Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Funktionel Interrogation Adult Hypothalamus Neurogenese med Focal Radiological Hæmning

doi: 10.3791/50716 Published: November 14, 2013

Summary

Funktionen af ​​pattedyr neuroner voksen-fødte er fortsat et aktivt område af undersøgelsen. Ioniserende stråling hæmmer fødslen af ​​nye neuroner. Ved hjælp af computer tomografi-guidede omdrejningspunkt bestråling (CFIR), kan tre-dimensionelle anatomisk målretning af specifikke neurale progenitorpopulationer nu bruges til at vurdere den funktionelle rolle af voksne neurogenese.

Abstract

Den funktionelle karakterisering af voksne født neuroner fortsat en stor udfordring. Tilgange til at hæmme voksen neurogenese via invasive viral levering eller transgene dyr har potentielle confounds der gør fortolkning af resultater fra disse undersøgelser vanskelig. Nye radiologiske værktøjer dukker dog, at tillader en at noninvasively undersøge funktionen af ​​udvalgte grupper af voksne-fødte neuroner gennem nøjagtig og præcis anatomisk målretning i små dyr. Focal ioniserende stråling hæmmer fødsel og differentiering af nye neuroner og tillader målretning af specifikke neurale progenitor regioner. For at belyse den potentielle funktionelle rolle, at voksne hypothalamus neurogenese spiller i reguleringen af ​​fysiologiske processer, vi udviklede en invasiv omdrejningspunkt bestråling teknik til selektivt at hæmme fødslen af ​​voksen-fødte neuroner i hypothalamus median eminence. Vi beskriver en metode til C omputer tomografi-vejledtf ocal ir stråling (CFIR) levering for at muliggøre præcis og nøjagtig anatomisk målretning i små dyr. CFIR bruger tre-dimensionelle volumetrisk billede vejledning til lokalisering og målretning af den strålingsdosis, minimerer bestråling nontargeted områder af hjernen, og giver mulighed for konform dosisfordeling med skarpe stråle grænser. Denne protokol tillader en at stille spørgsmål om funktionen af ​​voksen-fødte neuroner, men åbner også områder til spørgsmål omkring radiobiologien, tumor biologi og immunologi. Disse radiologiske værktøjer vil lette oversættelsen af ​​opdagelser på bænken til sengekanten.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nylige opdagelser har vist, at pattedyrs hjerne voksen kan undergå en bemærkelsesværdig grad af plasticitet. Voksen-fødte neuroner er genereret gennem hele voksenlivet i specialiserede nicher af pattedyrhjernen 1.. Hvad er funktionen af ​​disse voksen-fødte neuroner? Og så meget mere, de spiller en rolle i fysiologi og adfærd? Undersøgelser om dette emne har traditionelt fokuseret på subventricular zone af de laterale ventrikler og subgranular zone af hippocampus, men de seneste undersøgelser har karakteriseret neurogenese i andre områder af hjernen, såsom pattedyr hypothalamus 2. Neurogenese er blevet rapporteret i den postnatale og voksne hypothalamus 2-10, og funktionen af disse nyfødte hypothalamus neuroner forbliver et aktivt område af undersøgelsen.

Den funktionelle karakterisering af voksen-fødte neuroner er fortsat en stor udfordring for neurovidenskab felt i almindelighed. Selektiv hæmning af specIFIC neurale progenitorpopulationer fortsat begrænset af manglen på tilgængelige molekylære markører, der er unikke for enlige neurale progenitorpopulationer 11. Derfor er det stadig svært selektiv sletning af voksen-fødte neuroner fra disse neurale stamfædre via genetisk målretning. Ligeledes viral levering at målrette voksen-fødte neuroner lider potentielle konfoundere såsom indførelse af skader og betændelse i miljøet 12..

Nye radiologiske værktøjer dukker dog, at tillader en at omgå disse forvirrer og undersøge disse spørgsmål gennem nøjagtig og præcis anatomisk målretning i små dyr. Ioniserende stråling hæmmer fødsel og differentiering af nye neuroner, og tillader en ikke-invasiv metode til at målrette neurale progenitorpopulationer 13-15. For nylig beskrev vi et germinale region af pattedyr hypothalamus median eminence (ME), vi betegnes hypothalamus proliferative zone (HPZ) 2. 2. For at teste om voksen neurogenese inden hypothalamus ME regulerer stofskiftet og vægt, vi søgte at forstyrre denne proces. Medianen eminence er en lille ensidig struktur på bunden af ​​tredje ventrikel, hvorfra regulerende hormoner, der frigives. For at hæmme proliferation og efterfølgende neurogenesis uden at ændre de andre fysiologiske funktioner i dette område af hjernen, vi udviklede en invasiv omdrejningspunkt bestråling teknik til selektivt at hæmme fødslen af nyfødte voksne neuroner i hypothalamus median eminence 2.

En række grupper har ansat stråling at undertrykke neurogenesis i kanoniske regioner 14-28. Imidlertid har tidligere radiologiske tilgange generelt målrettet store områder, eller oftenn utilsigtet også målrettet flere områder i hjernen, hvor neurogenese er blevet rapporteret, hvilket gør det vanskeligt entydigt at knytte eventuelle adfærdsmæssige defekter observeret med defekter i specifikke neurale progenitorpopulationer. Muligheden for mere målrettet bestråling leveres af radiologiske platforme, der kombinerer c omputer tomografi-guidet billeddannelse med f ocal stråle ir stråling (CFIR) levering for at muliggøre præcis anatomisk målretning 29-36. Stråling bjælker så små som 0,5 mm i diameter er til rådighed til at målrette specifikke neurale progenitorpopulationer 35. Denne metode giver os mulighed for at målrette hypothalamus ME og arrestere spredning og blokere neurogenesis i små dyr. Efter radiologisk behandling på disse progenitorpopulationer kan fysiologiske og adfærdsmæssige test skal udføres for at belyse den potentielle funktion af voksne-fødte celler. Focal målretning er især vigtigt for vores ansøgning sidenhypofysen ligger tæt på hypothalamus median eminence, bestråling af hypofysen kan påvirke hormonal funktion og efterfølgende forvirre resultaterne.

Det biologiske grundlag for undertrykkelse af neurogenese efter bestråling stadig uklart. Tidligere stråling undersøgelser har påberåbt sig stort område bjælker, og har konkluderet, at undertrykkelsen af neurogenese er medieret gennem en inflammatorisk reaktion 14, 37.. Som sådan er det uklart, om meget fokal bestråling kunne undertrykke neurogenese, da det ikke fremkalde en betydelig inflammatorisk reaktion. Imidlertid har nyere undersøgelser fra vores gruppe af den klassiske neurogen region i hippocampus vist, at meget fokal bestråling med en dosis på 10 Gy kan undertrykke neurogenesis i mindst 4 uger efter bestråling 35.

At afhøre funktionen af ​​voksen-fødte hypothalamus neuroner i median eminence, bruger vi en præcision stråling device stand til at levere CT-scanning i kombination med lille diameter stråling bjælker til at inhibere ME neurogenese. Ved hjælp af en røntgen-rør fastgjort til en portalkran, der roterer over et område på 360 ° vi leverer bue-formede mikro bestråling stråle med anvendelse af et robotstyret prøvebordet, der tillader drejning af et dyr under strålebehandling (figur 1) . En høj opløsning røntgen-detektor anvendes til at erhverve billeder, når gantry er i vandret position 33. Til denne undersøgelse blev CT-billeder rekonstrueret med en isotropisk voxelstørrelse på 0,20 mm. On-board CT-scanning tillod identifikation af et mål, mens dyret er i behandlingen position. Målet blev lokaliseret ved hjælp af CT-navigation dosis-planlægning software, der var inkluderet i vores kommercielt tilgængelige radiologisk platform. Efter at lokalisere vores ROI ved CT-scanning, blev dyret flyttet til den rette behandling stilling ved robot modellen fase, der har fire degRees frihed (X, Y, Z, θ). Gennem en kombination af gantry og robot fase vinkler, kan bjælker leveres fra næsten en hvilken som helst retning i forhold til dyret, og stereotaktiske bue-lignende behandlinger er mulige 29. For disse og alle andre billeddannende undersøgelser blev mus anbragt i et immobilisering enhed, der tillader levering af bedøvelsesmiddel isofluran gas, mens begrænse bevægelse. Immobiliseringsprocessen seng er CT-kompatibel og tilsluttes til den robot modellen trin 34..

Vi forventer, at CFIR vil give konceptuelle fremskridt på en række forskningsområder. Selvom vi bruger radiologisk målretning af hypothalamus median eminence som bevis på princippet om denne teknik, kan CFIR bruges til at målrette en region af kroppen af ​​enhver lille model organisme i princippet. I neurovidenskab, for eksempel, vi forestiller denne teknik kan bruges til at vurdere funktionen af ​​aktivt proliferative progenitorpopulationer der er blevet foreslået til eksistet andre circumventricular organer, såsom området postrema 38, 39, subfornikale organ 40 og hypofysen 41. Langvarige kontroverser om den funktionelle rolle af voksne neurogenese og identificere en kausal rolle i adfærd kan nu også blive bedre behandlet. I sangfugl kan denne teknik omhandle den rolle af voksne neurogenese i at bevare den robuste og sæsonbetonede adfærd fuglesang 42, som har været hæmmet af evnen til selektivt at hæmme neurogenesis i bestemte områder af hjernen. Forståelse denne robuste adfærdsmæssige model kan kaste ny indsigt i den rolle, voksne neurogenese i reguleringen af ​​andre seksuelt dimorfe adfærd. Alternativt i den metaboliske område CFIR kan anvendes til at undersøge aspekter af den rolle af hepatocytproliferation og dens rolle i stofskiftet og energibalance. Muligheden for konceptuelle fremskridt i flere forskningsdiscipliner forstærkes af indførelsen af ​​denne teknik.

43, 44. Derfor har vi generalisere denne CFIR protokol med trin, der kræves for alle forsknings-platforme snarere end dem, der er specifikke for SARRP. Fordelene ved CFIR end tidligere radiologiske fremgangsmåder til at inhibere neurogenese er, at denne teknik tillader tredimensionel volumetrisk billede vejledning til lokalisering og målretning af dosis konform dosis minimerer udsættelse for nontargeted hjerneregioner, og høj præcision stråle geometri tillader konform dosisfordeling med skarpe stråle grænser. Vi skitsere, hvordan at bruge CT-vejledt imaging at målrette dosis til en specifik anatomisk region, og ved at gøre det, hvordan man kan visualisere strålingdosisfordeling direkte i væv ved hjælp af immunhistokemisk farvning for γ-H2AX, en markør af DNA dobbelt-strenget pauser 35, 45-48. Brugen af ​​denne metode til selektiv bestråling af neurogene nicher kan have betydelige konsekvenser afsløre funktionelle rolle af nye voksen-fødte neuroner på fysiologi og sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Animal Brug

Indhente godkendelse fra institutionelle Animal Care og brug Udvalg for standard pleje og brug protokoller. Den nuværende protokol blev udviklet til fokale bestråling undersøgelser 5,5-10 uger gamle voksne C57BL6 / J-mus, som tidligere beskrevet (figur 2) 2. Men andre aldre og kan også bruges mindre dyrearter (rotter, hamstere, jorden egern, osv.), forudsat at effektive anæstesi protokoller og en radiografiske referencepunkter atlas muliggør identifikation af regionen af interesse (ROI) er tilgængelige.

1.. Kalibrering af CT-vejledt Radiological Platform

Udfør filmbaserede kalibreringer for stråledosis på radiologisk platform på forhånd for hver kollimator størrelse og type af røntgenrøret filter. For at målrette en bue stråle af bestråling på det ønskede target site, bruge stråledosis-planlægning software 49 tilrådighede på de fleste kommercielle stråling platforme til at beregne krævede leveringstid baseret på den strålingsdosis, dybden af ​​regionen af ​​interesse (ROI) baseret på CT-scanninger af musen, og rotationshastigheden af ​​robot platform; er oplysninger om dette udeladt af denne protokol, som de forskellige mellem stråling platforme. Med henblik på at visualisere ventrobasal hypothalamus 2 (figur 3) med CT-scanning, betjene røntgenrør med en 0,4-mm brændvidde stedet og stråleenergi 100 kVp med 1 mm Al filtrering. Fokal bestråling af HPZ betjene røntgenrøret ved 225 kVp, 13 mA, og en 1 mm brændpunkt med filtrering af 0,15 mm Cu, til at levere 10 Gy stråling ved en vævs dybde på 0,6 cm i løbet af en behandling cirka 4,6 minutter. Målretning mellem forskellige ROIs vil kræve at beregne forskellige parametre.

  1. Hvis studere virkningerne af fedtrig kost på neurogenese i median eminence som tidligere beskrevet 2, få fire uger gammel kvinde C57BL6 / J-mus fra Jackson Mouse laboratorier, og hus fire mus per bur. Skift mad fra normal chow til en fedtrig kost til fem uger gammel. Tillad mus til at akklimatisere til ny bolig og fødevarer. Udfør CFIR behandling på 5,5 uger gammel. Transport underkaster til driften rum, der indeholder den radiologiske platform. Minimer stressniveauet under overførslen. Forbered isofluran gas anæstesi kammer. Derefter tilsættes en enkelt mus i kammeret. Sideløbende forbereder varmepude (lav indstilling) til post-behandling.
  2. Når musen er under og ikke længere reagerer på mund-pad kompression, bringe emnet på den radiologiske platform og placere på immobilisering sengen af ​​robot fase. Placer emne mund til næse-kegle anæstesi kop, og tænder i bid vagt (figur 1D). Lå musen fladt på immobilisering seng og tjekke for at se, om det fortsætter med at opretholde passivitet. Hvis ja, tape ned musen til sengen med gaze tape. Mens taping ned musen til sengenSørg for, at hovedet er jævnet med et vandret plan. Dette kan bestemmes ved at trække op ørerne og se, om de udlignes. Når musen er i den korrekte position, skal du lukke den ledende beskyttende skjold.
  3. Anskaf computer-tomografi scanning ved hjælp af software om bord på eksperimentatorens radiologiske platform (dette vil variere mellem platforme), som vil give en tredimensional anatomisk strukturel scanning af musen emne. Kontroller at se, om musen hoved er jævnet med vandret plan. Hvis ikke, skal du gentage trin 1,2-1,3 før motivet hoved er jævnet med jorden.
  4. Identificer ROI ved CT-billede. Beregn afstand fra ROI til overfladen af kraniet ved en 45 ° vinkel i forhold til det vandrette plan, som vist i figur 3E.
  5. Brug on-board software, tage et røntgenbillede af musen emnet fra oven som vist i figur 4A. Fjern derefter musen fra den radiologiske platform, sat på varmepude, og overvåge indtil aktiv.
  6. Fra koronale CT-billeder, beregne den gennemsnitlige ROI anatomiske dybde på mindst tre mus for at bestemme levering dosering. Som et eksempel fra en tidligere undersøgelse 2 hvor 10 Gy bestråling blev administreret til ventrobasal hypothalamus, dybden af investeringsafkast fra kraniet (fra en 45 ° vinkel) er 0,66 cm (se figur 3E). Vel vidende, at, forskerne brugte dosis planlægning software (DPS) installeret på deres radiologisk platform til at beregne den passende rotation hastighed og længde af behandling for at opnå den ønskede dosering til ROI.
  7. Efter bestemmelse behandlingsvarighed og rotationshastighed robot scenen med dosis-planlægning software, måle dosis fordelinger af de beregnede parametre med GAFchromic strålingsfølsomme film indlejret i en vand-ækvivalent plast mock-musemodel. For at gøre dette, indkapsle tre GAFchromic strålingsfølsomme film mellem fire vertikalt stablede vand-ækvivalent plasticklodserne 29 somvist i figur 4B.
  8. Placer mock musemodel indeholder GAFchromic film på robot scene, og køre omdrejningspunkt bestråling stråle med de nyligt beregnede parametre. For eksempel til at målrette ventrobasal hypothalamus, input parametrene for 0,15 mm Cu-filter, 225 kVp, 13 mA, 1 mm diameter stråle indstilling, 45 ° gantry vinkel 1,3 ° / sek rotation, og 4,6 minutter for at opnå en ROI radiologisk dosis på 10 Gy.
  9. Efter bestråling, tjek film til mønster og intensitet strålingsdosis. Til en 360 ° vinkel rotation med de parametre, der er anført til at målrette ventrobasal hypothalamus, en mørk ring i filmen over isocenter, en lille sprød stedet på isocenter film, og en lighter ring i filmen under isocenter svarende til kegle- stråle administration af bestråling vil blive observeret (figur 4B).
  10. Læg over isocenter GAFchromic film over de røntgenbilleder af mus emner hvorfra parametre calculated. Det bestrålede omdrejningspunkt på isocenter skal overlappe med det ønskede område ROI som vist i figur 4C.

Alternativ metode: Hvis der vanskeligheder med at målrette hjernen ROI fortsætter, skal du bruge jod kontrast injiceres intratekalt at forbedre visualisering af hjertekamrene under CT-billeder. For kortheds skyld er denne procedure lades ude af denne protokol, men er tidligere beskrevet 35, 50. Jod kontrast vil give yderligere vartegn ventrikulære (figur 5A).

2. Bestemmelse Nøjagtighed bestrålingsudsættelsens Beam

Yderligere bekræfte CFIR stråle nøjagtighed ved direkte visualisering af strålingen stråle i væv 2, 35, 51.. For at gøre dette, skal du udføre immunhistokemi at opdage γH2AX 51, en ​​histon protein og en tidlig markør af DNA dobbelt streng pauser. Mus fag skal transcardialt perfunderes og fast inden for en time af bestråling. Efter irradiation, DNA-reparation hurtigt ensues, og niveauer af ΥH2Ax falde betydeligt 35.

  1. Gentag trin 1,1-1,3.
  2. Når målet er identificeret på CT, er musen emne flyttes under robotstyring at tilpasse dette mål med stråling levering stråle. Input beregnede parametre (rotation hastighed og længde af behandling for at opnå den ønskede dosering) fra trin 1.6 i dosis-planlægning software og begynde behandling. Behandlingen leveres med gantry pegede på 45 ° fra lodret, mens musen roterer omkring en vertikalt orienteret akse.
  3. Efter bestråling udføre transcardial perfusion på musen emner. Udfør perfusion inden for en time 52. Efter perfusion, nedsænkning fix hjerner i 4% PFA / PBS og blidt natten over ved 4 ° C.
  4. Den følgende morgen, vask 5 min i PBS 3x at fjerne paraformaldehyd fiksativ. Derefter nedsænkes i 30% sucrose i 1x PBS på en rocker ved 4 ° C.
  5. Vip forsigtigt ved 4 ° C (oselt 12-16 timer), indtil hjernen synker til bunden af ​​røret. Dette tjener som en cryoprotection trin. Når hjerner vask, fjerne hjerne med en hulske til at forhindre overskydende 30% sucrose/1x PBS overførsel. Hurtigt integrere i frysemedium på tøris. Swirl frysemedium med pipette spids og tilpasse hjerne i plast skimmel.
  6. Når helt frosset, overføre hjerne blokke til -20 ° C fryser for lagring.
  7. Den dag, hvor immunhistokemi vil blive udført, afsnit coronalt på 40 um tykkelse og flyde ind i en 24-brønds plade indeholdende PBS med en tynd pensel. Sektioner bør holdes i korrekt seriel ordre på immunfarvning at bestemme bestråling dækning af målområde.
  8. Forvarm 0,01 M natriumcitratopløsning til 80 ° C i vandbad i forberedelse til antigengenfinding trin. Samtidig mens natriumcitrat varmer, udføre 5 minutters vaske 3x i 0,01 M PBS.
  9. Når natriumcitratopløsning er ved 80 ° C, nedsænkes hjerne afsnit In natriumcitratpufferopløsning. Efterlad i vandbad ved 80 ° C i 1 time.
  10. Fjern sektionen og tillade natriumcitratopløsning at nå stuetemperatur, derefter udføre tre 5-minutters vask i 0,01 M PBS.
  11. Bloker hjernesnit i 1 time i PBS-Triton indeholdende 5% normalt gedeserum.
  12. Inkuber hjernesnit overnight i PBS-Triton indeholdende 5% normalt gedeserum med 1:700 koncentration af muse-anti-phospho-H2AX primære antistof ved 4 ° C.
  13. Den næste dag, udfører 15 minutters vaske 3x i 0,01 M PBS-Triton.
  14. Inkuber hjernesnit PBS-Triton indeholdende 5% normalt gedeserum med gede-anti-muse-sekundært antistof konjugeret med 488 nm fluorphore på 1:500 koncentration i 2 timer.
  15. Udfør 15 minutters vaske 3x i 0,01 M PBS-Triton.
  16. Udfør 4 ',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) farvning (1:5000 i PBS) i 10 min for at visualisere kernen. Derefter vaskes hjernesnit i 5 minutter med PBS.
  17. Montere på elektrostatisk charged objektglas ved flydende sektion i PBS. Tør overskydende PBS og lade objektglassene tørre. Dækglas dias ved hjælp af montering medium og lade objektglassene tørre i mørke ved stuetemperatur natten over.
  18. Tag billeder af serielle kronafsnit med fluorescerende mikroskop. ΥH2Ax immunfarvning (grøn) angiver stedet for bestråling. DAPI (blå) er en nuklear farvning (figur 5B).

3. Udarbejdelse af Mouse Emner for Focal Bestråling

Undersøg ΥH2Ax immunfarvning resultater. Når tilfreds med kalibrering og målretning af bestråling stråle, fortsætte med eksperimentet. På dette tidspunkt er den samlede tid, der kræves til behandling af en mus (fra animalsk opsætningen til afslutningen af ​​stråle levering) er cirka 10-15 min for 10 Gy behandling med en 1 mm-stråle.

  1. Bestil fire uger gamle C57BL6 / J hunmus fra Jackson Mouse laboratorier. House fire mus per bur og skifte mad fra normal chowtil en fedtrig kost til fem uger gammel. Ear Punch mus til at give dem unikke kendetegn. Overvåge sundhedstilstanden af ​​mus dagligt. Bemærk: metalliske markører kan ikke anvendes, da de vil resultere i striber artefakter på CT.
  2. Mus vejes dagen før stråling eller simuleret behandling. Split mus i to kohorter for stråling eller simuleret behandling og sikre, at der ikke er nogen signifikant forskel i vægt mellem kohorter. På dagen for behandlingen, når mus er seks uger gammelt, derefter vejes alle mus og registrere deres masse. Forsigtigt transportere begge kohorter til den radiologiske platform. Vær omhyggelig med at minimere stressniveauet.
  3. Forbered isofluran gas anæstesi kammer. Bedøver to mus, en i den forudbestemte bestråling gruppen, og en anden i humbug kontrolgruppen. Forbered varmepude sat i den lave indstilling for postoperativ behandling.
  4. Følg trin 1,2-1,4 for musen til at modtage bestråling. For fingeret musen, holde musen i anæstesi kammer, mens behandlingen foregår. Gør sure, at anæstesi kammer er nær CFIR platformen, så eventuelle virkninger på omgivende stråling er indregnet i. Efter målet er identificeret på CT, flyt musen emne under robotstyring at tilpasse dette mål med stråling levering stråle. Input beregnede parametre (rotation hastighed og længde af behandling) i dosis-planlægning software.
  5. Når strålebehandlingen er færdig, vender tilbage både humbug og bestrålede mus til opvarmning pad, og overvåge, indtil de vågner op.
  6. Retur både humbug og bestrålede mus til dyr facilitet. Overvåg hver dag. Mus vejes hver halve uge. For at bekræfte bestråling af målrettet hypothalamus proliferativ zone, administrere intraperitoneale injektioner af BrdU (50 mg / kg) Tre dage efter behandling og undersøge neurogenesis mellem grupper ved colabeling af immunhistokemi for BrdU og en neuronal markør en måned efter initial BrdU eksponering (figur 6) 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vurdere CT-vejledt målretning og Nøjagtighed

Den mekaniske kalibrering af systemet er kritisk for at sikre, at stråler fra forskellige vinkler alle skærer hinanden i et enkelt punkt. Kalibrering blev udført med en halvautomatisk imaging-baserede metode, hvor ende-til-ende tilpasning nøjagtigheden er blevet målt til at være 0,2 mm 29. Denne nøjagtighed er yderst kritisk, da mængden af hypothalamus median eminence struktur er lille 2. For at teste denne kalibrering målte vi dosis distributioner med GAFchromic strålingsfølsomme film indlejret i en vand-ækvivalent plast mock-musemodel 35 (figur 4B). Kort fortalt blev en CT-scanning af mus emnet taget, og vores ventrobasal hypothalamus target site blev identificeret. Levering og rotationshastighed blev beregnet, og den passende kollimator og filtrering var knyttet til at sikre 10 Gy stråling blev leveret. En mock-musemodel designet fra en vand-equivalen t plaststruktur indlejret med GAFchromic strålingsfølsomme film blev derefter erstattet af den virkelige mus underkastet måling dosisfordeling ved forskellige fokale planer. Figur 4B viser ende-til-ende testresultater fra en bue behandling med 1 mm diameter stråle ved hjælp af GAFchromic film i en mock-mus platform. Gantry blev sat til en 45 ° vinkel i forhold til mock musemodel mens robot prøvebordet blev roteret omkring en lodret orienteret akse, frembringe et "bue" eller kegle af stråling. Den fulde bredde i halv maksimum (FWHM) er 2,31 mm, der er større end 1,0 mm, da buerne kolliderer med filmen i en vinkel. Teoretisk strålen størrelse på denne vinkel skal være 2,0 mm. Omdrejningspunktet stråle plet vist i figur 4 viser præcision tilpasning af stråler fra forskellige retninger. Denne film kan overlejres oven på den virkelige muse emne, viser strålepositionen og præcision (fig. 4C).

e_content "> Ved hjælp af en 1 mm diameter stråle collimator blev en bue teknik, der anvendes til at levere 10 Gy til målet punkt i vores mus emne. Tidligere målinger 29 viser, at denne teknik giver meget lave doser af stråling (<0,1 Gy) uden for 1 mm mål. Arealet af hypofysen og de ​​omkringliggende strukturer derfor effektivt afskærmet fra den centrale bestråling af ventrobasal hypothalamus. nøjagtighed målretning stråle er blevet målt i tidligere undersøgelser at være inden for 0,2 mm både i fantom tester 29 og vævssnit 35 .

Selvom det ikke er påkrævet, kan CT-vejledt målretning af ROI blive styrket af en injiceret intratekal jod kontrast til forbedre CT-vejledt målretning for vores hjerne ansøgning (figur 5A). Da dette er en invasiv og besværlig procedure, er denne kontrast ikke bruges ofte, og der ikke er beskrevet i denne protokol. Detaljer for denne protokol kan findes i Ford et al. 2011 og Chaichana et al. 2007. Fordelene ved denne jodholdige kontrastmidler er at de laterale og tredje ventrikler tydeligt visualiseres i CT-scanninger er erhvervet på en CFIR radiologisk platform (figur 5A). Målet var median eminence, ved foden af ​​den tredje ventrikel, og blev identificeret ved hjælp af CT-vejledt navigationssoftware og importeres automatisk ind i robotten positionering interface. Bony kranielle strukturer blev identificeret og anvendt som anatomiske kendetegn for efterfølgende undersøgelser, hvor jod kontrast ikke var ansat.

Beam Målretning Validering med γ-H2AX

For yderligere at bekræfte vores CT-vejledt målretning af hypothalamus ME, vi visualiseret 1 mm bestråling stråle i væv ved indirekte undersøgelse af dobbeltstrengede DNA-brud, der opstår efter bestråling. H2AX histon protein phosphoryleres efter DNA dobbelt-strenget pauser. γ-H2AX har været meget anvendt i hjernen og andre væv 46 -48, og antallet af γ-H2AX + foci synes at korrelere godt med strålingsdosis over et bredt interval af doser 51, 53. Vi observerede klar visualisering af strålen efter γ-H2AX immunofarvning (figur 5B). Resulterende γ-H2AX farvning viste præcis målretning af den forventede placering. Strålen kant var også yderst skarp aftale med filmbaserede fysik idriftsættelse målinger, der indikerer en 20-80% penumbra på 0,3 mm 54. Vi har tidligere måles afstanden mellem tilsigtede mål og midten af strålen som visualiseret i vævssnittene 35. I midten af strålen blev opvejet af den tilsigtede mål med en gennemsnitlig afstand på 0,19 ± 0,36 mm (standardafvigelse) på 10 bestrålede mus efter factoring for effekter af væv svind under fiksering og bearbejdning 35..

Ved hjælp af en stereotaktisk-lignende bue behandling bestående af en bue på 45 ° fra lodret, viviser vi var i stand til effektivt at målrette ventrobasal hypothalamus, uden at bestråle andre neurogene nicher (figur 5C-D). Bestråling af de omgivende områder var minimal, og der var en grænse for stråling som påvist af GAF-krom film (figur 4B) og γ-H2AX immunofarvning (figurerne 5B-D). Vævet dorsale til hypothalamus ME viser lys γ-H2AX farvning (figur 5B), fordi stråleområdet ind gennem denne region, og muligvis også på grund af forbedring af de overliggende knogle, selvom et relativt hårdt røntgenstråle blev anvendt (225 kVp, 0,15 mm Cu filtrering).

Virkninger på Neurogenese

Hvis du bekræfter specificitet vores CT-vejledt bestråling levering, vi undersøgte effekten af ​​10 Gy bestråling på niveauet af ME neurogenesis. Voksne mus blev fodret med en fedtrig kost, modtaget stråling eller simuleret behandling, og så efterfølgendeBrdU injektioner som tidligere beskrevet begyndende 6 uger gamle 2. Musene blev aflivet til undersøgelse ved 10 uger gammel, en måned efter den første BrdU injektion. Bestrålede HFD fremføring voksne mus udstillet ~ 85% hæmning af ME neurogenese sammenlignet med sham-behandlede kontroller (figur 6A) 2. Den bueformede nucleus, en tilstødende struktur grænser bestråling site, blev undersøgt for ændringer i neurogenese, og fundet at have nogen statistisk signifikant forskel mellem bestrålede dyr og snydekontroller (figur 6A) 2.

Funktion af Voksen-fødte Median Eminence Hypothalamus neuroner

Ændringer i bestrålede og humbug mus blev undersøgt efter behandling. Pels og respons til at røre optrådte normal. En kemi panel og komplet blodtælling panel blev undersøgt en uge efter strålebehandling, og ingen signifikant forskel blev observeret (n = 9/group). I højt fedtindhold fodretmus, hvor vi observerede en reduktion i voksen-fødte ME neuroner ~ 85% en måned efter bestråling (figur 6A), havde bestrålede mus nedsat vægtøgning over tid i forhold til sham-behandlede gruppe (figur 6C). I modsætning hertil normal-chow fodret kontrol mus, hvor observerede niveauer af ME neurogenesis var betydeligt lavere end deres højt fedtindhold fodret modstykker 2, ikke havde en statistisk signifikant forskel i vægt mellem sham versus bestrålede grupper (figur 6b). Interessant nok er denne reducerede vægtøgning hos bestrålede højt fedtindhold fodret mus ledsages af ændringer i metabolisme og aktivitet som tidligere beskrevet i detaljer af vores gruppe 2 (figur 6D-I).

Figur 1
Figur 1. Computer tomografi-guidede omdrejningspunkt bestråling (CFIR) platform. (A) CFIR udnytter en præcision stråling enhed kan levere CT-vejledt bestråling med små bjælker. Et eksempel på en CFIR platform er det lille dyr stråling forskningsplatform (SARRP). Med bly afskærmning (som vist), den SARRP ligger på 81 inches (højde) med 58 inches (bredde) med 41 inches (dybde) på 5,170 pounds. (B) ved hjælp af en dobbelt kilde røntgen-rør fastgjort til en portalkran, der roterer 360 °, den SARRP bruger en robot styre prøvebordet, der tillader drejning af et dyr i hele strålebehandling. (C) CFIR hardware er sammensat af en røntgenkilde, kollimatoren, roterende gantry, dyr support, roterende robot prøvebordet, og elektronisk imager. (D) Musen emne er placeret i en immobilisering seng med gas anæstesi indgang på robot modellen scenen. Fra Armour et al. 2010. (E) CFIR hardware bør omfatte tilpasses collimating kegler for focal ir stråling levering af forskellige størrelser. Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. Eksperimentel paradigme. Kvinde C57BL / 6 mus blev bestilt fra Jackson mus laboratorier og akklimatiseret til hjemmehørende bure fire uger gammel. Mus emne blev skiftet til en ad libitum kost med højt fedtindhold til fem uger gammel, og opdelt i to behandlingsgrupper: de bestrålede eller fingeret kohorter. Fysiologiske vurderinger blev taget på langs før og efter behandlingen. Bestråling eller sham behandlinger blev administreret i 5,5 uger. Intraperitoneale BrdU injektioner blev givet til seks uger gamle, som tidligere beskrevet 2.

pload/50716/50716fig3.jpg "/>
Figur 3. Region af interesse lokalisering. Hypothalamus proliferative zone (HPZ), en neurogen region beliggende i hypothalamus median eminence, er beliggende i den ventrale mediobasal hypothalamus. (A) HPZ region af interesse (ROI) er fremhævet af røde trådkorset i en 3-D Nissl henvisning atlas volumen fra Allen Brain Atlas Data Portal (position: 7,041, 7,211, 5,564) (tilgængelig fra http:// mouse.brain-map.org / ) 55. (B) Koronale hjerne sektion af ROI i nitten dage gamle mus. BrdU immunhistokemisk (grøn) afslører, at ROI (hvid pilespids) indeholder proliferative celler. Tætheden af ​​proliferative celler i HPZ er begrænset i den forreste til posterior akse, med densitet højest på -1.75 mm Bregma. Vævssektioner er kontraproduktive farvet med DAPI nukleare markør (blå). Figur fra Lee et al. 2012a.(CE) CT-scanning på et CFIR platform giver mulighed for at målrette den HPZ ROI (røde trådkorset) ved bue strålebehandling levering. CT-billede af muse emne i det vandrette plan (C), Sagittalplan (D), og koronale plan (E). (E) afstand fra overfladen af kraniet til ROI er 0,62 cm (rød linje). Skalapanelerne = 1 mm (A), 50 m (B) og 0,62 cm (CE). Klik her for at se større figur .

Figur 4
Figur 4.. Kalibrering af bestråling levering. (A) X-ray af en mus emne fastgjort i immobilisering enhed på SARRP robot scenen. (B) Beregnet ROI koordinerer enre indtastet og målrettet mod en mock musemodel. Fantom model består af GAFchromic strålingsfølsomme film indlejret i en vand-ækvivalent plast. Film placeret ovenfor, og under ROI isocenter opdage dosis distribution. En 45 ° bue stråling stråle fra SARRP leverer en kegleformet dosisfordeling til ROI, og konvergerer på isocenter (penumbraen stedet). (C) overlejring af dosimetri-film erhverves med 1 mm stråling stråle i fantom med en X-ray af en rigtig mus emne (gul linje). Hvid cirkel (pil) angiver 10 Gy strålingsdosis focally målrettet til HPZ. Stiplede linje skitserer hjerne. Panel fra Lee et al. 2012a.

Figur 5
Figur 5. Bekræftelse af Radiation Delivery. CT-scanning med jod kontrast kan forbedre visualisering af ROI hvis normal CT-scanning ikke suffice. (A) Mus forsøgspersoner fik jod kontrast som tidligere beskrevet (Panel fra Lee et al. 2012). CT-billeder i den koronale, vandret og sagittalplan vises fra venstre til højre. (B) Bekræftelse af stråling levering i væv kan detekteres ved immunohistokemi for γH2AX, en markør for DNA dobbeltstrengede pauser. γH2AX immunfarvning viser stråling stråle levering målrettet til ROI HPZ i den ventrale mediobasal hypothalamus. γH2AX immunfarvning er ikke observeret i de subventricular zone af de laterale ventrikler (C), eller subgranular zone af hippocampus (D) i den samme mus emne. (BD) Sektioner kontrastfarves med DAPI (Fra Lee et al. 2012a). Klik her for at se større figur .


Figur 6. Focal hæmning af ME neurogenesis resulterer i ændringer i vægt og stofskifte. (A) Medianen eminence (ME), der ligger i den ventrale mediobasal hypothalamus var målrettet til bestråling. Den buede kerne (ArcN) er den tilstødende anatomiske struktur. En måned efter behandling blev den procentvise andel af BrdU + Hu neuroner fra sham versus bestrålede kohorter kvantificeret ved immunohistokemi i ME og ArcN. Niveauer af ME neurogenese blev væsentligt reduceret i bestrålet versus sham kohorter (n = 5/cohort, *** = p <0,0001). Niveauer af ArcN neurogenese blev ikke påvirket (n = 3/cohort, ns = ikke signifikant). (B) Normal chow fodret (NC) og (C) højt fedtindhold fodret (HFD) mus blev undersøgt på langs for ændringer i vægt efter bestråling eller sham treatment (B, n = 12/cohort: C, n = 9/cohort). (DE) En måned efter behandlingen, bestrålet og humbug behandlet HFD-fodret mus blev undersøgt ved kvantitativ magnetisk resonans spektroskopi til analyse af% fedtmasse og% lean masse. Bestrålede mus havde betydeligt færre% fedtmasse og betydeligt% magert masse end snydekontroller (n = 5, * = p <0,05). Samlet masse: (Sham) 21,0 ± 0,3 g, (bestrålede) 18,86 ± 0,4 g Lean masse: (Sham) 14,6 ± 0,2 g, (bestrålede) 13,9 ± 0,3 g fedt masse: (Sham) 3,9 ± 0,2 g, ( bestrålede) 2,6 ± 0,3 g (n = 5, * = p <0,05). (FI) Bestrålet og sham behandlede voksne mus blev placeret i en omfattende Lab Animal Monitoring System (sandmuslinger) til samtidige målinger af fødeindtagelse, fysisk aktivitet, og hele kroppen metaboliske profilering to uger efter behandlingen. Efter akklimatisering i afprøvningen kammer blev bestrålede mus observeret at have significantly større energiforbrug, total aktivitet, og VO 2 (ml / kg / time) sammenlignet med sham kontrol under den mørke del af dagen (n = 11, 12, * = p <0,05). (G) Ingen signifikant forskel blev observeret i luftvejene kurs (RER) (n = 11, 12). Subfigure A er genereret fra data, der tidligere er offentliggjort i Lee et al. 2012a og Lee et al. 2012b. Subfigures CI fra Lee et al. 2012a. Klik her for at se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

CT-vejledt omdrejningspunkt bestråling (CFIR) er et nyt og komplet system tilgang stand til at levere strålingsfelter til mål i små dyr under robot styring med CT-vejledning 32. Evnen til CFIR til at levere meget fokuseret bjælker til små dyremodeller giver nye forskningsmuligheder at bygge bro laboratorium forskning og klinisk oversættelse. Dette papir beskriver CFIR tilgang til præcis stråling levering til specifikt at målrette en hypothalamus neural progenitorpopulationen. Vi viser her, hvordan man kalibrere og bekræfte stråling levering specificitet via røntgenfilm og i hjernevæv ved immunohistokemi.

Derudover viser vi, hvordan denne teknik kan anvendes til at inhibere neurogenese i et specifikt område af hjernen. Vi viser, at vi er i stand til at målrette ventrobasal hypothalamus, og hæmme neurogenesis i median eminence, uden at ændre niveauet af neurogenese i tilstødende strukturer. Inhibering af ME neurogenese er ledsaget af ændringer i metabolisme og aktivitet, samt nedsat vægtøgning på et højt fedtindhold kost i bestrålet versus sham behandlingsgrupper (figur 6) 2. Disse data tyder på en rolle for disse voksen-fødte hypothalamus neuroner i reguleringen stofskiftet og energi homeostase. Desuden foreslår det, at et overskud fedtrig kost kan ændre kritiske metaboliske kredsløb selv i voksenalderen 3. Vores resultater er en vigtig udvidelse af den kendte funktion af voksne-fødte neuroner, og kaster lys over en ny hypothalamus neural progenitorpopulationen 3. Potentielle forbehold til denne fremgangsmåde er, at bestråling hæmmer progenitor proliferation end neurogenese i sig selv og er således også muligt, at fysiologiske forandringer efter behandling kan delvis forklares ved afbrydelse af andre voksne celler tilblivelse. Fremtidige skridt vil omfatte udvikling af genetiske værktøjer til at hæmme udbredelsen af ​​denne specifikke neurale stamfader population, som vil give en betydelig klarhed til den funktionelle rolle, disse forfædre og deres afkom spille i reguleringen af fysiologi 3..

Tilsammen men dette radiologisk platform fungerer som et vigtigt udgangspunkt i at udføre medium throughput skærme på neurale stamfædre og deres afkom. Denne radiologisk teknik er ikke begrænset til forskning spørgsmål i neurovidenskab, dog, og vi forventer, CFIR at udvide konceptuelle fremskridt i en række forsknings-discipliner. Den nylige tilgængelighed af kommercielt solgte CT-styrede radiologiske platforme giver en mulighed for forskere at bruge disse kapaciteter af denne platform for deres forskning spørgsmål (Figur 1). Flere alternativer er kommercielt tilgængelige, der tillader en at udføre image-guided lille dyr bestråling. Desuden kan CT-styrede fokale bestråling systemer også blive bygget i huset, som det var tilfældet med det system, der anvendes for disse studies på Johns Hopkins 29-33, 35.

Udførelse af denne grad af fokal målretning kræver korrekt kalibrering og målretning af ROI. Selv om denne teknik i første omgang vil tage uddannelse for at blive fortrolig med CFIR platform og dens dosis-planlægning software, drift af enheden er temmelig let efter at forstå protokollen og kapaciteter af platformen. Det anbefales, at operatøren praksis kalibrering strålingsstrålen flere gange, inden du kører fuld skala langsgående eksperiment. Det er sagt, når flydende i driften af ​​CFIR bør forskningsundersøgelser bevæge sig hurtigt.

Denne CFIR protokollen beskrevet heri anvender tredimensionalt volumetrisk billede vejledning til lokalisering og målretning af dosis. Konform dosis minimerer eksponering for nontargeted områder af hjernen, og høj præcision stråle geometri giver mulighed for konform dosisfordeling med skarpe stråle grænser. Dette tillader en at stille spørgsmål regarding funktionen af ​​voksen-fødte neuroner, men åbner også områder til spørgsmål til den rolle celledelingen på områder såsom fysiologi, tumor biologi og immunologi. Denne metode kan udvides på flere måder med kontrast farvestoffer og bioluminescens at forbedre visualisering 35, 56.. Der arbejdes nu på at forbedre CFIR hardware kapaciteter yderligere, og platformen er nu ved at blive udvidet til at omfatte en on-board positronemissionstomografi scanner 56. Disse vil lette udvidelsen af ​​værktøjer til rådighed for forskere og støtte i at omsætte opdagelser på bænken til sengekanten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

JW har en forskningsfinansiering og konsultation aftaler med Xstrahl, Inc.

Acknowledgments

Vi takker C. Montojo, J. Reyes, og M. Armour til teknisk rådgivning og bistand. Dette arbejde blev støttet af US National Institutes of Health tilskud F31 NS063550 (DAL), en Basil O'Connor Starter Scholar Award og tilskud fra det Klingenstein fonden og NARSAD (til SB). SB er en WM Keck Distinguished Young Scholar i medicinsk forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SARRP research platform Xstrahl RS225A http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP irradiation bunker Xstrahl Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding
GAF chromic film IPS GAFchromic ETB2
Mouse phantom Gammex 457 Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.
Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody Millipore, Inc. 05-636 clone JBW301
High-fat rodent diet Research Diets D12492i 60% of the calories as fat, food should be irradiated
Isoflurane Baxter Healthcare Corporation 10019-360-40
0.01 M Sodium citrate Fisher Scientific 1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water
Superfrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15
DAPI Fisher Scientific nuclear counterstain
Mounting medium Fisher Scientific Vectashield or Gelvatol is preferred

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
  2. Lee, D. A., et al. Tanycytes of the hypothalamic median eminence form a diet-responsive neurogenic niche. Nat. Neurosci. 15, 700-702 (2012).
  3. Lee, D. A., Blackshaw, S. Functional implications of hypothalamic neurogenesis in the adult mammalian brain. Int. J. Dev. Neurosci. 30, 615-621 (2012).
  4. Pencea, V., Bingaman, K. D., Wiegand, S. J., Luskin, M. B. Infusion of brain-derived neurotrophic factor into the lateral ventricle of the adult rat leads to new neurons in the parenchyma of the striatum, septum, thalamus, and. 21, 6706-6717 (2001).
  5. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Neurogenesis in the hypothalamus of adult mice: potential role in energy balance. Science. 310, 679-6783 (2005).
  6. Pierce, A. A., Xu, A. W. De novo neurogenesis in adult hypothalamus as a compensatory mechanism to regulate energy balance. J. Neurosci. 30, 723-7230 (2010).
  7. Ahmed, E. I., et al. Pubertal hormones modulate the addition of new cells to sexually dimorphic brain regions. Nat. Neurosci. 11, 995-997 (2008).
  8. Xu, Y., et al. Neurogenesis in the ependymal layer of the adult rat 3rd ventricle. Exp. Neurol. 192, 251-264 (2005).
  9. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Evidence for constitutive neural cell proliferation in the adult murine hypothalamus. J. Comp. Neurol. 505, 209-220 (2007).
  10. Perez-Martin, M., et al. IGF-I stimulates neurogenesis in the hypothalamus of adult rats. Eur. J. Neurosci. 31, 1533-1548 (2010).
  11. Shimogori, T., et al. A genomic atlas of mouse hypothalamic development. Nat. Neurosci. 13, 767-775 (2010).
  12. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
  13. Limoli, C. L., et al. Radiation response of neural precursor cells: linking cellular sensitivity to cell cycle checkpoints, apoptosis and oxidative stress. Radiat. Res. 161, 17-27 (2004).
  14. Monje, M. L., Mizumatsu, S., Fike, J. R., Palmer, T. D. Irradiation induces neural precursor-cell dysfunction. Nat. Med. 8, 955-962 (2002).
  15. Wojtowicz, J. M. Irradiation as an experimental tool in studies of adult neurogenesis. Hippocampus. 16, 261-266 (2006).
  16. Mizumatsu, S., et al. Extreme sensitivity of adult neurogenesis to low doses of X-irradiation. Cancer Res. 63, 4021-4027 (2003).
  17. Snyder, J. S., Hong, N. S., McDonald, R. J., Wojtowicz, J. M. A role for adult neurogenesis in spatial long-term memory. Neuroscience. 130, 843-8452 (2005).
  18. Santarelli, L., et al. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science. 301, 805-809 (2003).
  19. Saxe, M. D., et al. Ablation of hippocampal neurogenesis impairs contextual fear conditioning and synaptic plasticity in the dentate gyrus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17501-17506 (2006).
  20. Duan, W., et al. Sertraline slows disease progression and increases neurogenesis in N171-82Q mouse model of Huntington's disease. Neurobiol. Dis. 30, 312-322 (2008).
  21. Rola, R., et al. Radiation-induced impairment of hippocampal neurogenesis is associated with cognitive deficits in young mice. Exp. Neurol. 188, 316-330 (2004).
  22. Hellstrom, N. A., Bjork-Eriksson, T., Blomgren, K., Kuhn, H. G. Differential recovery of neural stem cells in the subventricular zone and dentate gyrus after ionizing radiation. Stem Cells. 27, 634-641 (2009).
  23. McGinn, M. J., Sun, D., Colello, R. J. Utilizing X-irradiation to selectively eliminate neural stem/progenitor cells from neurogenic regions of the mammalian brain. J. Neurosci. Methods. 170, 9-15 (2008).
  24. Panagiotakos, G., et al. Long-term impact of radiation on the stem cell and oligodendrocyte precursors in the brain. PLoS One. 2, e588 (2007).
  25. Shinohara, C., Gobbel, G. T., Lamborn, K. R., Tada, E., Fike, J. R. Apoptosis in the subependyma of young adult rats after single and fractionated doses of X-rays. Cancer Res. 57, 2694-2702 (1997).
  26. Tada, E., Parent, J. M., Lowenstein, D. H., Fike, J. R. X-irradiation causes a prolonged reduction in cell proliferation in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience. 99, 33-41 (2000).
  27. Tada, E., Yang, C., Gobbel, G. T., Lamborn, K. R., Fike, J. R. Long-term impairment of subependymal repopulation following damage by ionizing irradiation. Exp. Neurol. 160, 66-77 (1999).
  28. Hopewell, J. W., Cavanagh, J. B. Effects of X irradiation on the mitotic activity of the subependymal plate of rats. Br. J. Radiol. 45, 461-465 (1972).
  29. Matinfar, M., Ford, E., Iordachita, I., Wong, J., Kazanzides, P. Image-guided small animal radiation research platform: calibration of treatment beam alignment. Phys. Med. Biol. 54, 891-905 (2009).
  30. Matinfar, M., et al. Small animal radiation research platform: imaging, mechanics, control and calibration. Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv. 10, 926-934 (2007).
  31. Matinfar, M., Iordachita, I., Ford, E., Wong, J., Kazanzides, P. Precision radiotherapy for small animal research. Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv. 11, 619-626 (2008).
  32. Matinfar, M., Iordachita, I., Wong, J., Kazanzides, P. Robotic Delivery of Complex Radiation Volumes for Small Animal Research. IEEE Int. Conf. Robot. Autom. 2010, 2056-2061 (2010).
  33. Wong, J., et al. small animal radiation research platform with x-ray tomographic guidance capabilities. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 71, 1591-1599 (2008).
  34. Armour, M., Ford, E., Iordachita, I., Wong, J. CT guidance is needed to achieve reproducible positioning of the mouse head for repeat precision cranial irradiation. Radiat. Res. 173, 119-123 (2010).
  35. Ford, E. C., et al. Localized CT-guided irradiation inhibits neurogenesis in specific regions of the adult mouse brain. Radiat. Res. 175, 774-783 (2011).
  36. Redmond, K. J., et al. A radiotherapy technique to limit dose to neural progenitor cell niches without compromising tumor coverage. J. Neurooncol. 104, 579-587 (2011).
  37. Fike, J. R., Rola, R., Limoli, C. L. Radiation response of neural precursor cells. Neurosurg. Clin. N. Am. 18, 115-127 (2007).
  38. Bauer, S., Hay, M., Amilhon, B., Jean, A., Moyse, E. In vivo neurogenesis in the dorsal vagal complex of the adult rat brainstem. Neuroscience. 130, 75-90 (2005).
  39. Hourai, A., Miyata, S. Neurogenesis in the circumventricular organs of adult mouse brains. J. Neurosci. Res. 91, 757-770 (2013).
  40. Bennett, L., Yang, M., Enikolopov, G., Iacovitti, L. Circumventricular organs: a novel site of neural stem cells in the adult brain. Mol. Cell. Neurosci. 41, 337-347 (2009).
  41. Gleiberman, A. S., et al. Genetic approaches identify adult pituitary stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6332-6337 (2008).
  42. Goldman, S. A., Nottebohm, F. Neuronal production, migration, and differentiation in a vocal control nucleus of the adult female canary brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 2390-2394 (1983).
  43. Chow, J. C., Leung, M. K., Lindsay, P. E., Jaffray, D. A. Dosimetric variation due to the photon beam energy in the small-animal irradiation: a Monte Carlo study. Med. Phys. 37, 5322-5329 (2010).
  44. Maeda, A., et al. In vivo optical imaging of tumor and microvascular response to ionizing radiation. PLoS One. 7, e42133 (2012).
  45. Vasireddy, R. S., et al. Evaluation of the spatial distribution of gammaH2AX following ionizing radiation. J. Vis. Exp. (42), e2203 (2010).
  46. Short, S. C., et al. DNA repair after irradiation in glioma cells and normal human astrocytes. Neuro. Oncol. 9, 404-411 (2007).
  47. Gavrilov, B., et al. Slow elimination of phosphorylated histone gamma-H2AX from DNA of terminally differentiated mouse heart cells in situ. Biochem. Biophys. Res. Commun. 347, 1048-1052 (2006).
  48. Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat. Res. 165, 155-164 (2006).
  49. Jacques, R., Taylor, R., Wong, J., McNutt, T. Towards real-time radiation therapy: GPU accelerated superposition/convolution. Comput. Methods Programs Biomed. 98, 285-292 (2010).
  50. Chaichana, K. L., Levy, A. P., Miller-Lotan, R., Shakur, S., Tamargo, R. J. Haptoglobin 2-2 genotype determines chronic vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Stroke. 38, 3266-3271 (2007).
  51. Mah, L. J., et al. Quantification of gammaH2AX foci in response to ionising radiation. J. Vis. Exp. (38), e1957 (2010).
  52. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  53. Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
  54. Tryggestad, E., Armour, M., Iordachita, I., Verhaegen, F., Wong, J. W. A comprehensive system for dosimetric commissioning and Monte Carlo validation for the small animal radiation research platform. Phys. Med. Biol. 54, 5341-5357 (2009).
  55. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  56. Tuli, R., et al. Development of a novel preclinical pancreatic cancer research model: bioluminescence image-guided focal irradiation and tumor monitoring of orthotopic xenografts. Transl. Oncol. 5, 77-84 (2012).
Funktionel Interrogation Adult Hypothalamus Neurogenese med Focal Radiological Hæmning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D. A., Salvatierra, J., Velarde, E., Wong, J., Ford, E. C., Blackshaw, S. Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition. J. Vis. Exp. (81), e50716, doi:10.3791/50716 (2013).More

Lee, D. A., Salvatierra, J., Velarde, E., Wong, J., Ford, E. C., Blackshaw, S. Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition. J. Vis. Exp. (81), e50716, doi:10.3791/50716 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter