Summary

Выводя на динамику Глутамат зазор Деконволюция Анализ астроцитов Токи Transporter

Published: August 07, 2013
doi:

Summary

Опишем аналитический метод оценки срока службы глутамата астроцитов в мембранах из электрофизиологических записей глутамата токи транспортера в астроциты.

Abstract

Высокая плотность транспортеры глутамата в мозге находится в астроциты. Глутамат пару транспортеры движение глутамата через мембрану при содействии транспортировки 3 Na + и 1 H + и противоположно направленного транспорта 1 К +. Стехиометрического ток, генерируемый транспортного процесса можно контролировать с цельноклеточная патч-зажим записи из астроцитов. Временной ход записан текущий формируется временной ход глутамата профиль концентрации в котором астроциты подвергаются, кинетика глутамата транспортеры, и пассивный электротоническим свойства астроцитов мембран. Здесь мы описываем экспериментальных и аналитических методов, которые могут быть использованы для записи глутамата токи транспортера в астроцитах и ​​изолировать временной ход глутамата зазор от всех других факторов, которые определяют форму волны тока астроцитов транспортер. Методы, описанные здесь, могут быть использованы для оценки времени жизни оF-вспышкой и Uncaged синаптически выпустили глутамата на мембранах астроцитов в любом регионе центральной нервной системы во время здоровья и болезни.

Introduction

Астроциты являются одним из наиболее распространенных типов клеток в мозге со звездообразной морфологии и мелкие выступы мембраны, которая распространяется на всю нейропилей и достичь 1,2 соседних синаптических контактов. Клеточной мембраны астроцитов 'плотно заполнена молекулы глутамата Перевозчик 3. В физиологических условиях глутамата транспортеры быстро связывать глутамат на внеклеточный стороне мембраны и передавать ее в цитоплазме клетки. Поступая таким образом, транспортеры поддерживать низкие базальные концентрации глутамата во внеклеточном пространстве 4. Глутамат транспортеры в хорошую астроцитов процессов, прилегающих к возбуждающих синапсов идеально расположены для связывания глутамата выделяется при синаптических событий, как это диффундирует из синаптической щели. Поступая таким образом, транспортеры глутамата также ограничить побочные к пери-и экстра-синаптических регионах и на соседние синапсы, уменьшая пространственное распространение возбуждающего сигналасек в мозге 5-7.

Глутамат транспорт электрогенных процесс стехиометрически сочетании с движением 3 Na + и 1 H + вдоль их электрохимического градиента и противоположно направленного транспорта 1 К + 8. Глутамат транспорта связан с (но не стехиометрическом соединены с) анионные проводимости проницаемой для SCN (тиоцианатом)> NO 3 (нитрат) ≈ ClO 4 (перхлораты)> I -> Br -> Cl -> F -, а не СН 3 SO 3 (метансульфоната) и C 6 H 11 O 7 (глюконат) 9-11. Оба токов (стехиометрические и нестехиометрическое) могут быть записаны путем получения цельноклеточная патч-зажим записи из астроцитов, визуально, выявленных в рамках Dodt освещения или инфракрасных дифференциального интерференционного контраста (IR-DIC) в acutэлектронной срезах мозга 12. Стехиометрического составляющей тока, связанных с глутаматом транспорт через мембрану может быть выделен с помощью CH 3 SO 3 или С 6 Н 11 О 7 на основе внутриклеточных растворов и может быть вызвано с помощью флэш-uncaging глутамата на астроциты 13,14, или путем активации высвобождение глутамата из соседних синапсов, либо электрическим, 12 или с целевой контроль optogenetic.

Временной ход стехиометрического компонент транспортер ток имеет форму временем жизни глутамата профиль концентрации при астроцитов мембраны (например, глутамат зазор), кинетика глутамата транспортеры, пассивный свойства мембраны астроцитов, а в синаптической стимуляции, к синхронность высвобождение глутамата через активированный синапсы 13. Здесь мы опишем во всех деталях: (1) экспериментальная провертренере, чтобы изолировать стехиометрического компонентом глутамат токов транспортер с цельноклеточной патч-зажим записи из астроцитов использованием острого мышь срезах гиппокампа в качестве примера экспериментального препарата, (2) аналитический метод для получения временной ход глутамата очистка от этих записей 13, 14. Эти методы могут быть использованы для записи и анализа глутамата токов транспортер из астроцитов в любой области центральной нервной системы.

Protocol

1. Подготовка Slice Подготовьте 500 мл нарезки / хранения раствора, содержащего (в мм): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2, 1,3 MgSO 4 · 7H 2 O, 4 MgCl 2, 26,2 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 22 и глюкозы, 320 мОсм, рН 7,4 Используйте 250 мл стакан подготовить камеру для погружения ломтиками, залейте…

Representative Results

Успех аналитический подход, описанный здесь критически зависит от получения высококачественных электрофизиологических записей транспортера токи из астроцитов в любой области центральной нервной системы. При острых срезов гиппокампа мыши, астроциты могут быть легко идентифицирова?…

Discussion

Здесь мы опишем экспериментальный подход, чтобы получить электрофизиологических записей из астроцитов, аналитический протокол для изоляции глутамата токи транспортера в астроцитах и ​​математические методы для получения временной ход глутамата зазор от астроцитов токов транспор?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Работа выполнена при поддержке Национального института неврологических расстройств и инсульта Внутренние программы исследований (NS002986). Как писал рукопись и реализованы деконволюцией анализа. JSD разработал первоначальный вариант деконволюцией анализа и прокомментировал текст.

Materials

Material Name Company Catalogue Number Comments
CGP52432 Tocris 1246
(R,S)-CPP Tocris 173
DPCPX Tocris 439
LY341495 disodium salt Tocris 4062
MSOP Tocris 803
NBQX disodium salt Tocris 1044
D,L-TBOA Tocis 1223
Picrotoxin Sigma P1675
MNI-L-glutamate Tocris 1490
Alexa 594 Life Technologies A10438 Optional
Matrix electrodes Frederick Haer Company MX21AES(JD3)
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments PG10165-4
Dual-stage glass micro-pipette puller Narishige PC-10
Loctite 404 instant adhesive Ted Pella 46551
Xe lamp Rapp OptoElectronic FlashMic
Igor Pro 6 Wavemetrics

References

  1. Ventura, R., Harris, K. M. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes. J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).
  2. Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus. Glia. 55, 13-23 (2007).
  3. Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
  4. Herman, M. A., Jahr, C. E. Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice. J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).
  5. Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake. Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).
  6. Barbour, B. An evaluation of synapse independence. J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001).
  7. Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation. J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).
  8. Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. Flux coupling in a neuronal glutamate transporter. Nature. 383, 634-637 (1038).
  9. Eliasof, S., Jahr, C. E. Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).
  10. Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport. Neuron. 15, 721-728 (1995).
  11. Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel. J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).
  12. Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
  13. Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).
  14. Scimemi, A., Tian, H. Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).
  15. Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).
  16. Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina. J. Physiol. 436, 169-193 (1991).
  17. Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters. J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).
  18. Diamond, J. S., Jahr, C. E. Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation. J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).
  19. Benediktsson, A. M., et al. Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes. Glia. 60, 175-188 (2012).
  20. Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).
  21. Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1. J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).

Play Video

Cite This Article
Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents. J. Vis. Exp. (78), e50708, doi:10.3791/50708 (2013).

View Video