Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Функциональная Допрос взрослых гипоталамуса нейрогенеза с Focal радиологической ингибирования

doi: 10.3791/50716 Published: November 14, 2013

Summary

Функция взрослых, родившихся нейронов млекопитающих остается активной областью исследования. Ионизирующее излучение подавляет рождение новых нейронов. Использование компьютерной томографии наведением фокусное облучение (CFIR), трехмерные анатомические нападения на конкретных нейронных популяций предшественников теперь могут быть использованы для оценки функциональной роли взрослого нейрогенеза.

Abstract

Функциональная характеристика взрослых, родившихся нейронов остается сложной задачей. Подходы к ингибирует нейрогенез через инвазивной вирусной поставки или трансгенных животных имеют потенциальные путает, которые делают интерпретацию результатов этих исследований трудно. Новые радиологические инструменты появляются, однако, что позволяют неинвазивно исследовать функцию отдельных групп взрослых, родившихся нейронов через точной и достоверной анатомической адресности в мелких животных. Фокусное ионизирующего излучения подавляет рождение и дифференцировку новых нейронов, и позволяет адресности конкретных регионах нейронных предшественников. Для того, чтобы осветить потенциальное функциональную роль, что взрослые гипоталамо нейрогенез играет в регуляции физиологических процессов, мы разработали неинвазивный фокусное технику облучения они избирательно ингибируют рождение взрослых, родившихся нейронов в гипоталамо срединного возвышения. Мы опишем метод для C omputer томография наведениеме Ocal ИК-излучения (CFIR) доставка для точного и точную анатомическую ориентации у мелких животных. CFIR использует трехмерную объемную руководство изображения для локализации и адресности дозы облучения, минимизирует радиационного облучения nontargeted областях мозга, и позволяет конформной распределения дозы с границами острыми пучка. Этот протокол позволяет задать вопросы относительно функции взрослых, родившихся нейронов, но и открывает области на вопросы в областях радиобиологии, биологии опухоли, и иммунологии. Эти радиологические инструменты будут содействовать переводу открытий на скамейке к постели.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Недавние открытия показали, что мозг взрослого человека млекопитающих может пройти значительную степень пластичности. Нейроны взрослых, родившихся генерируются в течение взрослой жизни в специализированных нишах мозге млекопитающих 1. Что такое функция этих взрослых, родившихся нейронов? И тем более, они играют важную роль в физиологии и поведения? Исследования на эту тему традиционно сосредоточены на субвентрикулярной зоне боковых желудочков и под зернистым зоне гиппокампа, однако недавние исследования характеризуется нейрогенез в других регионах мозга, таких как гипоталамус млекопитающих 2. Нейрогенез сообщалось в послеродовом и взрослых гипоталамуса 2-10, и функция этих новорожденных нейронов гипоталамуса остается активной областью исследования.

Функциональная характеристика взрослых, родившихся нейронов остается сложной задачей для области нейронаук в целом. Селективное ингибирование спецификацииБР нейронные популяции предшественников остается ограниченным из-за отсутствия доступных молекулярных маркеров, которые уникальны для отдельных нейронных популяций предшественников 11. Таким образом, избирательное удаление взрослых, родившихся нейронов из этих нервных клеток-предшественников через генетического таргетинга по-прежнему трудно. Кроме того, вирусная доставка целевой взрослых, родившихся нейронов страдает от потенциальных вмешивающихся факторов, таких как введение травмы и воспаления в окружающую среду 12.

Новые радиологические инструменты появляются, однако, что позволяют обойти эти смешивает и исследовать эти вопросы через точной и достоверной анатомической адресности в мелких животных. Ионизирующее излучение подавляет рождение и дифференцировку новых нейронов, и позволяет неинвазивным методом целевой популяциями нейронов предшественников 13-15. В последнее время мы описали зародышевый область млекопитающих гипоталамо срединного возвышения (ME), что мы назвали гипоталамо пролиферативный зону (СЗЗ) 2 2. Чтобы проверить, регулирует ли взрослый нейрогенез в гипоталамо МНЕ обмен веществ и вес, мы пытались сорвать этот процесс. Средний возвышение небольшой односторонний структура на базе третьего желудочка, из которого регулирующие гормоны освобождены. Для того, чтобы ингибировать пролиферацию и последующий нейрогенез без изменения других физиологических функций этой области мозга, мы разработали неинвазивный фокусное технику облучения они избирательно ингибируют рождение новорожденных взрослых нейронов в гипоталамо срединного возвышения 2.

Ряд групп использовали излучение для подавления нейрогенеза в канонических областях 14-28. Однако, предыдущие радиологические подходы, как правило, направлены большие площади, или Ofteн непреднамеренно также направлены несколько областей мозга, где нейрогенез Сообщалось, что затрудняет однозначно связать любые поведенческие недостатков, отмеченных с дефектами в конкретных нейронных популяций предшественников. Способность к более целенаправленной облучения обеспечивается радиологических платформ, которые сочетают C omputer томографии наведением изображений с е Öçal луч ИК-излучения (CFIR) поставки для точного анатомические таргетинга 29-36. Радиационные лучи, как маленькие, как 0,5 мм в диаметре доступны для решения конкретных нейронных популяций предшественников 35. Эта методология позволяет целевой гипоталамо ME и арестовать пролиферацию и блокировать нейрогенез у мелких животных. После лучевой терапии на этих популяций предшественников, физиологические и поведенческие тесты могут быть выполнены, чтобы осветить потенциальное функцию взрослых, родившихся клеток. Фокусное таргетинг особенно важно для нашего приложения, так какгипофиз находится недалеко от гипоталамуса срединного возвышения; облучение гипофиза может повлиять гормональную функцию, а затем смешал результаты.

Биологическая основа для подавления нейрогенеза после облучения все еще остается неясным. Предыдущие исследования излучения полагались на крупных пучков области, и пришли к выводу, что подавление нейрогенеза опосредуется через воспалительной реакции 14, 37. Таким образом неясно, может ли высоко фокусное облучение подавляет нейрогенез, так как он не вызывает существенного воспалительную реакцию. Однако, недавние исследования нашей группы классического нейрогенной области в гиппокампе продемонстрировали, что высоко фокусное облучение в дозе 10 Гр может подавить нейрогенез в течение по крайней мере 4 недели после облучения 35.

