplossing en start een timer.
9. Incubeer wormen en eieren in bleekwater oplossing voor 3-4 minuten, af en toe mengen door inversie. Dan draaien bij 1500 rpm gedurende 45 seconden in een tafelblad centrifuge. Zoek een pellet op de bodem van de buis, moet het kleiner en compacter dan de oorspronkelijke pellet en een geel uiterlijk zou kunnen nemen.
10. Zuig het bleekmiddel oplossing laat 200 gl achteren om niet de pellet te verstoren.
11. Voeg nog 10 ml verse bleekmiddeloplossing en zwenken als voorheen. Als de timer leest 10 minuten, draai weer en zuig het bleekmiddel oplossing, waardoor er 200 pl achter en snel toe te voegen 10 ml steriel water. Bekijk de oplossing onder een dissectie microscoop. De larven en vele volwassenen moeten opgelost in het bleekmiddel oplossing, waardoor meestal eieren achteren.
12. Spin eerst voor 45 seconden en opnieuw zuig de supernatant om niet de pellet te verstoren. Deze pellet moet in de eerste eieren bevatten en zal zeer los.
13. Anot toevoegenhaar 10 ml water, omdraaien om te mixen, spinnen en zuig het verlaten van een beetje water achter. Het is belangrijk om zoveel bleekwater verwijderen als mogelijk.
14. Voeg 4 ml S-compleet medium aan de conische buis, resuspendeer de eieren en overbrengen in een steriele Erlenmeyerkolf van 100 ml. Plaats de kolf in een 20 ° C incubator op een shaker set bewegende net snel genoeg om te zorgen dat de inhoud van de kolf te wervelen. Dit zal voldoende beluchting bieden aan de L1 larven te ondersteunen wanneer ze uitkomen. Binnen 15 uur alle eieren moeten zijn uitgekomen produceren van een synchrone populatie van L1 gearresteerd larven.

Gearresteerd L1 larven moet vers worden gemaakt elke week tijdens een scherm. Zodra de eerste partij is gedaan, kan een latere cyclus worden gestart door het toevoegen van 500 gearresteerd L1 larven (van de vorige week batch) aan elk van de vier standaard, zonder zaadjes 6 cm platen (die 100 pi overnacht cultuur van OP50), en geïncubeerd bij 20 ° C gedurende 4 dagen. Op de vierde dag van de platen dient te bevattenveel eieren en zwangere volwassenen en kan worden gebleekt te bereiden verse eieren voor meer gesynchroniseerd L1 larven.

6. Het overzetten Gearresteerd L1 larven op Feeding Plates

Overzicht: Om een dsRNA scherm uitvoert, worden 20-30 L1 gearresteerd larven overgebracht op dsRNA voeden platen. Vroege neerhalen effecten zoals larvale aanhouding of dodelijkheid zal worden waargenomen na dieren gevoed dsRNA-uiting van bacteriën voor 2-3 dagen. Afhankelijk van het scherm uitgevoerd, kan de gewenste fenotypes worden waargenomen in de oorspronkelijke dieren die op het voederen plaat (P0 dieren) of in hun nageslacht (F1-dieren). De presentatie van fenotype is afhankelijk van een aantal variabelen, zoals de perdurance van het eiwit gecodeerd door het gen waarvan de expressie wordt neergehaald en de tijd gedurende ontwikkeling waarbij het gen van belang wordt vereist. Vanaf dsRNA voeden culturen met slechts 20-30 dieren dienen observatie van zowel P0 en F1 fenotypes mogelijk voordat eenimals uitlaat de bron van voedsel.

20-30 dieren eenvoudig overzetten naar uw voeding platen, eerst bepalen de concentratie van L1 gearresteerd dieren in de gearresteerde L1 cultuur.

1. Meng de erlenmeyer met de gearresteerde L1 larven om de dieren te verdelen.
2. Verwijderen van een 10 pi aliquot en plaats druppelsgewijs op een ongeplaatste 6 cm NGM plaat in 4-5 druppels naar beneden het midden van de plaat ervoor te zorgen dat alle media wordt verbannen uit de pipet.
3. Met het einde van de pipetpunt spreiden de punten worm suspensie tot een ononderbroken lijn vloeistof dat de diameter van de plaat uitstrekt vormen.
4. Met een dissectie microscoop, tel alle dieren vanaf een einde van de lijn van vloeistof en blijven de andere kant voor de vloeistof is opgenomen in de plaat en de dieren verspreiden. Dit kan een constante heroriëntatie van het ontleden scope vereisen bepaalde dat er geen dieren worden gemist te zijn.
5. Herhaal dit voor drie afzonderlijke 10 ulmonsters en het gemiddelde van de drie nummers het gemiddelde aantal wormen per pl suspensie worm te bepalen en opnemen dit aantal direct aan de erlenmeyer.

7. Begin de Feeding Screen

Overzicht: Om het scherm dsRNA beginnen, worden 20-30 gearresteerd L1 larven toegevoegd aan elke well van 12-well voeden platen met een dun gazon van dsRNA-uitdrukken bacteriën. Feeding platen bevatten standaard nematode groei media (NGM) en worden aangevuld met 500 ug / ml carbenicilline (plasmide verlies te voorkomen) en 1 mM IPTG (dsRNA expressie te induceren). Dieren zich voeden en te ontwikkelen voor verscheidene dagen bij 20 ° C. Twee typische voedingsschema voor dieren zijn 3 dagen bij het uitvoeren van een P0 scherm en 6-7 dagen bij het uitvoeren van een F1-scherm. De duur van het voeden, kan echter worden gevarieerd afhankelijk van het beoogde scherm specifieke fenotypes.

1. Gebruik de schorsing van L1 gearresteerd larven en steriel water om een ​​zo bereidenlution bevatten 2.000 wormen / ml. Elke 12-well plaat voeding zal 120 ul van deze worm schorsing nodig. Meng een gelijke verdeling van dieren te garanderen en breng de dieren een reservoir voor steriele pipetteren.
2. Met behulp van de meerkanaalspipet opgezet met tips in elke derde positie (zie figuur 1) overdracht 10 ul van de worm oplossing direct op de bacteriële grasveld van de voeding platen. Verzorgen het oppervlak van de agar niet te doorboren, zoals wormen zal ingraven in de agar en niet voeden met de dsRNA-uiting van bacteriën.
3. Remix De worm oplossing in het reservoir (door zachtjes klotsen het ongeveer) na elke twee rijen van voeding platen, zoals wormen vestigen snel. Blijven afgeven van de worm schorsing totdat alle voeden platen hebben wormen. Onderzoeken of een paar putten vroeg onder het ontleden ruimte om ervoor te zorgen dat elk putje wordt steeds 20-30 wormen.
4. WINKEL platen rechtop in een vochtige doos in een 20 ° C incubator. De volgende dag, na het worm schorsing is opgenomen in de plaat, de platen om en keer terug naar de humidor bij 20 ° C. Dieren op deze platen kunnen worden waargenomen na 3 dagen (voor P0 fenotypes) en opnieuw na 6 dagen (voor F1 fenotypes).

Opmerking: De bacteriën die achterblijven op het voederen plaat na 7 dagen van de worm groei zijn getest op plasmide verlies en bijna 100% behield de dsRNA plasmide.

Representative Results

P0 knockdown fenotypes zal beginnen te verschijnen na 2-3 dagen van het voederen van dieren dsRNA uitdrukken bacteriën. Sommige vroege fenotypes onder larvale arrestatie en dodelijkheid en moet worden waargenomen bij 2-3% van alle voeden putten. Dezelfde fenotypen worden ook waargenomen in de F1-generatie dieren. De aanwezigheid van F1 eieren die niet uitkomen is andere F1 fenotype en samen zullen deze drie fenotypen worden waargenomen bij ongeveer 10% van alle putjes in F1 schermen.

We gebruikten de hier beschreven protocol knockdown gevolgen voor enkele genen die in verschillende weefseltypen zowel P0 en F1 fenotypes te onderzoeken. Want we wilden ook om te testen op knock-down effecten in neuronaal weefsel, gebruikten we eri-1; lin-15B mutanten in onze schermen. Mutaties in ERI-1 en lin-15B, samen met mutaties in RRF-3, werden geïdentificeerd in schermen voor mutaties die verhoogde gevoeligheid veroorzaakt aan RNAi ^8,13,14.

EGL-30, dpy-17, pat-10, en unc-4. Twee van deze genen, egl-30 en unc-4, worden uitgedrukt in het zenuwstelsel ^15-17, een gen, pat-10, uitgedrukt in het lichaam muur spier ¹⁸ en de vierde gen, dpy-17 en uitgedrukt in onderhuidse cellen ^19. Wanneer we gevoed eri-1; lin-15B dieren bacteriën die de lege pL4440 plasmide bevatte, maar niet ten aanzien van dsRNA, hadden we elke morfologische of gedragsmatige afwijkingen (Figuur 2A, tabel 1) niet waarnemen.

EGL-30, codeert de C. elegans orthologon van de G-eiwit subunit GAQ. EGL-30 null mutanten arrestatie tijdens de vroege larvale ontwikkeling, maar sommige null vluchters en hypomorphic verlies-van-functie EGL-30 mutanten groeien tot volwassen stadium te worden en zijn defect in de motoriek en eierleggende gedrag ^20. Wanneerwe gevoed L1 fase eri-1; lin15B larven bacteriën uitdrukken EGL-30 dsRNA, vonden we dat de larven groeide uit tot volwassenen die duidelijke defecten in de motoriek en eierleggende gedrag toonde geworden. Na drie dagen, 100% van de dieren gevoederd dsRNA tegen EGL-30 werden verlamd en niet in staat om eieren te leggen (fig. 2B, tabel 1). We hadden niet het larvale arrestatie fenotype observeren in onze dsRNA knockdown experimenten die wordt waargenomen in EGL-30 (ad810) null dieren. Dit is waarschijnlijk omdat de L1 dieren we uitgeplaat op egl-30 dsRNA bacteriën reeds vroege ontwikkelingsstoornissen vereiste EGL-30 was verstreken. Dit wijst op een voordeel van het voeden schermen: een laat stadium fenotypes kan worden waargenomen voor genen die ook spelen een belangrijke rol tijdens de ontwikkeling.

dpy-17 codeert voor een eiwit collageen vereist cuticula vorming in C. elegans ^19. DPY-17 null mutanten zijn korter en dikker dan wild-type animALS. We hadden geen morfologische afwijkingen waarnemen in P0 dieren gevoed met dpy-17 dsRNA. Maar 98% van de F1 dieren vertoonden de DPY fenotype (Figuur 2C, tabel 1). Het ontbreken van korte en vet P0 dieren geeft aan dat dpy-17 gen-functie is vereist bij vroege larvale stadia voor een goede lichamelijke morfologie. Terwijl dpy-17 is niet gericht op andere voeding schermen, werd neergehaald door dsRNA injectie ^21. Interessant, slechts 30% van de nakomelingen van dsRNA geïnjecteerde dieren vertoonden de DPY fenotype, wat suggereert dat het voederen protocol beschreven is efficiënter dan de meer arbeidsintensieve injectie benadering, althans voor sommige genen.

pat-10 codeert lichaam muur spier troponine C, een eiwit met vier EF Hand motieven die calcium ¹⁸ binden. Wij vonden dat 100% van de ERI-1; lin-15B dieren gevoed met pat-10 dsRNA werd verlamd binnen 3 dagen en legden geen eieren leidt toa dodelijk fenotype (figuur 2D, tabel 1).

unc-4 codeert voor een eiwit homeodomein uitgedrukt in ventrale koord motorische neuronen en is nodig voor een goede synaptische ingang keuze ^22,23. We kozen voor UNC-4 als een test-gen, omdat het bestand is gebleken tegen de vorige dsRNA voederstrategieën ^8,24 te zijn. UNC-4 mutanten vertonen een defect in motoriek gedrag. Als gevolg van gebreken in synaptische connectiviteit, unc-4 mutanten zijn niet in staat om een back ^22,23. Vergeleken met wildtype dieren die vrij rug in een sinusvormige beweging toen geprikt op het hoofd, hebben unc-4 null mutanten niet terug, maar hun contract middenstuk strak, waardoor een dorsale buiging die vaak wordt zo extreem dat de kop en staart van de dier aanraken, het plaatsen van het lichaam in een opgerolde positie. We vonden dat 68% van de dieren gevoederd unc-4 dsRNA expressie bacteriën uit onze bibliotheek voorbereiding toonde gebreken in backing. Dit is een dramatische verbetering van knockdown efficiëntie in vergelijking met het 0% backing defect waargenomen wanneer RRF-3 dieren gevoed unc-4 dsRNA met eerder gepubliceerde protocollen ⁸ (Tabel 1).

Figuur 1. Stroomdiagram voor bibliotheek duplicatie en grootschalige scherm. Elke 96 of 12 wells plaat die tijdens de screening protocol wordt aangegeven, samen met de methode die wordt gebruikt om bacteriën tussen de platen overzetten. Sterretjes geven de stadia waarin bacteriën moeten worden getest op plasmide verlies. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2. dsRNA knockdown fenotypes van C. elegans genen die in verschillende weefseltypen. A) Controle dieren gevoed met bacteriën bevatten pL4440 lege vector. Zwarte pijl geeft de positie van een jonge volwassen dier. Witte pijl geeft de positie van een groep eieren gelegd. Foto toont vrij bewegende dieren zoals blijkt uit hun normale lichaamshouding. B) Dieren gevoed dsRNA tegen EGL-30. Merk op dat alle dieren een stijve verschijning typisch van verlamde dieren hebben aangenomen. Let ook op de volledige afwezigheid van eieren gelegd op de plaat. C) Dieren gevoed dsRNA tegen dpy-17. Merk op dat volwassen dieren in het veld (gemarkeerd met een pijl) korter en dikker dan de volwassen dier getoond in paneel A. D) Dieren gevoed dsRNA tegen pat-10. Merk op dat alle dieren verlamd maar kan nog steeds bewegen hun hoofd spieren te voeden zoals aangegeven door het opruimen van bacteriën bij het hoofd, aangegeven door een pijl. Schaalbalk 1 mm.

dsRNA plasmide of gen doelwit van feEding	Weefselexpressie van gerichte gen	Procent dieren met klem fenotype
pL4440 (negatieve controle)		wild-type voor alle gedragingen
EGL-30	zenuwgestel	100% Egl en Paralyzed
dpy-17	hypodermis	98% DPY
pat-10	lichaam muur spier	100% Verlamd
unc-4	zenuwgestel	68% Backing Defect

Tabel 1. Terminal fenotype van dieren die gevoed zijn dsRNA tegen genen uitgedrukt in verschillende C. elegans weefsels. n = 100 voor alle genen.

Discussion

We hebben een protocol dat een commercieel verkrijgbare dsRNA voeden bibliotheek gebruikt om grootschalige schermen presteren in C. beschreven elegans. Wij bieden alle opdrachten aan de bibliotheek te reproduceren en om effectief te gebruiken. We tonen aan dat deze benadering kan genen betrokken bij verschillende biologische processen in verschillende weefsels van het dier te identificeren. Terwijl de fenotypes we hier beschrijven zijn gemakkelijk waarneembaar (Unc, EGL en DPY), kan dit protocol worden aangepast om te zoeken naar genen die nodig zijn voor bijna elk biologisch proces. Zo hebben we dit protocol gebruikt om genen die voor transmissie in de worm ²⁵ identificeren. Eenmaal dieren bacteriën tot expressie dsRNA gevoed (typisch 3 dagen P0 schermen 6-7 dagen F1 schermen), kunnen worden uitgesloten van de toevoerplaat verwijderd en getest voor gedragsfenotype.

Plasmide verlies:

We vonden dat de verminderde knockdown efficiëntie waargenomen tijdensgrootschalige dsRNA schermen kan direct worden toegeschreven aan het verlies van dsRNA plasmide uit de bacteriën toegevoerd aan de wormen. Plasmide optreedt in bacteriegroei kweken omdat β-lactamase, gecodeerd op het dsRNA bibliotheek plasmide werkt zowel ampicilline en carbenicilline degraderen, waardoor de concentratie van deze antibiotica in de tijd. Wanneer de concentratie van antibioticum wordt voldoende laag kunnen bacteriën die het plasmide bevatten overleven en bevolken de cultuur. Het gebruik van dergelijke gemengde bacteriële culturen dsRNA scherm moet worden vermeden, aangezien in deze knockdown verminderde activiteit en vaak niet leiden tot verlies-van-functie fenotypen ^11. Verrassenderwijs vonden wij dat hoge niveaus van plasmide verliezen optreden zelfs in bacteriële kweken gekweekt in zeer hoge concentraties van ampicilline (tot 2 mg / ml). Terwijl carbenicilline is beter bestand tegen afbraak door β-lactamase, stellen we ook noodzakelijk concentraties carbenicilline die 10-40 keer hoger waren dan die gebruiktin eerder gepubliceerde dsRNA voeden schermen ^8-10,26 dat alle bacteriën in de kweek behield de dsRNA plasmide.

Omdat de meeste genen in C. elegans zijn haplosufficient, is het uiterst belangrijk dat alle bacteriën aan dieren gevoerd uiten dsRNA. Hierdoor zeer efficiënte gen knockdown en verhoogt de waarschijnlijkheid om verlies-van-functie fenotype in grote schermen.

Positieve en negatieve controles:

Het is cruciaal om zowel positieve als negatieve controle bacteriën behoren in elke voeding plaat bij het uitvoeren van schermen. De negatieve controle is bijzonder belangrijk als gedragstesten worden gebruikt om genen van belang te identificeren. Voor een negatieve controle gebruiken we bacteriën die de lege vector pL4440. Voor een positieve controle, het beste bacteriën die dsRNA tot expressie tegen een gen dat de gewenste knockdown fenotype veroorzaakt gebruiken. Indien dergelijke genen zijn bekendn, moet een positieve controle voor knockdown worden gebruikt dat een gemakkelijk waarneembare fenotype veroorzaakt. Bij het kiezen van een dergelijk gen, moet de voorkeur worden gegeven aan genen die zijn uitgedrukt in het weefseltype doelwit het scherm. Bijvoorbeeld, in dsRNA voeden schermen voor neuronale fenotypen, een neuronale gen worden gekozen als positieve controle. Een waarneembaar knock-down effect bij dieren voeden op de positieve controle bacteriën geeft aan dat de dsRNA interferentie werkt in het gewenste type weefsel.

Het is het beste als de persoon scoren het voederen platen fenotypen blind is voor de locatie van de positieve controles. De screener moet kunnen de positieve en bepalen in elke 96-well plaat. Voor gedrags-assays is het nuttig om eerst de score van de negatieve ruim voor het scannen van de overige wells.

Throughput:

Met behulp van dit protocol, moet een persoon in staat zijn op te zetten en het scherm 16, 12-well platenper dag. Om efficiënt te verplaatsen door de bibliotheek, wij over het algemeen testen elk putje van elke bibliotheek plaat slechts eenmaal per scherm. Gootjes, die als positief gescoord worden geregistreerd en worden getest in drievoud. Wij eisen dat de positieve putten opnieuw te testen in alle drie hertesten. Het plasmide wordt dan gezuiverd van de bacteriën en het inzetstuk sequentie kunnen herkennen het gen. Als null mutanten beschikbaar zijn voor het gen, zullen we ze bestellen en testen van de nul dieren voor de gedrags vastgestelde gebrek in het scherm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
96-well Falcon flat bottom plate	Fisher Scientific	353072	sterile
adhesive foil	USA Scientific	2923-0100
Nunc omniplate	Fisher Scientific	267060
2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock	USA Scientific	5678-0285	autoclavable
Lids for deep well plates	USA Scientific	5665-6101
50 ml combitips	USA Scientific	4796-5000	individually wrapped
Reservoir	USA Scientific	2977-8500	autoclavable
12-well plates	USA Scientific	CC7682-7512	individually wrapped
dsRNA feeding library	OpenBiosystems	RCE1181	store -80 °C
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
Tetracycline	Fisher Scientific	BP912-100
Carbenicillin			allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com
Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A	Affymetrix	10906	for worm plates
Equipment
Brayer roller	USA Scientific	9127-2940
B–kel 96-pin replicator	Fisher Scientific	05-450-9	autoclavable
microshaker	Thomas Scientific	1231A93	3 mm orbit
12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl)	USA Scientific	7112-0510
12 channel multichannel pipet (30-300 μl)	USA Scientific	7112-3300
Repeater Plus manual pipettor	USA Scientific	4026-0201