Функциональная Допрос взрослых гипоталамуса нейрогенеза с Focal радиологической ингибирования

Summary

Функция взрослых, родившихся нейронов млекопитающих остается активной областью исследования. Ионизирующее излучение подавляет рождение новых нейронов. Использование компьютерной томографии наведением фокусное облучение (CFIR), трехмерные анатомические нападения на конкретных нейронных популяций предшественников теперь могут быть использованы для оценки функциональной роли взрослого нейрогенеза.

Abstract

Функциональная характеристика взрослых, родившихся нейронов остается сложной задачей. Подходы к ингибирует нейрогенез через инвазивной вирусной поставки или трансгенных животных имеют потенциальные путает, которые делают интерпретацию результатов этих исследований трудно. Новые радиологические инструменты появляются, однако, что позволяют неинвазивно исследовать функцию отдельных групп взрослых, родившихся нейронов через точной и достоверной анатомической адресности в мелких животных. Фокусное ионизирующего излучения подавляет рождение и дифференцировку новых нейронов, и позволяет адресности конкретных регионах нейронных предшественников. Для того, чтобы осветить потенциальное функциональную роль, что взрослые гипоталамо нейрогенез играет в регуляции физиологических процессов, мы разработали неинвазивный фокусное технику облучения они избирательно ингибируют рождение взрослых, родившихся нейронов в гипоталамо срединного возвышения. Мы опишем метод для C omputer томография наведениеме Ocal ИК-излучения (CFIR) доставка для точного и точную анатомическую ориентации у мелких животных. CFIR использует трехмерную объемную руководство изображения для локализации и адресности дозы облучения, минимизирует радиационного облучения nontargeted областях мозга, и позволяет конформной распределения дозы с границами острыми пучка. Этот протокол позволяет задать вопросы относительно функции взрослых, родившихся нейронов, но и открывает области на вопросы в областях радиобиологии, биологии опухоли, и иммунологии. Эти радиологические инструменты будут содействовать переводу открытий на скамейке к постели.

Introduction

Недавние открытия показали, что мозг взрослого человека млекопитающих может пройти значительную степень пластичности. Нейроны взрослых, родившихся генерируются в течение взрослой жизни в специализированных нишах мозге млекопитающих ^1. Что такое функция этих взрослых, родившихся нейронов? И тем более, они играют важную роль в физиологии и поведения? Исследования на эту тему традиционно сосредоточены на субвентрикулярной зоне боковых желудочков и под зернистым зоне гиппокампа, однако недавние исследования характеризуется нейрогенез в других регионах мозга, таких как гипоталамус млекопитающих ^2. Нейрогенез сообщалось в послеродовом и взрослых гипоталамуса ^2-10, и функция этих новорожденных нейронов гипоталамуса остается активной областью исследования.

Функциональная характеристика взрослых, родившихся нейронов остается сложной задачей для области нейронаук в целом. Селективное ингибирование спецификацииБР нейронные популяции предшественников остается ограниченным из-за отсутствия доступных молекулярных маркеров, которые уникальны для отдельных нейронных популяций предшественников ^11. Таким образом, избирательное удаление взрослых, родившихся нейронов из этих нервных клеток-предшественников через генетического таргетинга по-прежнему трудно. Кроме того, вирусная доставка целевой взрослых, родившихся нейронов страдает от потенциальных вмешивающихся факторов, таких как введение травмы и воспаления в окружающую среду ^12.

Новые радиологические инструменты появляются, однако, что позволяют обойти эти смешивает и исследовать эти вопросы через точной и достоверной анатомической адресности в мелких животных. Ионизирующее излучение подавляет рождение и дифференцировку новых нейронов, и позволяет неинвазивным методом целевой популяциями нейронов предшественников ^13-15. В последнее время мы описали зародышевый область млекопитающих гипоталамо срединного возвышения (ME), что мы назвали гипоталамо пролиферативный зону (СЗЗ) ² </suр>. Мы обнаружили, что, когда молодые взрослые самки мышей были даны высоким содержанием жиров (HFD), уровни нейрогенеза в HFD-кормили мышей были существенно выше, чем их нормального чау (NC) кормили управления в этой ME области ^2. Чтобы проверить, регулирует ли взрослый нейрогенез в гипоталамо МНЕ обмен веществ и вес, мы пытались сорвать этот процесс. Средний возвышение небольшой односторонний структура на базе третьего желудочка, из которого регулирующие гормоны освобождены. Для того, чтобы ингибировать пролиферацию и последующий нейрогенез без изменения других физиологических функций этой области мозга, мы разработали неинвазивный фокусное технику облучения они избирательно ингибируют рождение новорожденных взрослых нейронов в гипоталамо срединного возвышения ^2.

Ряд групп использовали излучение для подавления нейрогенеза в канонических областях ^14-28. Однако, предыдущие радиологические подходы, как правило, направлены большие площади, или Ofteн непреднамеренно также направлены несколько областей мозга, где нейрогенез Сообщалось, что затрудняет однозначно связать любые поведенческие недостатков, отмеченных с дефектами в конкретных нейронных популяций предшественников. Способность к более целенаправленной облучения обеспечивается радиологических платформ, которые сочетают C omputer томографии наведением изображений с е Öçal луч ИК-излучения (CFIR) поставки для точного анатомические таргетинга ^29-36. Радиационные лучи, как маленькие, как 0,5 мм в диаметре доступны для решения конкретных нейронных популяций предшественников ^35. Эта методология позволяет целевой гипоталамо ME и арестовать пролиферацию и блокировать нейрогенез у мелких животных. После лучевой терапии на этих популяций предшественников, физиологические и поведенческие тесты могут быть выполнены, чтобы осветить потенциальное функцию взрослых, родившихся клеток. Фокусное таргетинг особенно важно для нашего приложения, так какгипофиз находится недалеко от гипоталамуса срединного возвышения; облучение гипофиза может повлиять гормональную функцию, а затем смешал результаты.

Биологическая основа для подавления нейрогенеза после облучения все еще остается неясным. Предыдущие исследования излучения полагались на крупных пучков области, и пришли к выводу, что подавление нейрогенеза опосредуется через воспалительной реакции ^{14, 37.} Таким образом неясно, может ли высоко фокусное облучение подавляет нейрогенез, так как он не вызывает существенного воспалительную реакцию. Однако, недавние исследования нашей группы классического нейрогенной области в гиппокампе продемонстрировали, что высоко фокусное облучение в дозе 10 Гр может подавить нейрогенез в течение по крайней мере 4 недели после облучения ^35.

Чтобы допросить функцию взрослых, родившихся нейронов гипоталамуса в срединном возвышении, мы используем точность излучения дevice способных доставлять компьютерной томографии в сочетании с пучков излучения малого диаметра для ингибирования ME нейрогенез. Использование рентгеновской трубки, прикрепленный к гентри, который вращается в диапазоне 360 °, мы предлагаем дуги луча микро облучения пучком с использованием робота контролируемой стадии образца, что позволяет вращение у животного в течение лучевой терапии (рис. 1) . С высоким разрешением рентгеновский детектор используется для получения изображения, когда козловой находится в горизонтальном положении ^33. Для этого исследования, изображения CT были реконструированы с изотропным размера воксела 0,20 мм. На бортовой съемочной КТ позволило идентифицировать цели в то время как животное находится в положении лечения. Цель была локализована с помощью дозы планирует навигационное программное обеспечение КТ, который был включен с нашим коммерчески доступного радиологического платформы. После локализации рентабельность инвестиций по компьютерной томографии, животное было перемещено в соответствующее положение лечения по роботизированной стадии образца, который имеет четыре градРис свободы (X, Y, Z, θ). Благодаря сочетанию козловых и сценических робот углами, балки могут быть доставлены из почти любом направлении по отношению к животному, и Стереотаксические дугообразных лечения возможны ^29. По этим и всем другим визуальных исследований, мыши были помещены в иммобилизации устройство, которое позволяет доставку анестетика изофлурана газа при ограничении движения. Иммобилизация кровать КТ совместимы, и подключается к роботизированной стадии образца ^34.

Мы ожидаем, что CFIR обеспечит концептуальные достижения в ряде областей исследований. Хотя мы используем радиологического нападения на гипоталамо срединного возвышения в качестве доказательства принципа этой техники, CFIR можно использовать для целевой любую область тела любого малого модельного организма в принципе. В неврологии, например, мы предполагаем этот метод может быть использован для оценки функции активно пролиферативных популяции клеток-предшественников, которые были предложены в сут в других circumventricular органов, таких, как площадь postrema ^{38, 39,} subfornical органа ⁴⁰ и гипофиза ^41. Многолетние споры, касающиеся функциональной роли взрослого нейрогенеза и выявление причинную роль в поведении могут также теперь будет лучше решать. В певчих птиц, эта техника может рассмотреть роль взрослого нейрогенеза в поддержании прочной и сезонный поведение пение птиц ^42, который был затруднен из-за способности селективно ингибировать нейрогенез в конкретных областях мозга. Понимание этого надежную модель поведения может пролить новый взгляд на роль взрослого нейрогенеза в регулировании других половой диморфизм поведения. Кроме того, в метаболической области, CFIR могут быть использованы для изучения аспектов роли пролиферации гепатоцитов и его роль в метаболизме и энергетического баланса. Возможность для концептуального заранее в нескольких научно-исследовательских дисциплин усиливается введением этой техники.

<p class= "Jove_content"> В этой статье мы продемонстрировать возможности CFIR для точного анатомического таргетирования координационного пучка облучения. Хотя мы изначально разработали этот небольшой радиационной животных исследовательскую платформу (SARRP) для наших исследований, другие подобные устройства в настоящее время коммерчески доступны, которые могут выполнить аналогичные КТ наведением фокусное облучение ^{43, 44.} Таким образом, мы обобщаем этот протокол CFIR с шагов, необходимых для всех научно-исследовательских платформ, а не, специфичные к SARRP. Преимущества CFIR по сравнению с предыдущими радиологических подходов к ингибируют нейрогенез в том, что этот метод позволяет трехмерное объемное руководство изображения для локализации и адресности дозы, конформной доза снижает воздействие nontargeted областях мозга, и геометрия высокая точность луч позволяет конформной распределения дозы с Границы острые лучевые. Мы выделяем, как использовать КТ наведением изображений целевой дозы к определенному анатомической области, и на этом, как визуализировать излучениедозы распределение непосредственно в ткани с помощью иммуногистохимического окрашивания для γ-H2AX, маркера двухцепочечной ДНК разрывов ^{35, 45-48.} Использование такого подхода для селективного облучения нейрогенных ниш может иметь существенные последствия в выявлении функциональной роли новых взрослых, родившихся нейронов на физиологии и болезней.

Protocol

Животное Статистика Получить одобрение от институциональной уходу и использованию животных комитета по протоколам стандарта уход и использование. Ток был разработан протокол для облучения координационных исследований по 5.5-10 недельных взрослых C57BL6 / J мышей, как описан?…

Representative Results

Оценка КТ наведением Таргетинг и точность Механическое калибровка системы является критическим для обеспечения того, чтобы лучи от различных углов все пересекаются в одной точке. Калибровка была выполнена с полуавтоматической метода визуализации на основе, где точност…

Discussion

КТ наведением фокусное облучение (CFIR) является новым и полным системный подход способен обеспечить поля излучения на цели в небольших животных при роботизированной контроля с использованием CT-руководство ^32. Возможность CFIR доставить высоко сфокусированные пучки малого животных…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
SARRP research platform	Xstrahl	RS225A	http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP irradiation bunker	Xstrahl		Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding
GAF chromic film	IPS	GAFchromic ETB2
Mouse phantom	Gammex	457	Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.
Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody	Millipore, Inc.	05-636	clone JBW301
High-fat rodent diet	Research Diets	D12492i	60% of the calories as fat, food should be irradiated
Isoflurane	Baxter Healthcare Corporation	10019-360-40
0.01 M Sodium citrate	Fisher Scientific		1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water
Superfrost Plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
DAPI	Fisher Scientific		nuclear counterstain
Mounting medium	Fisher Scientific		Vectashield or Gelvatol is preferred