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Neuroscience

成人下丘脑神经发生局灶性放射性抑制功能审讯

doi: 10.3791/50716 Published: November 14, 2013

Summary

成人出生的哺乳动物神经元的功能仍然是研究的活跃领域。电离辐射抑制新的神经元的诞生。利用计算机断层扫描引导下焦照射(CFIR),特定的神经祖人群的三维解剖定位,现在可以用来评估成年神经发生的功能作用。

Abstract

成人出生的神经元的功能特性仍然是一个显著的挑战。的方法来抑制成年神经发生通过病毒侵入或交付的转基因动物具有使结果的解释从这些研究很难潜在的困惑。新的放射性工具但是新兴,,,允许一个通过无创小动物准确和精确的解剖定位研究成人出生的神经元的选择组的功能。焦点电离辐射抑制新的神经元的诞生和分化,并允许特定的神经祖地区的目标。为了照亮成人丘脑神经发生中起着生理过程的调控潜在的功能作用,我们开发了一个非侵入性的焦点照射技术来选择性地抑制成年出生的神经元下丘脑正中隆起的诞生。我们描述的方法对C omputer成像制导f OCAL 红外辐射(CFIR)交付,使精确和准确的解剖小动物为目标。 CFIR使用本地化三维体积图像引导和辐射剂量的靶向,减少辐射照射到非定标大脑区域,并允许保形的剂量分布与锐波束边界。该协议允许一个问关于成人出生的神经元的功能的问题,同时也开启区域在放射生物学,肿瘤生物学,免疫学等领域的问题。这些放射性的工具将有助于发现翻译在板凳到床边。

Introduction

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最近的发现表明,成年哺乳动物大脑可以经历显着的塑性度。整个成年哺乳动物大脑1专门龛产生成人出生的神经元。什么是这些成年出生的神经元的功能?而越是这样,就它们在生理和行为产生影响?研究这个话题历来集中在侧脑室和海马的颗粒下层区的脑室下区,然而,最近的研究已经在其他脑区,如哺乳动物下丘脑2表征神经。神经发生已经报道在产后和成人丘脑2-10,和这些新生儿下丘脑神经元的功能仍然是调查的有源区。

成人出生的神经元的功能特性保持在一般的神经科学领域的显著挑战。规范的选择性抑制IFIC神经祖人群仍然有限,由于缺乏可用的分子标记所特有的单神经祖人口11。因此,选择性删除成人出生的通过基因靶向这些神经前体细胞神经元仍然很困难。同样,病毒递送到目标成人出生的神经元遭受潜在的混杂变量,如引入损伤和炎症到环境12。

新的放射性工具但是不断出现,,允许一个绕过这些的困惑,并通过在小动物准确和精确的解剖定位研究这些问题。电离辐射抑制新的神经元的诞生和分化,并允许非侵入性方法,针对神经祖人口13-15。最近,我们描述的哺乳动物下丘脑正中隆起(ME)的,我们称之为下丘脑增殖区(HPZ)2生发区2。来测试下丘脑ME内成年神经是否调节代谢和体重,我们试图扰乱这一过程。正中隆起是一个小的单边结构在第三脑室从中调节激素释放的基极。为了抑制增殖和随后的神经发生不改变该大脑区域的其他生理功能,我们开发了一个非侵入性的焦点照射技术选择性抑制下丘脑正中隆起2刚出生的成年神经元的诞生。

一些团体已采用辐射抑制典型地区14-28神经。然而,以往的影像学方法一般都针对大面积,或ofteÑ​​无意中还针对性其中神经发生已经报道多个脑区域,因此很难明确地关联起来,在特定的神经祖种群缺陷观察到的任何行为缺陷。为更有针对性的照射能力通过结合çomputer成像制导成像 f OCAL光束红外辐射(CFIR)传递来实现精确的解剖定位29-36放射性平台提供的。可针对特定的神经祖群35的辐射束小至0.5mm的直径。这种方法使我们能够针对下丘脑ME和逮捕增殖并阻止神经发生的小动物。下面就这些祖人口放射治疗,生理和行为测试可以进行照亮成人出生的细胞的潜在功能。焦点目标是为我们的应用程序,因为特别重要的脑垂体是靠近下丘脑正中隆起,垂体照射可能会影响荷尔蒙功能,随后混淆的结果。

用于神经照射后的抑制的生物学基础仍不清楚。上一页辐射的研究依赖于大面积的横梁,得出的结论是神经的抑制是通过炎症反应14,37介导的。因此,它是非常不清晰焦点照射是否能抑制神经发生的,因为它不会引起大幅度的炎症反应。然而,最近的研究本课题组在海马经典神经源性地区已经证明,用10 Gy的剂量高度聚焦照射可以抑制神经发生的至少4周照射35后。

询问在正中隆起成人出生的下丘脑神经元的功能,我们使用了精密的辐射ÐEVICE能够提供CT成像结合小直径的辐射光束,以抑制ME的神经发生。使用连接到机架旋转超过360°范围内的X射线管,我们提供电弧束微照射光束与使用机器人控制的试样台,其允许动物对象的过程中放射治疗的旋转( 图1)的。高分辨率X射线探测器来采集图像时,扫描架处于水平位置33。在这项研究中,CT图像重建为0.20毫米的各向同性体素尺寸。板载CT成像允许目标的识别,而动物是在治疗位置。使用的CT导航剂量规划软件,该软件是包含在我们的市售放射性平台,目标是局部的。通过CT成像提供本地化的投资回报率后,动物是由机器人样品台有四个度移动到适当的治疗位置自由里斯(X,Y,Z,θ)。通过龙门架和机器人阶段角度的组合,光束可 ​​以从几乎任何方向上的相对输送到动物,和立体定向圆弧状的治疗是可能的29。对于这些和所有其他的成像研究中,小鼠被放置在一个固定装置,可以让递送麻醉剂异氟烷气体的同时限制移动。固定化床是CT兼容,并且连接到所述机器人样品载物台34。

我们预计现金流利率将提供观念上的进步在很多研究领域。虽然我们使用的下丘脑正中隆起的放射性靶向作为该技术的原理证明,CFIR可以用来瞄准的原则任何微小的模式生物身体的任何区域。在神经科学,例如,我们预计这种技术可以用来评价积极增殖祖人口已建议EXIS功能吨,其他周器官,如最后区38,39,穹窿40,和垂体41。关于成年神经发生的功能性作用,并确定行为的因果作用的长期争论现在也可以更好地解决。在鸣禽,这种技术可能会解决成年神经发生在维持鸟鸣42,这已经阻碍了选择性抑制神经发生在特定的大脑区域的功能的强大和季节性行为中的作用。了解这种强大的行为模式可能揭示新的洞察成年神经发生的其他调控性二态行为的作用。可替代地,在新陈代谢字段,CFIR可以用来探索的肝细胞增殖的作用和它的代谢和能量平衡的作用的方面。可能在多个研究领域的概念提前通过引入这一技术的提高。

43,44。因此,我们推广这个现金流利率协议所要求的所有研究的平台,而不是那些具体的SARRP步骤。 CFIR超过先前放射方法的优点,以抑制神经发生的是,这种技术允许定位三维体积图像的指导和剂量的靶向,适形的剂量最小化暴露于非定标大脑区域,精度高的光束的几何形状允许保形的剂量分布与锐波束边界。我们概述了如何使用CT引导下成像剂量定向到特定的解剖区域,并在这样做时,如何以可视化的辐射用免疫组织化学染色法对γ-H2AX,DNA双链断裂35,45-48的标记物剂量直接在组织中的分布。使用这种方法的神经性龛选择性照射可能对揭示的生理和疾病的新成人出生的神经元的功能作用显著影响。

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Protocol

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动物用法

获得标准的管理和使用协议批准的机构动物护理和使用委员会。当前协议是用于在5.5-10周龄成年C57BL6 / J小鼠焦照射研究开发的,如先前所述( 2)2。然而,其他的年龄和小动物物种(大鼠,仓鼠,松鼠, 等等 )也可使用,其前提是有效的麻醉协议和放射线参考图谱允许识别的感兴趣区(ROI),该区域是可用的。

1。 CT引导下放射性平台的校准

执行基于胶片的校准为辐射剂量预先放射性平台上的每个准直器的大小和所用的X射线管的过滤器类型。为了目标照射的电弧束在所希望的目标部位,使用的辐射剂量规划软件49 availablE在大多数商业辐射平台计算的基础上辐射剂量要求的交货时间,感兴趣区域(ROI),根据鼠标的CT扫描的区域的深度,和机器人平台的旋转速度,在此细节被排除在外这个协议,因为他们的辐射平台之间的差异。用于可视化的腹侧基底丘脑2( 图3)与CT成像的目的,操作该X射线管具有0.4毫米的焦斑和100 kVp的的电子束能量为1 mm的铝过滤。为HPZ的焦点照射下,工作在225 kVp的13毫安的X射线管,并用0.15mm的铜过滤的1毫米焦斑,以提供辐射的10戈瑞为0.6厘米的组织深度过治疗4.6分钟的时间。不同的投资回报率之间的目标将需要计算不同的参数。

  1. 如果学习高脂饮食对神经发生在正中隆起的影响如前所述2,取得四周龄雌性C57BL6 / J小鼠从杰克逊实验室鼠标,每笼屋四只老鼠。从正常饮食切换到食物高脂肪的饮食五周龄。让小鼠,使其适应新的住房和食物。进行治疗的CFIR在5.5周龄。运输科达到包含放射性平台手术室。在传输过程中最大限度地减少压力水平。准备异氟醚麻醉气体室。然后,添加一个鼠标进入室内。与此同时,对于后处理准备加热垫(低设置)。
  2. 一旦鼠标下,不再回应脚垫压缩,使被摄物体的辐射平台,并放置在机器人舞台的固定床上。将受试者的口腔进入鼻锥麻醉杯,并进入牙齿咬后卫( 图1D)。躺在鼠标平放在固定的床和检查,看它是否继续维持反应迟钝。如果是这样,大盘向下鼠标在床上用纱布胶带。当鼠标录音下来到床上中,确保磁头平整水平面。这可以通过拉起耳朵,如果他们被拉平眼看来确定。当鼠标处于正确的位置,关闭铅防护罩。
  3. 使用板载软件实验者的放射性平台获取所述计算机断层扫描(这将在平台之间不同),这将提供鼠标受试者的三维解剖结构的扫描。检查以查看是否鼠标头平整水平面。如果不是,请重复步骤1.2 - 1.3直到拍摄对象的头部平整。
  4. 通过CT图像确定的投资回报率。使用一个45°角的水平面上, 如图3E中所示计算距离从ROI到颅骨的表面上。
  5. 利用机载软件,采取从上面如图4A所示的X-射线鼠标主体。然后,从放射性平台去掉鼠标,把加热垫,并监控到主动。
  6. 从冠状CT图像,计算至少三只小鼠,以确定输送的剂量平均的ROI解剖深度。如从先前的研究中,其中2照射10 Gy的给药至腹侧基底丘脑一个例子,从头骨(从45°角)的ROI的深度为0.66公分(参见图3E)。知道这一点,研究人员利用安装在他们的平台上放射剂量规划软件(DPS)来计算合适的治疗旋转速度和长度,以达到所需的剂量的投资回报率。
  7. 在确定治疗的持续时间和所述机器人阶段的旋转速度随剂量规划软件,测量计算的参数嵌入在水等效塑性模拟小鼠模型GAFCHROMIC辐射敏感膜的剂量分布。要做到这一点,嵌入了四个垂直堆叠的水相当于塑料块29的之间有三个GAFCHROMIC辐射敏感薄膜图4B所示。
  8. 将装有机器人舞台GAFCHROMIC电影模拟小鼠模型,并与新计算出的参数运行的焦点照射光束。例如,要定位的腹侧基底丘脑,输入为0.15mm的Cu过滤器,225 kVp的参数13毫安,1毫米直径的辐射束的设定,45°机架角度,130°/秒旋转,和4.6分钟实现的ROI放射剂量为10戈瑞。
  9. 下面照射,检查薄膜图案和辐射剂量强度。对于一个360°的角度旋转,并列出为目标的腹侧基底丘脑,黑圈在等角点上面的薄膜,小脆点在等角点膜,并且在等角点下方的膜更轻环对应于所述锥形的参数照射的光束给药将观察到( 图4B)。
  10. 叠加等角点GAFCHROMIC薄膜在X射线的鼠标主体从该参数是卡尔计算得到。经照射的焦点在等角点应该与所需的ROI区域重叠, 如图4C所示

另一种方法:如果难以瞄准大脑的投资回报率依旧,使用含碘造影鞘内注射,以提高在CT图像心室的可视化。为简洁起见,本程序是离开了这个协议的,但是以前描述35,50。碘造影将提供额外的心室的地标( 图5A)。

2。确定照射光束精度

进一步确认CFIR光束精度通过在组织2,35,51上的辐射束的直接可视化。要做到这一点,进行免疫组化检测γH2AX51,组蛋白和DNA双链断裂的早期标志物。鼠标受试者必须进行心脏灌流固定照射后一小时内。以下辐照ΥH2Ax的振动性,DNA修复很快随之而来,和水平显著下降35。

  1. 重复步骤1.1 - 1.3。
  2. 后的目标是确定在CT上,鼠标主体下的机械手控制移动对准这个目标与辐射传递光束。输入计算参数(转速和治疗时间的长度,以达到所需的剂量)从步骤1.6成剂量规划软件,并开始治疗。治疗交付与龙门指出从垂直45°,当鼠标绕一个垂直取向的轴线。
  3. 照射后,对小鼠进行科目穿心灌注。 1小时52内进行灌注。继在4%PFA / PBS灌注,浸泡修复大脑,并在4℃下轻轻摇动过夜
  4. 第二天早上,洗5分钟,在PBS 3倍,除去多聚甲醛固定液。然后,浸泡在1×PBS中30%蔗糖上的摇杆在4℃下
  5. 轻轻摇动,在4°C(我们请手动12-16小时),直到大脑沉到管底。这可作为冷冻保护的一步。一旦大脑下沉,取出大脑穿孔勺子,以防止多余的30%sucrose/1x PBS转移。快速嵌入在干冰冷冻介质。漩涡冷冻介质使用的枪头和塑料模具使大脑。
  6. 一旦完全冻结,脑块传送到-20℃冰箱保存。
  7. 上时,免疫组织化学将被执行的那天,部分冠,在40微米厚,并漂浮到24孔板中含有PBS用薄画笔。段应保持在正确的串行顺序为免疫染色,以确定目标区域的照射范围。
  8. Prewarm的0.01M柠檬酸钠溶液至80℃,在水浴中制备用于抗原修复步骤。同时,而柠檬酸钠预热,进行5分钟清洗3倍的0.01 M的PBS。
  9. 一旦柠檬酸钠溶液在80℃下,浸入脑切片我n中的柠檬酸钠缓冲溶液。留在水浴中于80℃下反应1小时。
  10. 删除部分,并允许柠檬酸钠溶液达到室温,然后在0.01 M的PBS进行3个5分钟的清洗。
  11. 阻断大脑切片进行1小时的PBS-的Triton含5%正常山羊血清。
  12. 孵育含5%正常山羊血清以1:700浓度小鼠抗磷酸化H2AX的初级抗体在4℃下脑切片过夜在PBS-的Triton
  13. 第二天,进行15分钟,洗涤3倍于0.01M PBS-的Triton。
  14. 孵育脑切片包含与缀合了488纳米fluorphore在1:500的浓度为2小时的山羊抗小鼠第二抗体5%正常山羊血清的PBS-的Triton。
  15. 进行15分钟洗涤3倍的0.01 M的PBS,海卫一。
  16. 10分钟进行可视化核执行4',6 - 二脒基-2 - 苯基吲哚(DAPI)染色(在PBS中1:5000)。然后,洗脑切片5分钟,用PBS洗涤。
  17. 安装在静电通道arged显微镜载玻片在PBS中浮动部分。擦去多余的PBS中,并允许片干燥。使用封固剂盖玻片的载玻片,并允许滑动到在黑暗中在室温下干燥过夜。
  18. 利用荧光显微镜连续冠状切片图像。 ΥH2Ax免疫染色(绿色)指示网站的照射。 DAPI(蓝色)是一种核染色( 图5B)。

3。鼠标的制备主题为焦点照射

检查ΥH2Ax免疫染色的结果。一旦满意的校准和照射光束瞄准,进行该项实验。在这一点上,对待鼠标(从动物设置梁竣工交付)所需的总时间是10 Gy的治疗用1毫米束约10-15分钟。