Чтобы допросить функцию взрослых, родившихся нейронов гипоталамуса в срединном возвышении, мы используем точность излучения дevice способных доставлять компьютерной томографии в сочетании с пучков излучения малого диаметра для ингибирования ME нейрогенез. Использование рентгеновской трубки, прикрепленный к гентри, который вращается в диапазоне 360 °, мы предлагаем дуги луча микро облучения пучком с использованием робота контролируемой стадии образца, что позволяет вращение у животного в течение лучевой терапии (рис. 1) . С высоким разрешением рентгеновский детектор используется для получения изображения, когда козловой находится в горизонтальном положении 33. Для этого исследования, изображения CT были реконструированы с изотропным размера воксела 0,20 мм. На бортовой съемочной КТ позволило идентифицировать цели в то время как животное находится в положении лечения. Цель была локализована с помощью дозы планирует навигационное программное обеспечение КТ, который был включен с нашим коммерчески доступного радиологического платформы. После локализации рентабельность инвестиций по компьютерной томографии, животное было перемещено в соответствующее положение лечения по роботизированной стадии образца, который имеет четыре градРис свободы (X, Y, Z, θ). Благодаря сочетанию козловых и сценических робот углами, балки могут быть доставлены из почти любом направлении по отношению к животному, и Стереотаксические дугообразных лечения возможны 29. По этим и всем другим визуальных исследований, мыши были помещены в иммобилизации устройство, которое позволяет доставку анестетика изофлурана газа при ограничении движения. Иммобилизация кровать КТ совместимы, и подключается к роботизированной стадии образца 34.

Мы ожидаем, что CFIR обеспечит концептуальные достижения в ряде областей исследований. Хотя мы используем радиологического нападения на гипоталамо срединного возвышения в качестве доказательства принципа этой техники, CFIR можно использовать для целевой любую область тела любого малого модельного организма в принципе. В неврологии, например, мы предполагаем этот метод может быть использован для оценки функции активно пролиферативных популяции клеток-предшественников, которые были предложены в сут в других circumventricular органов, таких, как площадь postrema 38, 39, subfornical органа 40 и гипофиза 41. Многолетние споры, касающиеся функциональной роли взрослого нейрогенеза и выявление причинную роль в поведении могут также теперь будет лучше решать. В певчих птиц, эта техника может рассмотреть роль взрослого нейрогенеза в поддержании прочной и сезонный поведение пение птиц 42, который был затруднен из-за способности селективно ингибировать нейрогенез в конкретных областях мозга. Понимание этого надежную модель поведения может пролить новый взгляд на роль взрослого нейрогенеза в регулировании других половой диморфизм поведения. Кроме того, в метаболической области, CFIR могут быть использованы для изучения аспектов роли пролиферации гепатоцитов и его роль в метаболизме и энергетического баланса. Возможность для концептуального заранее в нескольких научно-исследовательских дисциплин усиливается введением этой техники.

43, 44. Таким образом, мы обобщаем этот протокол CFIR с шагов, необходимых для всех научно-исследовательских платформ, а не, специфичные к SARRP. Преимущества CFIR по сравнению с предыдущими радиологических подходов к ингибируют нейрогенез в том, что этот метод позволяет трехмерное объемное руководство изображения для локализации и адресности дозы, конформной доза снижает воздействие nontargeted областях мозга, и геометрия высокая точность луч позволяет конформной распределения дозы с Границы острые лучевые. Мы выделяем, как использовать КТ наведением изображений целевой дозы к определенному анатомической области, и на этом, как визуализировать излучениедозы распределение непосредственно в ткани с помощью иммуногистохимического окрашивания для γ-H2AX, маркера двухцепочечной ДНК разрывов 35, 45-48. Использование такого подхода для селективного облучения нейрогенных ниш может иметь существенные последствия в выявлении функциональной роли новых взрослых, родившихся нейронов на физиологии и болезней.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Животное Статистика

Получить одобрение от институциональной уходу и использованию животных комитета по протоколам стандарта уход и использование. Ток был разработан протокол для облучения координационных исследований по 5.5-10 недельных взрослых C57BL6 / J мышей, как описано ранее (рис. 2) 2. Однако другие возрасты и мелкие виды животных (крысы, хомяки, суслики и др.) также могут быть использованы, при условии, что эффективные протоколы анестезии и рентгенологические ссылки атлас, позволяющие идентифицировать области интереса (ROI) доступны.

1. Калибровка КТ-управляемой радиационной платформы

Выполнение пленки на основе калибровки для дозы радиации на радиологического платформы в заранее для каждого размера коллиматора и типа фильтра рентгеновской трубки, используемой. В целях выявления дугу луч облучения в нужной целевой сайте, используйте излучения программного обеспечения доза-планирование 49 availablэ на большинстве коммерческих платформ излучения для расчета времени отгрузки на основе дозы облучения, глубина области процентной (ROI) на основе КТ мыши, и скорость вращения роботизированной платформы; подробно об этом не учтены этого протокола, как они отличаются между радиационных платформ. Для целей визуализации вентробазальном гипоталамус 2 (рис. 3) с компьютерной томографии, управлять рентгеновскую трубку с 0,4-мм фокусного пятна и энергии пучка 100 кВп с 1 мм Аль фильтрации. Для фокальной облучения СЗЗ, управлять рентгеновскую трубку на 225 кВп, 13 мА, а также 1-мм фокусное пятно с фильтрацией 0,15 мм Cu, чтобы доставить 10 Гр излучения на глубине ткани 0.6 см над лечения время 4,6 мин. Ориентация между различными трансформирования потребует расчета различных параметров.

  1. Если изучения эффектов высоким содержанием жиров на нейрогенеза в срединном возвышении, как описано выше 2, получаем четыре недели-летняя женщина C57BL6 / J мышей из лабораторий Джексон мыши, и дом четыре мышей в клетке. Перейти еду из нормальной чау к высоким содержанием жиров в пять недель. Разрешить мыши, чтобы акклиматизироваться к новым жильем и едой. Выполните лечение CFIR на 5,5 недель. Транспорт подвергает в операционную, которая содержит радиологического платформу. Свернуть уровень стресса во время передачи. Подготовка ИФ газа анестезии камеру. Затем добавить один курсор в камеру. Параллельно подготовить грелку (низкая настройка) для последующей обработки.
  2. Как только мышь не находится под и больше не реагирует на сжатие футов площадку, поместить объект в радиологической платформы и поместите на иммобилизации ложе роботизированной этапе. Поместите рот субъекта в носового конуса анестезии чашки и зубы в укуса охранника (рис. 1D). Положите мыши квартиру на иммобилизации кровати и проверить, если он продолжает поддерживать невосприимчивость. Если это так, лента вниз мышь для кровати с марлевой ленты. В то время как запись на пленку вниз мышку, чтобы кровати, Убедитесь, что глава выравнивается к горизонтальной плоскости. Это может быть определено, потянув за уши и, видя, если они уравниваются. Как только мышь находится в правильном положении, закрыть ведущую защитный щит.
  3. Приобретать компьютер-томографию с использованием бортового программного обеспечения радиологического платформы экспериментатора (это будет отличаться между платформами), что обеспечит трехмерное анатомическое структурную проверку субъекта мыши. Проверьте, если глава мыши выравнивается к горизонтальной плоскости. Если нет, повторите шаги 1,2 - 1,3 до головы субъекта не выравнивается.
  4. Определить рентабельность инвестиций с помощью КТ изображения. Вычислить расстояние от ROI на поверхности черепа при помощи углом 45 ° к горизонтальной плоскости, как показано на рисунке 3E.
  5. Использование бортового программного обеспечения, принять рентген субъекта мыши сверху, как показано на рисунке 4A. Затем удалите мышь от радиологического платформы, поставить на грелку, и не контролировать, пока активен.
  6. От корональных КТ-изображений, вычислить среднюю глубину ROI анатомическую по крайней мере трех мышей в целях определения доставки дозирование. В качестве примера из предыдущего исследования 2, где 10 Гр облучения вводили в вентробазальном гипоталамуса, глубина ROI от черепа (от углом 45 °) составляет 0,66 см (см. рис 3E). Зная, что, исследователи использовали программное обеспечение планирования доза (DPS), установленных на радиологического платформы для расчета необходимой скорости вращения и продолжительность лечения для достижения желаемой дозы в ROI.
  7. После определения продолжительности лечения и скорости вращения роботизированной стадии с программным обеспечением дозы планирования, измерения распределения дозы вычисленных параметров с GAFchromic радиационно-чувствительный пленок, встроенных в пластиковой модели макет мыши водой эквивалентны. Чтобы сделать это, вставлять три GAFchromic радиационно-чувствительной пленки между четырьмя вертикально уложенными водой эквивалентно пластиковых блоков 29, какпоказано на фиг.4В.
  8. Наведите макет модель мыши, содержащий GAFchromic фильмы на роботизированной этапе и запустить фокусное луч облучения с вновь расчетных параметров. Например, для целевой вентробазальном гипоталамуса, вход параметры 0,15 мм Cu фильтра, 225 кВп, 13 мА, 1-мм диаметр радиации настройка лучей, под углом 45 ° козловой, 1.3 ° вращение / сек, и 4,6 мин для достижения рентабельности радиологическое доза 10 Гр.
  9. После облучения проверить фильмы для картины и интенсивности дозы облучения. Для угла поворота 360 ° с параметров, перечисленных для целевой вентробазальном гипоталамус, темное кольцо в фильме выше изоцентре, небольшой свежий месте в изоцентра фильма, и более светлым кольцом в фильме под изоцентре соответствующий конуса- луч администрация облучения будет наблюдаться (рис. 4В).
  10. Наложение изоцентре GAFchromic пленку на рентгеновских лучей субъектов мыши из которых параметры были калвычислили. Облученный Координационного центра по изоцентре должны пересекаться с требуемой области ROI как показано на рисунке 4C.

Альтернативный метод: Если трудности в планировании мозга ROI не устранена, используйте йод контраст вводят интратекально для повышения визуализацию желудочков при КТ-изображений. Для краткости, эта процедура остается вне этого протокола, но ранее описано 35, 50. Йод контраст даст дополнительные ориентиры желудочка (рис. 5, а).

2. Определение Точность облучения пучком

Далее подтвердить точность CFIR луча по прямой визуализации пучка излучения в ткани 2, 35, 51. Чтобы сделать это, выполните иммуногистохимию обнаружить γH2AX 51, гистонов белка и ранний маркер двунитевых разрывов ДНК. Предметы мыши должны быть транскардиально перфузии и фиксированной в течение одного часа облучения. После облуAtion, репарации ДНК быстро Ensues, и уровни ΥH2Ax значительно снизить 35.

  1. Повторите шаги 1.1 - 1.3.
  2. После того, как цель определена на КТ, предметом мыши перемещается под робота контроля для выравнивания этой цели с доставки луча излучения. Входные расчетные параметры (скорость вращения и продолжительность лечения для достижения желаемой дозы) с этапа 1.6 в доза-планирования программного обеспечения и начать лечение. Лечение поставляется с козловой указал на 45 ° от вертикали в то время как мыши вращается вокруг вертикально ориентированной оси.
  3. После облучения выполнять transcardial перфузии по предметам мыши. Выполнение перфузии в течение одного часа 52. После мозги перфузии, погружение исправлений в 4% PFA / PBS и осторожно встряхнуть в течение ночи при 4 ° С.
  4. На следующее утро, мыть 5 мин в PBS 3 раза, чтобы удалить параформальдегида фиксатором. Затем погрузите в 30% сахарозы в 1x PBS на качалку при 4 ° С.
  5. Осторожно покачайте при 4 ° С (насually 12-16 ч), до тех пор, мозг не опускается на дно трубы. Это служит шагом криозащиты. После того, как мозг раковина, удалить мозг с перфорированной ложкой, чтобы предотвратить избыточную 30% sucrose/1x PBS передачу. Быстро вставлять в замораживании среду на сухом льду. Вихревой замораживания среду с кончика пипетки и выровнять мозг в пластиковых форм.
  6. После того, как полностью заморожены, передавать блоки мозга до -20 ° C морозильник для хранения.
  7. В день, когда будет выполнена иммуногистохимия, раздел коронки при 40 толщиной мкм, и плавать в 24-луночный планшет, содержащий PBS с тонкой кистью. Разделы должны храниться в правильном последовательном порядке для иммуноокрашивания определить облучения охват целевой области.
  8. Prewarm 0,01 М раствор цитрата натрия при 80 ° С в водяной бане при подготовке к поисковой антиген шага. Одновременно, в то время цитрат натрия прогревается, выполните 5 мин моет 3x в 0,01 М PBS.
  9. После того, как цитрат натрия раствор при 80 ° С, погрузить срезы головного мозга ян буферный раствор цитрата натрия. Оставьте на водяной бане при 80 ° С в течение 1 часа.
  10. Удалить раздел и позволить цитрат натрия раствор до комнатной температуры, а затем выполнить три 5-минутных промывок в 0,01 М PBS.
  11. Блок срезы головного мозга в течение 1 ч в PBS-Triton, содержащей 5% нормальной козьей сывороткой.
  12. Инкубировать срезы головного мозга в течение ночи в PBS-Triton, содержащей 5% нормальной козьей сывороткой с концентрацией 1:700 мышиной анти-фосфо-H2AX первичного антитела при 4 ° С.
  13. На следующий день, выполните 15 мин моет 3x в 0,01 М PBS-Triton.
  14. Инкубировать срезы головного мозга PBS-Triton, содержащей 5% нормальной козьей сывороткой с козьим антителом против мышиного вторичного антитела, конъюгированного с 488 нм fluorphore в концентрации 1:500 в течение 2 часов.
  15. Выполните 15 мин моет 3x в 0,01 М PBS-Triton.
  16. Выполнение 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) пятно (1:5000 в PBS) в течение 10 мин для визуализации ядро. Затем промыть срезы головного мозга в течение 5 мин с PBS.
  17. Установите на электростатически чarged предметные стекла по плавающей секции в PBS. Сотрите избыток PBS и позволяют слайды высохнуть. Покровные слайды с помощью монтажной среды и позволяют слайды сушить в темноте при комнатной температуре в течение ночи.
  18. Сфотографируйте серийных корональных секций с флуоресцентным микроскопом. ΥH2Ax иммуноокрашивание (зеленый) указывает сайт облучения. DAPI (синий) является ядерной пятно (рис. 5Б).

3. Подготовка Mouse Темы для Focal облучения

Изучите ΥH2Ax результаты иммунной окраски. После того, как удовлетворены калибровки и адресности облучения пучком, приступить к эксперименту. В этот момент общее время, необходимое для лечения мышь (от установки животного к завершению доставки луч) составляет примерно 10-15 мин для лечения 10 Гр с 1-мм лучом.

  1. Заказать четыре-недельных C57BL6 / J самок мышей от лабораторий Джексон мыши. Дом четыре мышей на клетку, и перейти еду из нормальной чаук высоким содержанием жиров в пять недель. Ухо пунш мышей, чтобы дать им уникальные опознавательные знаки. Монитор здоровье мышей ежедневно. Примечание: металлические маркеры не могут быть использованы как они приведут к полос артефактов на КТ.
  2. Взвесьте мышам накануне излучения или мнимого лечения. Сплит мышей на две когорты для излучения или лечения мнимого и убедиться, что нет существенной разницы в весе между когорт. В день лечения, когда мыши шесть недель, взвешивают все мыши и записать их массу. Осторожно транспортировать как когорты к радиологической платформы. Позаботьтесь, чтобы свести к минимуму уровень стресса.
  3. Подготовка ИФ газа анестезии камеру. Обезболить двух мышей, одна в заданном облучения группы, а другой в контрольной группе обмана. Подготовьте грелку, установленную в низком уровне для послеоперационного лечения.
  4. Выполните шаги 1,2 - 1,4 для мыши, чтобы получить облучение. Для симуляции мыши, держать мышь в анестезии камере в то время как лечение происходит. Сделать сюре, что анестезия камера рядом с CFIR платформы таким образом, любые воздействия на окружающей излучения учтены дюйма После цель идентифицируется на КТ, двигаться предмет мыши под робота контроля для выравнивания этой цели с доставки луча излучения. Входной рассчитывается параметры (скорость вращения и продолжительности лечения) в доза-планирования программного обеспечения.
  5. После того, как обработка облучением завершена, вернуться как обман и облученных мышей грелку, и контролировать, пока они не проснуться.
  6. Вернуться как обман и облученных мышей вивария. Монитор каждый день. Взвесьте мышей каждый полторы недели. Чтобы подтвердить облучение целевой гипоталамо зоне пролиферации, управлять внутрибрюшинные инъекции BrdU (50 мг / кг) три дня после лечения и изучить нейрогенез между группами по colabeling иммуногистохимии для BrdU и нейронального маркера одного месяца после первоначального воздействия BrdU (рис. 6) 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Оценка КТ наведением Таргетинг и точность

Механическое калибровка системы является критическим для обеспечения того, чтобы лучи от различных углов все пересекаются в одной точке. Калибровка была выполнена с полуавтоматической метода визуализации на основе, где точность выравнивание конца в конец была измерена быть 0,2 мм 29. Такая точность весьма критически, как объем гипоталамо средней структуры возвышения мало 2. Чтобы проверить эту калибровку, мы измерили распределение дозы с GAFchromic радиочувствительных фильмов, внедренных в водной эквивалент пластиковой модели макет мыши 35 (рис. 4В). Вкратце, было принято КТ-сканирование субъекта мыши, и наш вентробазальном гипоталамо целевой сайт был идентифицирован. Были рассчитаны Доставка и скорость вращения, и соответствующая коллиматор и фильтрации были прикреплены, чтобы обеспечить 10 Гр излучения было доставлено. Модель макет мышь разработана с водяной equivalen т пластик структура с встроенной GAFchromic радиочувствительных пленок затем заменен на реального субъекта мыши для измерения распределения дозы в различных фокальных плоскостях. показывает результаты из конца в конец испытаний от лечения дуги с пучком на 1 мм диаметра с помощью GAFchromic фильмы в платформе макет мыши. Козловой был установлен под углом 45 ° по отношению к макет модели мыши в то время как роботизированная этап образец вращается вокруг вертикально ориентированной оси, генерируя "дугу" или конус излучения. Полная ширина на половине максимума (FWHM) является 2,31 мм, которое больше, чем 1,0 мм с дуги падают на пленку под углом. Теоретически размер пучка на этот угол должен быть 2,0 мм. Фокусное пятно луча показано на рисунке 4 демонстрирует точность выравнивание лучей от разных направлениях. Эта пленка может быть наложена на верхней части реального субъекта мыши, демонстрируя положение луча и точность (фиг.4С).

e_content "> Использование 1 мм диаметр пучка коллиматор, техника дуга используется для доставки 10 Гр до целевой точки в нашей теме мыши. Предыдущие измерения 29 показывают, что этот метод обеспечивает очень низкие дозы радиации (<0,1 Гр) за пределами 1 мм мишенью. Площадь гипофиза и окружающих структур, таким образом, эффективно защищены от фокусного облучения вентробазальном гипоталамуса. Точность адресности пучка был измерен в предыдущих исследованиях, чтобы быть в пределах 0,2 мм и пунктиром тесты 29 и срезах тканей 35 .

Хотя это не требуется, CT наведением ориентации в ROI может быть повышена за счет вводимого интратекально йода отличие повышения КТ наведением ориентации для нашего приложения мозга (фиг.5А). Поскольку это является инвазивной и громоздкая процедура, этот контраст не часто используется, и не описано в данном протоколе. Подробная информация для этого протокола можно найти в Форд и др.. 2011 и Chaichana др.. 2007. Преимущества этого йодированного отличие в том, что боковые желудочки и третий четко визуализируются в КТ, полученных на радиологического платформы CFIR (фиг.5А). В качестве мишени срединного возвышения, на базе третьего желудочка, и был идентифицирован с помощью КТ наведением навигационное программное обеспечение и автоматически импортируются в интерфейсе робот позиционирования. Костные структур черепа были определены и используются в качестве анатомических ориентиров для последующих исследований, в которых йод контраст не занятых.

Луч Ориентация Проверка с γ-H2AX

Для дальнейшего подтверждения наша КТ наведением адресности гипоталамо медиаобразования, мы визуализировали 1 мм облучения пучок в ткани за счет косвенного экспертизы двухцепочечными разрывов ДНК, которые возникают после облучения. H2AX гистонов белка фосфорилируется после ДНК двунитевых разрывов. γ-H2AX широко используется в мозга и других тканей 46 -48, а количество γ-H2AX + очагов по-видимому, хорошо коррелируют с дозы облучения в широком диапазоне доз 51, 53. Мы наблюдали четкую визуализацию луча следующие γ-H2AX иммуноокрашивания (рис. 5б). Результирующая окрашивание γ-H2AX показал точность наведения ожидаемого месте. Край света была также очень резкое, в соответствии с пленочных физических измерений ввода в эксплуатацию, которые указывают на 20-80% полутень 0,3 мм 54. Мы ранее измеренное расстояние между намеченной цели и центра луча, как визуализируется в срезах тканей 35. В центре пучка смещение от намеченной цели на среднем расстоянии 0,19 ± 0,36 мм (стандартное отклонение) в 10 облученных мышей после факторинга для воздействия ткани усадки при фиксации и обработки 35.

Использование стереотаксической-как лечение дуги, состоящий из дуги в 45 ° от вертикали, мыпоказать, что мы были в состоянии эффективно целевой вентробазальном гипоталамус, без облучения другие нейрогенные ниши (рис. 5C-D). Облучение прилегающих районах было минимальным, и была граница в радиационного облучения как показали GAF-хромовой пленкой (рис. 4В) и γ-H2AX иммуноокрашивания (рис. 5B-D). Ткань от спины к гипоталамо ME показывает света γ-H2AX окрашивания (рис. 5б), потому что пучки излучения введите через этот регион, а также, возможно, из-за повышения по оверлейного кости, хотя достаточно сложно луч рентгеновского был использован (225 кВп, 0,15 мм фильтрации Cu).

Влияние на нейрогенез

После подтверждения специфику нашей КТ наведением доставки облучения, мы исследовали влияние 10 Гр облучения на уровнях ME нейрогенеза. Взрослых мышей кормили высоким содержанием жиров, получил лучевую или фиктивный лечение, а затем впоследствииBrdU инъекции, как описано выше, начиная с 6 недель 2. Мышей умерщвляли для рассмотрения на 10 недель, через месяц после первой инъекции BrdU. Облученных HFD-кормят взрослых мышей выставлены ~ 85% ингибирование МНЕ Нейрогенез по сравнению с имитацией лечить управления (6А) 2. Дугообразного ядра, рядом структура, ограничивающая облучения сайт, исследовали на изменения в нейрогенеза, и обнаружили, не было статистически значимой разницы между облученных животных и контроля фиктивных 2 (рис. 6а).

Функция взрослых родившегося Медиана Высокопреосвященнейшего нейронов гипоталамуса

Изменения в облученных и фиктивных мышей были рассмотрены после лечения. Шуба и ответ на ощупь казались нормальными. Панель химия и полный анализ крови панели был рассмотрен через неделю после лечения облучения, и никакого существенного различия не наблюдалось (п = 9/group). В с высоким содержанием жира, подаваемогомышей, где мы наблюдали снижение взрослых, родившихся ME нейронов ~ 85% за один месяц после облучения (рис. 6А), облученных мышей снизилась веса с течением времени по сравнению с мнимой группе, получавшей (рис. 6C). Напротив, нормально-чау подается контрольных мышей, где наблюдаемые уровни МНЕ нейрогенез были значительно ниже, чем их высоким содержанием жиров кормили коллегами 2, не было статистически значимой разницы в весе между обман против облученных групп (рис. 6б). Интересно, что это сводится увеличение веса в облученного высоким содержанием жира, подаваемого мышей сопровождается изменениями в обмене веществ и деятельности, как описано ранее подробно нашей группе 2 (рис. 6D-I).

Рисунок 1
Рисунок 1. Компьютерная томография наведением фокусное облучение платформа (CFIR). (B) Использование двойного источника рентгеновскую трубку, прикрепленную к гентри, который вращается на 360 °, SARRP использует робота контролировать стадию образца, который позволяет вращение у животного во всем лучевой терапии. (С) CFIR аппаратного состоит из рентгеновской источника, коллиматора, вращающейся раме, поддержку животных, вращающихся робота этап пробы, и электронный тепловизор. (D) Предметом мышь помещают в иммобилизации постели с газа анестезии входа на роботизированной стадии образца. От Armour и др.. 2010 года. (Е) CFIR оборудование должно включать в себя настраиваемые коллимирующие конусы для фокусным ИК излучения поставка различных размеров. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2
Рисунок 2. Экспериментальная парадигма. Женский C57BL / 6, были заказаны из Джексона лабораторий мыши, и приспособиться к резидентам клетках на четыре недели. Заголовок мышь были переведены на вволю высоким содержанием жиров в пять недель, и разделились на две группы лечения: облученные или фиктивных когорт. Физиологические оценки были взяты в продольном до и после лечения. Облучения или фиктивных лечения вводили в 5,5 недель. Внутрибрюшинные инъекции BrdU дали на шесть недель, как описано выше 2.

pload/50716/50716fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Регион локализации ставкой. Гипоталамо пролиферативная зона (СЗЗ), нейрогенная регион, расположенный в гипоталамо срединного возвышения, расположен в брюшной медиобазальных гипоталамуса. (А) СЗЗ область интереса (ROI) подсвечивается красным перекрестие в 3-D Нисслю объема Справочный атлас от Allen Brain Atlas Data Portal (Позиция: 7,041, 7,211, 5,564) (доступно с http:// mouse.brain-map.org / ) 55. (В) Корональные части мозг ROI в девятнадцать-дневных мышей. BrdU иммуногистохимии (зеленый) показывает, что ROI (белый наконечник стрелы) содержит пролиферативные клетки. Плотность пролиферативных клеток в СЗЗ ограничен в передних к задним ось, с плотностью самым высоким в -1,75 мм брегмы. Срезы тканей противопоказаны окрашивали DAPI ядерной маркера (синий). Рисунок из Ли и соавт. 2012a.(CE) КТ-изображений на CFIR платформы позволяет пристреливать СЗЗ ROI (красные перекрестия) дуги доставки лучевой. КТ-изображение предмета мыши в горизонтальной плоскости (C), сагиттальной плоскости (D), и фронтальной плоскости (E). (Е) Расстояние от поверхности черепа к ROI составляет 0,62 см (красная линия). Масштабные бары = 1 мм (А), 50 мкм (В), и 0,62 см (CE). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 4
Рисунок 4. Калибровка доставки облучения. (А) Рентгеновский субъекта мыши обеспеченных в иммобилизации устройства на роботизированной этапе SARRP. (В) Расчетная рентабельность координатывновь вводится и направлены против макет модели мыши. Фантом модель состоит из GAFchromic радиационно-чувствительный пленок, внедренных в водной эквивалент пластика. Фильмы расположен выше, на и под изоцентре ROI обнаружения распределения дозы. 45 ° дуги пучок излучения от SARRP обеспечивает распределение дозы конусообразную к ROI, и сходится в изоцентре (полутень пятна). (С) Наложение дозиметрической пленки, приобретенного с пучка излучения 1 мм пунктиром с рентген реального субъекта мыши (желтая линия). Белый круг (стрелка) указывает 10-Гр доза радиации централизовано направлены на СЗЗ. Пунктирная линия описывает мозг. Панель с Ли и соавт. 2012a.