  1. 四阶周龄C57BL6 / J雌性小鼠杰克逊鼠标实验室。房子四只小鼠每笼,并从正常饮食食品切换到高脂肪饮食五周龄。耳朵打孔老鼠给他们独特的识别标记。每天监测小鼠的健康。注意:金属标记物不能使用,因为它们将导致在划线上的CT伪影。
  2. 称取小鼠辐射或假治疗的前一天。小鼠分割成两个同伙的辐射或假治疗,并确保有同伙之间的重量没有显著差异。在治疗的日子,当老鼠是六周大,再次称重所有小鼠,并记录它们的质量。轻轻地运送两个同伙到放射性平台。小心,尽量减少压力水平。
  3. 准备异氟醚麻醉气体室。麻醉两只老鼠,一个预定的照射组,而另一个在假手术对照组。准备加热垫的术后治疗低设置中设置。
  4. 按照步骤1.2 - 1.4鼠标接收照射。对于假鼠标,鼠标保持在麻醉室,同时治疗是怎么回事。让河畔Ë的麻醉室靠近CFIR平台等环境辐射的任何影响都考虑进去后,目标被确定在CT上,移动鼠标主题下机器人控制,以使这一目标与辐射传递光束。输入计算参数(转速和治疗时间的长度)成剂量规划软件。
  5. 一旦照射治疗不彻底,同时返回假和照射小鼠加热垫,并监视,直到他们醒来。
  6. 同时返回假和照射小鼠动物设施。监控每一天。称取小鼠每半星期。以确认目标丘脑增殖区的照射下,管理的BrdU腹腔注射(50毫克/千克)3天后处理和检查由下列初始的BrdU曝光colabeling免疫组化的BrdU和神经元标记一个月组之间的神经发生( 图6) 2。

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Representative Results

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评估CT引导下定位和准确度

该系统的机械校准对于确保从不同角度的光束都相交在一个点的关键。校准是通过一半自动的基于成像的方法,其中端至端的对准精度被测量为0.2mm 29。由于下丘脑正中隆起结构的体积小2此精度是非常关键的。为了测试这一点校准,我们测量的剂量分布具有嵌入在水等效塑性模拟小鼠模型35( 图4B)GAFCHROMIC辐射敏感薄膜。简单地说,鼠标主体的CT扫描拍摄,我们的腹侧丘脑目标站点​​被确定。输送和旋转速度进行计算,并相应准直器和过滤附以确保辐射的10 Gy的交付。有模拟鼠标模型由水equivalen设计然后,替换为真实鼠标受测量的剂量分布在不同的焦平面嵌入GAFCHROMIC辐射敏感膜吨塑料结构。 图4B示出从与1毫米直径的束的弧处理端-端的测试结果使用GAFCHROMIC电影在一个模拟鼠标的平台。龙门架被设置在45°角相对于所述模拟小鼠模型,而机器人样品载物台是围绕垂直定向的轴线旋转时,产生一个“弧”或辐射锥。半最大值(FWHM)的全宽为2.31毫米,这是大于1.0mm,因为弧撞击在薄膜成一角度。理论上的光束尺寸在此角度应为2.0毫米。在图4所示的焦点束斑表明从不同方向光束的精确对准。这个膜可以被叠加在真实鼠标主体的顶部,显示了光束位置和精度( 图4C)。

e_content“>采用1毫米直径的光束准直器,电弧技术被用于递送10戈瑞到在我们的鼠标主体目标点。上测量29表明,这种技术提供了非常低的辐射剂量(<0.1 Gy)进行了1以外毫米目标。垂体和周围结构的区域,因此有效地从腹侧基底丘脑焦照射遮蔽。光束定位的精确度进行了测量在以前的研究是在0.2 mm的虚线测试29及切片35

虽然不是必需的,CT引导下的投资回报率的目标可以通过鞘内注射碘造影,以提高增强CT引导下定位为我们的大脑的应用程序( 图5A)。因为这是一种侵入性和麻烦的手续,这种对比是不经常使用的,并且在该协议不作描述。这个协议的细节可以在福特等人。201找到1和Chaichana 等人,2007。这种碘化造影的优点是,横向和第三脑室清楚地显现在获得的一个CFIR放射性平台( 图5A)的CT扫描。目标是正中隆起,在第三脑室的基础上,并利用CT引导下的导航软件,并自动导入到机器人定位接口被确定。骨性颅腔结构进行了鉴定,并作为解剖标志进行后续研究,其中碘造影未就业。

光束定位验证与γ-H2AX

为了进一步证实我们的CT引导下丘脑ME的目标,我们通过所产生的照射下双链DNA断裂的间接检查可视化的1毫米的光束照射在组织。 DNA双链断裂后,H2AX组蛋白被磷酸化。 γ-H2AX已被广泛用于在脑和其他组织中46 -48,和γ-H2AX +灶的数量似乎与辐射相关性以及剂量在很宽的剂量范围51,53。我们观察到清晰的光束可 ​​视下列γ-H2AX免疫染色( 图5B)。合成γ-H2AX染色显示预期的位置的精确定位。梁边缘也十分锐利,与基于胶片的物理调试测量,指示为0.3毫米54 20-80%半影协议。我们先前测量的预定的目标和可视化中的组织切片35的光束的中心之间的距离。梁的中心,距离预期目标由0.19±0.36 mm(标准差)在10照射小鼠的保理组织收缩的固定和加工过程中35后的效果,平均距离为抵销。

使用立体状的圆弧治疗由电弧在从垂直45°,我们表明我们能够有效地针对腹侧丘脑,无辐射等神经性龛( 图5C-D)。周边区域的辐射是最小的,并且有一个在辐射暴露的边界就证明了GAF致变色膜( 图4B)和γ-H2AX免疫染色( 图5B-D)。组织背侧丘脑ME表示光γ-H2AX的染色( 图5B),因为通过此区域即使较硬的X射线束,使用(225 kVp的辐射光束进入,因为增强了重叠的骨,并且还可能, 0.15毫米铜过滤)。

作用于神经再生

一旦确认了CT引导下照射递送的特异性,我们研究了照射10 Gy的上ME神经发生的水平的影响。成年小鼠喂食高脂肪的饮食,接收到的辐射或假处理,并随后的BrdU注射如前所述开始于6周龄2。第一次的BrdU注射后10周龄处死检查小鼠,一个月。照射HFD喂养的成年小鼠表现出〜85%的抑制率ME的神经发生与假处理的对照相比( 6A)2。弓状核,相邻结构接壤的照射部位,被检查的变化在神经发生,并发现有辐射的动物和假手术对照组之间无统计学显著差异( 6A)2。

成人出生的正中隆起下丘脑神经元功能

改变照射和假小鼠进行了检查治疗后。毛皮大衣和响应触摸表现正常。一个化学面板和全血细胞计数板1周进行了检查下面的照射治疗,并没有显著差异(N = 9/group)。高脂喂养小鼠,我们观察到在成年出生的ME的神经元的减少〜85%后一个月照射( 图6A),照射小鼠已经减少体重增加随着时间的推移相对于假治疗组( 图6C)。与此相反,正常饲料喂养的对照组小鼠,其中ME观察到神经水平比他们高脂肪喂养的同行2显著降低,没有虚假与照射组( 图6B)之间的重量在统计学上显著差异。有趣的是,这减少了体重增加在照射高脂肪喂食老鼠是伴随着在细节由我们的组2( 图6D-I)中的代谢和活性的改变。

图1
图1。电脑断层导引聚焦照射(CFIR)平台。 一 )CFIR采用了能够提供CT引导下照射小束精确放射设备。一CFIR平台的一个例子是小动物辐射研究平台(SARRP)。与铅屏蔽(如图所示),则SARRP站81英寸(高)58英寸(宽度)在41英寸(深度)在5170磅。 (B)使用附连到机架旋转360°的双源的X射线管中,SARRP使用机器人控制样品载物台,使整个放射治疗的动物对象的旋转。 (C)CFIR硬件是由一个X射线源,准直器,转动机架,动物支撑,旋转机器人样品载物台,和电子成像器。 (D)该鼠标主体被放置在一个固定床上用在机器人试样台麻醉气体输入。从护甲 。 2010 ( 五)CFIR硬件应包括可定制的准直锥焦红外辐射传递不同大小的。 点击这里查看大图

图2
图2。实验范式。雌性C57BL / 6小鼠购自杰克逊实验室鼠标下令,让大鼠适应居民在笼子四周大。鼠须被切换到自由采食高脂肪的饮食五周龄,并分成两个治疗组:照射或假的同伙。生理评估,采取纵向之前和之后的治疗。照射或假治疗给药为5.5周。腹腔注射的BrdU六周龄分别给予如前所述2。

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图3。关注本地化的下丘脑增殖区(HPZ) 的区域。,位于下丘脑正中隆起神经性区域,位于腹侧mediobasal丘脑。 (可从:( )感兴趣区(ROI)的HPZ区域由红色十字线从艾伦脑图谱数据门户(7.041,7.211,5.564位置)的三维尼氏参考图集容积强调包含http:// mouse.brain-map.org / )55。在19日龄小鼠的投资回报率(B)冠状脑切片。的BrdU免疫组化(绿色)表明,投资回报率(白箭头)包含增殖细胞。增殖细胞中的HPZ密度被限制在从前到后轴上,密度最高为-1.75毫米前囟门。组织切片反用DAPI染色细胞核标记(蓝色)。图由Lee 等人。2012A。在CFIR平台(CE)的CT成像可通过电弧光辐射传递瞄准HPZ投资回报率(红色十字线)。 CT图像在水平面上(C),矢状面(D)和冠状面(E)鼠标主体。从头骨到投资回报率的表面(E)距离为0.62公分(红线)。比例尺= 1毫米(A),50微米(B)和0.62公分(CE)。 点击这里查看大图

图4
图4。校准辐照交付(A)X射线鼠标主体固定在上SARRP机器人舞台上固定装置。 二)投资回报率计算一个坐标重新输入的和有针对性的对一个模拟小鼠模型。假想模型是由嵌入的水当量塑性GAFCHROMIC辐射敏感薄膜。电影上面的位置,在,而根据投资回报率等中心检测的剂量分布。从SARRP A 45°弧辐射束提供了一个锥形的剂量分布到ROI,并收敛于等角点(半影部位)。 (C) 叠加获得的具有1毫米的辐射束中的虚线与透视一个真正的鼠标主体(黄线)的剂量测定膜的。白色的圆圈(箭头)表示10 Gy的辐射剂量灶性针对性地HPZ。虚线勾勒的大脑。面板由Lee 等人。2012A。

图5
图5。辐射交货 CT成像与碘造影证实能增强投资回报率的可视化,如果正常的CT成像不sufficË。 (A) 收到鼠标科目碘对比如前所述(面板Lee 等人从2012)。在冠状,水平和矢状面CT图像显示左到右。可以通过免疫组化γH2AX,DNA双链断裂的标志物来检测组织的辐射传递二)确认。 γH2AX免疫染色显示有针对性地在腹mediobasal丘脑ROI的HPZ辐射光束传输。 γH2AX免疫染色未在侧脑室(C),或同一小鼠受试者的海马(D)的颗粒下层区域的脑室下区观察到。 (BD) 部分是经DAPI染色(从李某等人。2012A) 点击这里查看大图


图6。 ME的神经导致体重和新陈代谢的改变焦距的抑制作用。(一 )位于腹侧mediobasal丘脑正中隆起(ME)是有针对性的进行照射。弓状核进程(ARCn)是相邻的解剖结构。一个月的治疗后,的BrdU +胡神经元的假辐照与同伙的百分比分别用免疫组化在ME和ARCN量化。 ME的神经发生水平照射被显著降低与假手术组群(N = 5/cohort,*** = P <0.0001)。 ARCN神经发生水平未受影响(N = 3/cohort,ns =不显著)。 二)正常饲料喂养(NC)和(C),高脂肪喂养(HFD)的小鼠进行了检查纵向的重量变化下照射或假treatm耳鼻喉科(B, N = 12/cohort,C组 ,n = 9/cohort)。 (DE)后1个月的治疗,辐照和假治疗高脂喂养的小鼠,通过定量磁共振波谱为%脂肪量和%瘦肉质量的分析研究。照射小鼠有显著较少%脂肪量和瘦体重显著以上%,比假对照组(n = 5,* = P <0.05)。总质量:(深)21.0±0.3克,(辐射)18.86±0.4克;精益质量:(深)14.6±0.2克,(辐射)13.9±0.3克,脂肪质量:(深水埗)3.9±0.2克,(辐照)2.6±0.3 G(N = 5,* = P <0.05)。 (FI) 辐照和假治疗的成年小鼠被放置在一个全面的实验动物监测系统(蛤蜊)食物的摄入,身体活动和全身的代谢谱治疗两周后的同时测量。继在驯化试验室,照射小鼠,观察到有SIgnificantly更大的能量消耗,总的活性,和VO 2(毫升/千克/小时),一天中的暗部时相比,假手术对照组(n = 11,12; * = P <0.05)。 (G) 无显著差异,观察呼吸交换率(RER)(N = 11,12)。子图A从先前公布的李某等人。2012A和Lee 等人。2012B数据生成的。从李某等人。2012A子图的CI。 点击这里查看大图

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CT引导下焦照射(CFIR)是一种新型的,完整的系统方法能够使用CT-32的指导提供辐射场为目标,在机器人控制的小动物。 CFIR的交付高度集中的光束,以小动物模型的功能提供了新的研究机会弥合实验室研究和临床翻译。本文介绍了精确的辐射交付现金流利率的方法来专门针对下丘脑神经祖人口。我们在这里展示了如何通过免疫组化通过X线片和脑组织中校准和确认辐射传递特异性。

此外,我们显示了如何这种技术可以用来抑制神经发生在一个特定的大脑区域。我们证明了我们有能力为目标的腹侧丘脑,抑制神经发生在正中隆起,而不改变神经发生在邻近结构的水平。的M抑制ë神经发生是伴随着变化的代谢和活性,以及对高脂肪的饮食降低体重增加照射与假治疗组( 6)2。这些数据表明,这些成人出生的下丘脑神经元在调节代谢和能量平衡的作用。此外,它表明,过量高脂肪的饮食可以甚至在成年期3改变关键代谢电路。我们的研究结果代表了成人出生的神经元的功能已知的一个重要扩展,并揭示了一个新的下丘脑神经祖人口3光。潜在的警告,以这种方法是照射抑制祖细胞的增殖,而不是神经本身,因而也有可能是生理上的变化后处理,可以部分地由其他成体细胞发生破坏核算。今后的步骤将包括遗传工具的发展,以抑制这种特定的神经祖p的增殖opulation,这将提供大量的清晰度的功能作用这些祖细胞和生理学3的调节它们的后代的发挥。

两者合计,然而,这放射性平台作为在神经祖细胞及其后代进行中等通量筛选的重要抓手。这种放射技术并不仅限于然而,研究问题在神经科学,和我们预期现金流利率,扩大概念提前在一些研究学科。市售售CT引导下放射性平台最近推出提供了一个机会,让研究人员能够利用这个平台,这些功能对他们研究的问题( 图1)。几个备选方案是市售允许一个执行图像引导小动物照射。此外,CT引导下焦照射系统也可以建在房子,如与用于这些S中的系统的情况下tudies在约翰霍普金斯大学29-33,35。

进行这种程度的重点目标,需要适当的校准和投资回报率的目标。虽然这种技术将首先参加培训,以熟悉CFIR平台及其剂量规划软件,该设备的操作是了解该平台的协议和功能后,比较容易。建议操作实践校准辐射束多次运行满量程纵向实验之前。这就是说,在CFIR的一次操作流畅,调查研究应该迅速采取行动。

本文所述的这个CFIR协议使用本地化三维体积图像的指导和剂量的靶向。适形剂量减少暴露于非定标大脑区域,及高精度光路结构,使得适形剂量分布与锐波束边界。这允许一个提问regardi纳克成年出生的神经元的功能,但也可打开区域问题,细胞增殖在如生理学,肿瘤生物学和免疫学方面的作用。此方法可以以多种方式进行扩展与对比染料和生物发光,以提高可视化35,56。的努力,现在正在进行中,以提高CFIR硬件能力进一步,平台现在被修改为包括一个板上正电子发射断层扫描仪56。这些将有利于提供给研究人员,并有助于发现翻译在板凳到床边工具的扩展。

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Disclosures

JW与Xstrahl,公司的一个研究经费和咨询协议

Acknowledgments

我们感谢C. Montojo,J.雷耶斯,和M.装甲的技术咨询和援助。这项工作是由卫生部授予F31 NS063550美国国家卫生院(以DAL),一个罗勒奥康纳入门学者奖和补助金从Klingenstein基金和NARSAD(对某人)的支持。 SB是一个WM凯克杰出青年学者在医学研究。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SARRP research platform Xstrahl RS225A http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP irradiation bunker Xstrahl Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding
GAF chromic film IPS GAFchromic ETB2
Mouse phantom Gammex 457 Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.
Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody Millipore, Inc. 05-636 clone JBW301
High-fat rodent diet Research Diets D12492i 60% of the calories as fat, food should be irradiated
Isoflurane Baxter Healthcare Corporation 10019-360-40
0.01 M Sodium citrate Fisher Scientific 1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water
Superfrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15
DAPI Fisher Scientific nuclear counterstain
Mounting medium Fisher Scientific Vectashield or Gelvatol is preferred

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成人下丘脑神经发生局灶性放射性抑制功能审讯
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Lee, D. A., Salvatierra, J., Velarde, E., Wong, J., Ford, E. C., Blackshaw, S. Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition. J. Vis. Exp. (81), e50716, doi:10.3791/50716 (2013).More

Lee, D. A., Salvatierra, J., Velarde, E., Wong, J., Ford, E. C., Blackshaw, S. Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition. J. Vis. Exp. (81), e50716, doi:10.3791/50716 (2013).

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