Рисунок 5
Рисунок 5. Подтверждение радиационной доставки. CT изображений с йодом отличие может увеличить визуализацию ROI если нормально КТ изображения не sufficэ. (A) Предметы Mouse получила йода контрастирует как описано ранее (Панель от Ли и др.. 2012). КТ-изображений в корональной, горизонтальной и сагиттальной плоскости показаны слева направо. (В) Подтверждение доставки излучения в ткани могут быть обнаружены с помощью иммуногистохимии для γH2AX, маркера двухцепочечной ДНК перерывов. γH2AX иммуноокрашивание показывает радиационный доставку луча целевой к СЗЗ ROI в брюшной медиобазальных гипоталамуса. γH2AX иммуноокрашивание не наблюдается в субвентрикулярной зоне боковых желудочков (C), или под зернистым зоне гиппокампа (D) на ту же тему мыши. (BD) Разделы контрастно с DAPI (От Ли и др.. 2012a). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .


Рисунок 6. Фокусное ингибирование мне результаты нейрогенеза в изменений в весе и метаболизма. (A) срединного возвышения (ME), расположенный в брюшной медиобазальных гипоталамуса была направлена ​​для облучения. Дугообразного ядра (ARCn) является соседних анатомическое строение. Через месяц после лечения, процент BrdU + Ху нейронов от обман против облученных когорт были количественно с помощью иммуногистохимии в ME и ARCn. Уровни ME нейрогенеза были значительно сокращены в облученных против фиктивных когорт (п = 5/cohort, *** = р <0,0001). Уровни ARCn нейрогенеза не были затронуты (п = 3/cohort, нс = не имеет значения). (B) Нормально чау кормили (NC) и (С) с высоким содержанием жиров кормили (HFD) мышей были рассмотрены продольно за изменения в весе после облучения или мнимого сточных вЛОР (B, п = 12/cohort; C, N = 9/cohort). (DE) Один месяц после лечения, облученной и обман обработанной HFD-кормили мышей были рассмотрены количественного магнитно-резонансной спектроскопии для анализа% жировой массы и% мышечной массы. Облученных мышей было значительно меньше,% жировой массы и значительно более% мышечной массы, чем в контрольной фиктивных (п = 5, * = р <0,05). Общая масса: (Шам) 21,0 ± 0,3 г, (облученного) 18.86 ± 0,4 г; Lean массы: (Шам) 14,6 ± 0,2 г, (облученного) 13,9 ± 0,3 г, жиры Масса: (Шам) 3,9 ± 0,2 г, ( облученные) 2,6 ± 0,3 г (п = 5, * = р <0,05). (FI) Облученных и фиктивных лечение взрослых мышей были помещены в системы мониторинга Комплексная Лаборатория животных (моллюсков) для одновременного измерения приема пищи, физическую активность, и всего тела метаболических профилирования две недели после обработки. После акклиматизации в испытательной камере, облученных мышей наблюдались иметь сиgnificantly больше расход энергии, общая активность, и VO 2 (мл / кг / ч) по сравнению с контролем с ложной в темной части суток (п = 11, 12; * = р <0,05). (G) Никаких существенных различий не наблюдалось в дыхательных обменного курса (RER) (п = 11, 12). Subfigure генерируется из данных ранее опубликованных в Ли и соавт. 2012a и Ли и соавт. 2012b. Подпунктах ДИ от Ли и соавт. 2012a. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

КТ наведением фокусное облучение (CFIR) является новым и полным системный подход способен обеспечить поля излучения на цели в небольших животных при роботизированной контроля с использованием CT-руководство 32. Возможность CFIR доставить высоко сфокусированные пучки малого животных моделях предоставляет новые возможности исследования для преодоления лабораторные исследования и клинические перевод. Эта статья описывает подход CFIR для точной подачи излучения специально нацелены на гипоталамо нейронной население предшественников. Мы демонстрируем здесь, чтобы откалибровать и подтвердите излучения доставки специфику через рентгеновскую пленку и в ткани мозга с помощью иммуногистохимии.

Кроме того, будет показано, как этот метод может быть использован для подавления нейрогенез в определенной области мозга. Мы показываем, что мы в состоянии целевой вентробазальном гипоталамус, и подавляют нейрогенез в срединном возвышении, не изменяя уровни нейрогенеза в смежных структур. Торможение ME нейрогенез сопровождается изменениями в обмене веществ и деятельности, а также снижение прибавки в весе на высоким содержанием жиров в облученных против фиктивных группах (рис. 6) 2. Эти данные указывают на роль этих взрослых, родившихся нейронов гипоталамуса в регуляции обмена веществ и энергии гомеостаза. Более того, можно предположить, что избыток высоким содержанием жиров может изменить критическую схему обмена веществ даже в зрелом возрасте 3. Наши результаты представляют собой важный экспансию на известной функции взрослых, родившихся нейронов, и проливает свет на новый гипоталамо нервной населения предшественников 3. Потенциальные предостережений этого подхода является то, что облучение ингибирует пролиферацию клеток-предшественников, а не нейрогенез по себе и, таким образом, также возможно, что физиологические изменения после лечения может быть частично объясняется нарушением других взрослых клеток генеза. Дальнейшие шаги будут включать в себя разработку генетических инструментов, чтобы препятствовать распространению этой конкретной нервной предшественников рopulation, что обеспечит существенную ясность в функциональной роли этих предшественников и их потомства игры в регуляции физиологии 3.

Взятые вместе, однако, это радиологическое платформа служит важным отправной точкой в ​​выполнении экраны среда пропускной способности нейронных клеток-предшественников и их потомства. Это радиологическая техника не ограничивается исследовать вопросы в области нейронаук, однако, и мы ожидаем, CFIR расширить концептуальную аванс в ряде научно-исследовательских дисциплин. Недавнее наличие выпускемых КТ-управляемых радиологических платформ дает возможность исследователям использовать эти возможности этой платформы для своих исследовательских вопросов (рис. 1). Несколько вариантов имеются в продаже, что позволяют выполнять изображения наведением небольшая животноводческая облучение. Кроме того, КТ-управляемые координационные системы облучения также может быть построен в доме, как и в случае с системой, используемой для этих хtudies на Джона Хопкинса 29-33, 35.

Выполнение этой степень фокальной адресности требует надлежащего калибровки и адресности рентабельности инвестиций. Хотя этот метод будет изначально пройти обучение для того, чтобы ознакомиться с платформой CFIR и его доза-планирования программного обеспечения, работа устройства довольно легко после понимания протокол и возможности платформы. Рекомендуется, что практика оператор калибровочные пучка излучения в несколько раз до запуска полномасштабного продольную эксперимент. Тем не менее, как только свободно говорит на работе CFIR, исследования должны двигаться быстро.

Этот протокол CFIR описано здесь использует трехмерную объемную руководство изображения для локализации и ориентации от дозы. Конформный доза снижает воздействие nontargeted областях мозга, и геометрия высокая точность луч позволяет конформной распределения дозы с границами острыми пучка. Это позволяет задавать вопросы regardiнг функцию взрослых, родившихся нейронов, но и открывает области для вопросов к роли клеточной пролиферации в таких областях, как физиологии, биологии опухоли, и иммунологии. Этот метод может быть расширен несколькими способами с контрастных красителей и биолюминесценции для повышения визуализации 35, 56. Настоящее время прилагаются усилия для расширения возможностей CFIR аппаратные дальше, и платформа в настоящее время изменен, чтобы включать в себя позитронно-эмиссионной томографии сканера 56 на борту. Они будут способствовать расширению инструментов, доступных для исследователей и помощи в переводе открытий на скамейке к постели.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

JW имеет финансирования научных исследований и консультационных соглашения с Xstrahl, Inc

Acknowledgments

Мы благодарим С. Montojo, J. Рейес, М. Armour для технических консультаций и помощи. Эта работа была поддержана американского Национального института здравоохранения гранта F31 NS063550 (до DAL), премию Василия О'Коннор Стартер Scholar и дотаций из Klingenstein фонда и NARSAD (в SB). СО является Кека Заслуженный молодой ученый в медицинских исследований.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SARRP research platform Xstrahl RS225A http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP irradiation bunker Xstrahl Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding
GAF chromic film IPS GAFchromic ETB2
Mouse phantom Gammex 457 Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.
Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody Millipore, Inc. 05-636 clone JBW301
High-fat rodent diet Research Diets D12492i 60% of the calories as fat, food should be irradiated
Isoflurane Baxter Healthcare Corporation 10019-360-40
0.01 M Sodium citrate Fisher Scientific 1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water
Superfrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15
DAPI Fisher Scientific nuclear counterstain
Mounting medium Fisher Scientific Vectashield or Gelvatol is preferred

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
  2. Lee, D. A., et al. Tanycytes of the hypothalamic median eminence form a diet-responsive neurogenic niche. Nat. Neurosci. 15, 700-702 (2012).
  3. Lee, D. A., Blackshaw, S. Functional implications of hypothalamic neurogenesis in the adult mammalian brain. Int. J. Dev. Neurosci. 30, 615-621 (2012).
  4. Pencea, V., Bingaman, K. D., Wiegand, S. J., Luskin, M. B. Infusion of brain-derived neurotrophic factor into the lateral ventricle of the adult rat leads to new neurons in the parenchyma of the striatum, septum, thalamus, and. 21, 6706-6717 (2001).
  5. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Neurogenesis in the hypothalamus of adult mice: potential role in energy balance. Science. 310, 679-6783 (2005).
  6. Pierce, A. A., Xu, A. W. De novo neurogenesis in adult hypothalamus as a compensatory mechanism to regulate energy balance. J. Neurosci. 30, 723-7230 (2010).
  7. Ahmed, E. I., et al. Pubertal hormones modulate the addition of new cells to sexually dimorphic brain regions. Nat. Neurosci. 11, 995-997 (2008).
  8. Xu, Y., et al. Neurogenesis in the ependymal layer of the adult rat 3rd ventricle. Exp. Neurol. 192, 251-264 (2005).
  9. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Evidence for constitutive neural cell proliferation in the adult murine hypothalamus. J. Comp. Neurol. 505, 209-220 (2007).
  10. Perez-Martin, M., et al. IGF-I stimulates neurogenesis in the hypothalamus of adult rats. Eur. J. Neurosci. 31, 1533-1548 (2010).
  11. Shimogori, T., et al. A genomic atlas of mouse hypothalamic development. Nat. Neurosci. 13, 767-775 (2010).
  12. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
  13. Limoli, C. L., et al. Radiation response of neural precursor cells: linking cellular sensitivity to cell cycle checkpoints, apoptosis and oxidative stress. Radiat. Res. 161, 17-27 (2004).
  14. Monje, M. L., Mizumatsu, S., Fike, J. R., Palmer, T. D. Irradiation induces neural precursor-cell dysfunction. Nat. Med. 8, 955-962 (2002).
  15. Wojtowicz, J. M. Irradiation as an experimental tool in studies of adult neurogenesis. Hippocampus. 16, 261-266 (2006).
  16. Mizumatsu, S., et al. Extreme sensitivity of adult neurogenesis to low doses of X-irradiation. Cancer Res. 63, 4021-4027 (2003).
  17. Snyder, J. S., Hong, N. S., McDonald, R. J., Wojtowicz, J. M. A role for adult neurogenesis in spatial long-term memory. Neuroscience. 130, 843-8452 (2005).
  18. Santarelli, L., et al. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science. 301, 805-809 (2003).
  19. Saxe, M. D., et al. Ablation of hippocampal neurogenesis impairs contextual fear conditioning and synaptic plasticity in the dentate gyrus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17501-17506 (2006).
  20. Duan, W., et al. Sertraline slows disease progression and increases neurogenesis in N171-82Q mouse model of Huntington's disease. Neurobiol. Dis. 30, 312-322 (2008).
  21. Rola, R., et al. Radiation-induced impairment of hippocampal neurogenesis is associated with cognitive deficits in young mice. Exp. Neurol. 188, 316-330 (2004).
  22. Hellstrom, N. A., Bjork-Eriksson, T., Blomgren, K., Kuhn, H. G. Differential recovery of neural stem cells in the subventricular zone and dentate gyrus after ionizing radiation. Stem Cells. 27, 634-641 (2009).
  23. McGinn, M. J., Sun, D., Colello, R. J. Utilizing X-irradiation to selectively eliminate neural stem/progenitor cells from neurogenic regions of the mammalian brain. J. Neurosci. Methods. 170, 9-15 (2008).
  24. Panagiotakos, G., et al. Long-term impact of radiation on the stem cell and oligodendrocyte precursors in the brain. PLoS One. 2, e588 (2007).
  25. Shinohara, C., Gobbel, G. T., Lamborn, K. R., Tada, E., Fike, J. R. Apoptosis in the subependyma of young adult rats after single and fractionated doses of X-rays. Cancer Res. 57, 2694-2702 (1997).
  26. Tada, E., Parent, J. M., Lowenstein, D. H., Fike, J. R. X-irradiation causes a prolonged reduction in cell proliferation in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience. 99, 33-41 (2000).
  27. Tada, E., Yang, C., Gobbel, G. T., Lamborn, K. R., Fike, J. R. Long-term impairment of subependymal repopulation following damage by ionizing irradiation. Exp. Neurol. 160, 66-77 (1999).
  28. Hopewell, J. W., Cavanagh, J. B. Effects of X irradiation on the mitotic activity of the subependymal plate of rats. Br. J. Radiol. 45, 461-465 (1972).
  29. Matinfar, M., Ford, E., Iordachita, I., Wong, J., Kazanzides, P. Image-guided small animal radiation research platform: calibration of treatment beam alignment. Phys. Med. Biol. 54, 891-905 (2009).
  30. Matinfar, M., et al. Small animal radiation research platform: imaging, mechanics, control and calibration. Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv. 10, 926-934 (2007).
  31. Matinfar, M., Iordachita, I., Ford, E., Wong, J., Kazanzides, P. Precision radiotherapy for small animal research. Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv. 11, 619-626 (2008).
  32. Matinfar, M., Iordachita, I., Wong, J., Kazanzides, P. Robotic Delivery of Complex Radiation Volumes for Small Animal Research. IEEE Int. Conf. Robot. Autom. 2010, 2056-2061 (2010).
  33. Wong, J., et al. small animal radiation research platform with x-ray tomographic guidance capabilities. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 71, 1591-1599 (2008).
  34. Armour, M., Ford, E., Iordachita, I., Wong, J. CT guidance is needed to achieve reproducible positioning of the mouse head for repeat precision cranial irradiation. Radiat. Res. 173, 119-123 (2010).
  35. Ford, E. C., et al. Localized CT-guided irradiation inhibits neurogenesis in specific regions of the adult mouse brain. Radiat. Res. 175, 774-783 (2011).
  36. Redmond, K. J., et al. A radiotherapy technique to limit dose to neural progenitor cell niches without compromising tumor coverage. J. Neurooncol. 104, 579-587 (2011).
  37. Fike, J. R., Rola, R., Limoli, C. L. Radiation response of neural precursor cells. Neurosurg. Clin. N. Am. 18, 115-127 (2007).
  38. Bauer, S., Hay, M., Amilhon, B., Jean, A., Moyse, E. In vivo neurogenesis in the dorsal vagal complex of the adult rat brainstem. Neuroscience. 130, 75-90 (2005).
  39. Hourai, A., Miyata, S. Neurogenesis in the circumventricular organs of adult mouse brains. J. Neurosci. Res. 91, 757-770 (2013).
  40. Bennett, L., Yang, M., Enikolopov, G., Iacovitti, L. Circumventricular organs: a novel site of neural stem cells in the adult brain. Mol. Cell. Neurosci. 41, 337-347 (2009).
  41. Gleiberman, A. S., et al. Genetic approaches identify adult pituitary stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6332-6337 (2008).
  42. Goldman, S. A., Nottebohm, F. Neuronal production, migration, and differentiation in a vocal control nucleus of the adult female canary brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 2390-2394 (1983).
  43. Chow, J. C., Leung, M. K., Lindsay, P. E., Jaffray, D. A. Dosimetric variation due to the photon beam energy in the small-animal irradiation: a Monte Carlo study. Med. Phys. 37, 5322-5329 (2010).
  44. Maeda, A., et al. In vivo optical imaging of tumor and microvascular response to ionizing radiation. PLoS One. 7, e42133 (2012).
  45. Vasireddy, R. S., et al. Evaluation of the spatial distribution of gammaH2AX following ionizing radiation. J. Vis. Exp. (42), e2203 (2010).
  46. Short, S. C., et al. DNA repair after irradiation in glioma cells and normal human astrocytes. Neuro. Oncol. 9, 404-411 (2007).
  47. Gavrilov, B., et al. Slow elimination of phosphorylated histone gamma-H2AX from DNA of terminally differentiated mouse heart cells in situ. Biochem. Biophys. Res. Commun. 347, 1048-1052 (2006).
  48. Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat. Res. 165, 155-164 (2006).
  49. Jacques, R., Taylor, R., Wong, J., McNutt, T. Towards real-time radiation therapy: GPU accelerated superposition/convolution. Comput. Methods Programs Biomed. 98, 285-292 (2010).
  50. Chaichana, K. L., Levy, A. P., Miller-Lotan, R., Shakur, S., Tamargo, R. J. Haptoglobin 2-2 genotype determines chronic vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Stroke. 38, 3266-3271 (2007).
  51. Mah, L. J., et al. Quantification of gammaH2AX foci in response to ionising radiation. J. Vis. Exp. (38), e1957 (2010).
  52. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  53. Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
  54. Tryggestad, E., Armour, M., Iordachita, I., Verhaegen, F., Wong, J. W. A comprehensive system for dosimetric commissioning and Monte Carlo validation for the small animal radiation research platform. Phys. Med. Biol. 54, 5341-5357 (2009).
  55. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  56. Tuli, R., et al. Development of a novel preclinical pancreatic cancer research model: bioluminescence image-guided focal irradiation and tumor monitoring of orthotopic xenografts. Transl. Oncol. 5, 77-84 (2012).
Функциональная Допрос взрослых гипоталамуса нейрогенеза с Focal радиологической ингибирования
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D. A., Salvatierra, J., Velarde, E., Wong, J., Ford, E. C., Blackshaw, S. Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition. J. Vis. Exp. (81), e50716, doi:10.3791/50716 (2013).More

Lee, D. A., Salvatierra, J., Velarde, E., Wong, J., Ford, E. C., Blackshaw, S. Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition. J. Vis. Exp. (81), e50716, doi:10.3791/50716 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter