Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

التصوير متحد البؤر واحدة من الميتوكوندريا الأكسيد ومضات في القلب سليمة أو Published: November 5, 2013 doi: 10.3791/50818
Automatic Translation
1, 1
1Mitochondria and Metabolism Center, Department of Anesthesiology and Pain Medicine, University of Washington

Summary

يتم تطبيق متحد البؤر المسح المجهري لتصوير الأحداث الميتوكوندريا واحد في القلب perfused أو عضلات الهيكل العظمي في الحيوانات الحية. رصد في الوقت الحقيقي للعمليات الميتوكوندريا واحد مثل ومضات الفائق وغشاء التقلبات المحتملة يمكن تقييم وظيفة الميتوكوندريا في سياق ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية وخلال الاضطرابات المرضية.

Abstract

الحبيبات الخيطية هي عضية داخل الخلايا الحرجة المسؤولة عن إنتاج الطاقة والإشارات بين الخلايا في أنظمة حقيقية النواة. ضعف الميتوكوندريا غالبا ما ترافق وتساهم في الأمراض التي تصيب البشر. وتستند غالبية المناهج التي تم تطويرها لتقييم وظيفة الميتوكوندريا واختلال وظيفي في المختبر أو على فيفو السابقين القياسات. والنتائج من هذه التجارب القدرة في تحديد وظيفة الميتوكوندريا في الجسم الحي محدودة. هنا، نحن تصف الرواية التي تستخدم نهج متحد البؤر المسح المجهري للتصوير الأنسجة سليمة في aminals الحية، والذي يسمح للتقييم وظيفة الميتوكوندريا واحد بطريقة الوقت الحقيقي في الجسم الحي. أولا، نحن توليد الفئران المعدلة وراثيا معربا عن الميتوكوندريا المستهدفة مؤشر الفائق، مبدل دائري بروتين فلوري الصفراء (MT-cpYFP). يتم إصلاح MT-cpYFP تخدير الماوس على محول المرحلة حسب الطلب ويتم أخذ الصور الوقت الفاصل بين وROM عضلات الهيكل العظمي المكشوفة من hindlimb. وضحى الماوس في وقت لاحق ويتم تعيين ما يصل لقلب Langendorff نضح مع حلول فسيولوجية في 37 درجة مئوية. يتم وضع القلب perfused في غرفة خاصة على المسرح المجهر متحد البؤر ويتم تطبيق ضغط لطيف لشل حركة القلب وقمع ضربات القلب التي يسببها قطعة أثرية الحركة. تم الكشف عن ومضات الفائق من قبل في الوقت الحقيقي التصوير 2D متحد البؤر على تردد إطار واحد في الثانية الواحدة. الحل نضح يمكن تعديلها لاحتواء ركائز مختلفة التنفس أو مؤشرات الفلورسنت الأخرى. ويمكن أيضا نضح تعديلها لإنتاج نماذج مرض مثل نقص التروية وضخه. هذا الأسلوب هو نهج فريد لتحديد وظيفة واحدة في الحبيبات الخيطية أنسجة سليمة والحية.

Introduction

الميتوكوندريا تلعب دورا محوريا في الطاقة الحيوية الخلوية، مما يشير الى الجذور الحرة، الأكسدة التوازن، وتنظيم أيون، وتقرير مصير الخلية 1،2. ضعف الميتوكوندريا غالبا ما ترافق وراء التسبب في الأمراض 3-6. وخصوصا في النظم العضلات مثل القلب والعضلات والهيكل العظمي، ويوفر التنفس الميتوكوندريا غالبية ATP لدعم التنظيم في الوقت المناسب من الكالسيوم داخل الخلايا وقوية 7،8 تطوير القوة. هذه العضلات امتلاك عدد كبير من الميتوكوندريا التي غالبا ما تشغل ما يصل الى 20-40٪ من حجم الخلية الكلي و"الثابتة" بين لل myofilaments 2.

على الرغم من العديد من الدراسات، فهمنا للتنظيم وظيفة الميتوكوندريا، وتحديدا في الجسم الحي، وتحت الظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، محدودة. أحد الأسباب هو أن غالبية الطرق وضعت لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في الاعتماد على vitro أو خارج الحي النهج، مثل مراقبة استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا المعزولة تستكمل مع ركائز مصطنعة، وغير المباشرة لتحديد وظيفة الميتوكوندريا من خلال التشكل (مثل الإلكترون المجهري)، نشاط انزيم (مثل النشاط أكونيتاز)، أو مستويات ATP داخل الخلايا 9-11 .

مؤخرا، مؤشرات الفلورسنت جزيء صغير مع تخصيب الميتوكوندريا النسبية طبقت لتقديم لمحة عن إشارات الميتوكوندريا، بما في ذلك إمكانات غشاء، والكالسيوم وأنواع الاكسجين التفاعلية (ROS)، في الخلايا سليمة 11-13. علاوة على ذلك، العديد من الأخضر بروتين فلوري (GFP) الأكسدة ومقرها وضعت مؤشرات لتحقيق ROS تقييم أكثر تحديدا من الأكسدة داخل الخلايا مجزأة أو ROS يشير 14-16. بين هذا، قمنا بتطوير مؤشر المشفرة وراثيا الفائق، ومبدل بروتين فلوري الصفراء دائرية، وtargeteد عليه في الميتوكوندريا (MT-cpYFP) 17. MT-cpYFP يمكن متحمس في 405 أو 488 نانومتر مع كل قمم الانبعاثات في 515 نانومتر. انبعاث في 488 نانومتر الإثارة تستجيب خصيصا لالفائق كما يتضح من السابق في التجارب المختبرية والمعايرة فيفو 17،18. يتم استخدام الانبعاثات في 405 نانومتر الإثارة كما الرقابة الداخلية (يرجى الرجوع إلى الشكل 1 من المرجع 17 للحصول على معلومات مفصلة عن الانبعاثات والإثارة أطياف MT-cpYFP في ظل ظروف مختلفة). مع مرور الزمن التصوير متحد البؤر، وهذا مؤشر يكشف انفجار الأحداث الإنتاج الفائق، واسمه ومضات الفائق، في الميتوكوندريا واحدة من الخلايا سليمة. يقدم الفائق فلاش بوصفها وظيفة مركب من التنفس الميتوكوندريا، المرفقة عابرة الميتوكوندريا الاستقطاب الغشاء وROS إنتاج 17-20. في الآونة الأخيرة، ونحن قد ولدت الأنسجة عموم MT-cpYFP الفئران المعدلة وراثيا باستخدام ناقلات تقوم تقنية-CAGGS-MT-cpYFP 17،19 C57/BL6 على خلفية والتحقق من اكسبريس قويةسيون من هذا المؤشر في قلب والعضلات والهيكل العظمي والأنسجة الأخرى (الشكل 2). فإن الفئران المعدلة وراثيا تكون متاحة للمحققين الأكاديمية المهتمة بناء على طلب وموافقة MTA من جامعة واشنطن.

في هذه الدراسة، ونحن تصف الوضع الطبيعي من ومضات التصوير الفائق في قلب Langendorff perfused وكذلك في الجسم الحي التصوير من الأحداث فلاش في عضلات الهيكل العظمي من تخدير MT-cpYFP الفئران المعدلة وراثيا في 17،19. هذه التكنولوجيا تتيح رصد في الوقت الحقيقي للأحداث إنتاج ريوس الميتوكوندريا واحد في حالة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في الجسم الحي أو 21،22. بل هو أيضا من المجدي استخدام نظام لرصد الأخرى المعلمات الميتوكوندريا واحد مثل غشاء المحتملة والكالسيوم مع مؤشرات الفلورسنت المناسبة. التقييم كذلك، في وقت واحد أو بالتوازي وظيفة الميتوكوندريا مع الأحداث داخل الخلايا (مثل العابرين الكالسيوم) أو وظيفة القلب (على سبيل المثال. جزء طرد) لا يمكن أن يتحقق. الاضطرابات المرضية، مثل نقص التروية وضخه، يمكن تطبيقها على قلب perfused لتقييم تأثير الإجهاد على وظيفة الميتوكوندريا واحدة في عضلة القلب سليمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تجربة إعداد

  1. إعداد محلول ملحي متساوي التوتر متوازنة (50 مل) تحتوي على: 140 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 2.5 مم CaCl 2، 2 مم MgCl 2 و 10 ملي HEPES (درجة الحموضة 7.2) لفي الجسم الحي التصوير العضلات والهيكل العظمي.
  2. تحضير 1 لتر من كريبس-هنسلايت العازلة (جسر الملك حسين) التي تحتوي على: 118 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5.3 ملي بوكل، 1.2 ملي MgSO 4، 0.5 ملي EDTA و 25 مم 3 NaHCO.
  3. فقاعة في جسر الملك حسين مع الغاز التي تحتوي على 95٪ O 2/5٪ CO 2 لمدة 10-15 دقيقة قبل إضافة 2 مم CaCl 2. إضافة ركائز التمثيل الغذائي (مثل الجلوكوز 10 ملم و 0.5 ملم البيروفات).
  4. إعداد الأدوات الجراحية بواسطة تعقيم المشبك، مقص، وملقط في الايثانول 70٪ ثم الشطف في تعقيم ده 2 O.
  5. بدوره على نظام نضح القلب، وضبط درجة الحرارة على حمام مائي ودائري، ضبط سرعة مضخة تحوي على 6 مل / دقيقة.
  6. فقاعة في جسر الملك حسين مع 95٪ O 2/ 5٪ CO 2 الغاز، ورصد معدل التدفق ودرجة الحرارة (37 درجة مئوية، ودرجة الحرارة قبل التحقيق الألياف البصرية) من النفايات السائلة. يحتاج النظام حوالي 20 دقيقة لدرجة حرارة الغاز وموازنة.

2. التصوير متحد البؤر من عضلات الهيكل العظمي في فيفو

  1. تخدير الفأر مع بنتوباربيتال (80 مغ / كغ، والملكية الفكرية). سوف الحيوان تصل التخدير الجراحي (أي رد حتى أخمص القدمين قرصة) في غضون 10-15 دقيقة والبقاء في هذا الوضع ل1-1.5 ساعة، كافية لفي الجسم الحي التصوير من عضلات الهيكل العظمي.
  2. إزالة الشعر على واحد من hindlimbs وتعقيم الجلد مع الايثانول 70٪.
  3. إجراء شق في الجلد على طول الجانب الخارجي من أطرافهم لفضح عضلات الساق.
  4. التقاط غمد بلطف مع ملقط حادة وإجراء شق من خلال ذلك مع مقص. مزيد من تشريح لإزالة غمد وفضح ألياف العضلات تحتها.
  5. لفي الجسم الحي تحميل TMRM في الهيكل العظميالعضلات، وتشمل TMRM (500 نانومتر) في متساوي التوتر حل متوازن الملح أن تزج العضلات لمدة 30 دقيقة ثم يغسل بها الحل خالية من المؤشر.
  6. وضع الماوس على جانبها على المجهر متحد البؤر (LSM زايس 510) مرحلة وكبح جماح الطرف الخلفي في موقف أن الهيكل العظمي والعضلات تتعرض تواجه ضد ساترة التي تشكل الجزء السفلي من الغرفة. ساترة هو في بين الأنسجة العضلية والهدف مقلوب (النفط 40X).
  7. اضغط على الساق أسفل بلطف لاجراء اتصالات ضيق بين الأنسجة وساترة. تزج العضلات التي تتعرض لها متساوي التوتر حل متوازن الملح.
  8. سجل ثنائية الأبعاد (2D، س ص) وصور متحد البؤر بمعدل عينة من ثانية واحدة لكل إطار. يتم ترقيم شدة كل بكسل على عمق 8 بت. عادة، تفحص المسلسل يحتوي على 100 لقطة.
  9. جمع الصور المتسلسلة التي كتبها الأولى مثيرة في 405 نانومتر وجمع في> 505 نانومتر ثم في 488 نانومتر في حين جمع> 505 نانومتر لثنائي الطول الموجي excitatioن تصوير MT-cpYFP. استخدام الإثارة متتابعة في 405 و 488 و 543 نانومتر، وجمع الانبعاثات في 505-545، 505-545، و> 560 نانومتر، على التوالي، على الثلاثي الطول الموجي الإثارة التصوير MT-cpYFP وTMRM.

3. التصوير متحد البؤر من القلب Perfused ماوس

  1. مباشرة بعد التصوير في الجسم الحي من عضلات الهيكل العظمي، وحقن الفأر مع 200 وحدة من الهيبارين (الملكية الفكرية). بعد عشر دقائق، الموت ببطء الماوس عن طريق بضع الصدر وبسرعة إزالة القلب مع الرئتين والغدة الصعترية المرتبطة به.
  2. بسرعة إزالة الرئة في المخزن الجليد الباردة. تحديد فصوص من الغدة الصعترية وقشر بلطف مرة أخرى لفضح الأبهر الصاعد.
  3. إزالة الغدة الصعترية وعزل الشريان الأورطي عن طريق إزالة أي نوع من الأنسجة المحيطة بها بعناية.
  4. اجراء خفض في نهاية العلوي من الأبهر الصاعد قبل أول فرع من قوس الأبهر.
  5. عقد جدار الشريان الأورطي برفق مع اثنين من الملقط الصغير خياطة لفضح التجويف ووضع بعناية الشريان الأورطي إلى كاليفورنياnnula (PE50 أنبوب). يقام الشريان الأورطي في مكان مع المشبك سفينة صغيرة في حين ترتبط خيوط بسرعة حول الشريان الأورطي.
  6. إزالة المشبك، بعناية تحقق قنية مع ملقط للتأكد من غيض من قنية فوق جذر الأبهر. تضاف العلاقات إضافية حسب الضرورة لعقد القلب في المكان.
  7. بدوره على مضخة تحوي ويروي القلب في 1 مل / دقيقة. فإن القلب استئناف الضرب على الارواء.
  8. ضبط الموقف من نظام الارواء ووضع القلب على المسرح المجهر. المرحلة ديه المحول الذي يسمح التدفئة للغرفة التي تحتوي على القلب.
  9. إضافة 1 مل من محلول الارواء جسر الملك حسين في غرفة لغمر جزئي القلب. مراقبة درجة حرارة الغرفة عند 37 درجة مئوية. إزالة النفايات السائلة من الغرفة باستخدام مضخة تمعجية.
  10. زيادة سرعة مضخة تحوي تدريجيا لتوفير تدفق كاف (حوالي 2 مل / دقيقة) إلى القلب.
  11. بعد 10 دقيقة من الاستقرار، يروي هيئة التعليم العاليغ مع 10 ميكرومتر blebbistatin و100-500 نانومتر TMRM. وسوف تبطئ ضربات القلب بعد 10 دقيقة.
  12. تطبيق ضغط لطيف على القلب للتأكد من ملامسة ضيق من القلب مع ساترة في الجزء السفلي من الغرفة، ومواصلة قمع ضربات القلب.
  13. اتبع نفس الإجراء لتصوير عضلة القلب سليمة مبائر كما هو موضح في الخطوة 2.8 أعلاه. ضبط البؤري بعناية لتكشف أوضح صورة ممكنة.

4. معالجة الصور وتحليل البيانات

  1. استخدام الأدوات التي توفرها "تحليل الفسيولوجية" وحدة من البرنامج لتحليل واحد متحد البؤر الميتوكوندريا ومضات وغشاء التغييرات المحتملة. وغالبا ما تتضمن هذه الوحدة في صورة الحصول على البرمجيات لنظام متحد البؤر ويسمح تحديد مناطق معينة في الصورة وكذلك الناتج من كثافة مضان مع تسميات الوقت.
  2. فتح قاعدة البيانات ثم ملف الصورة 2D المسلسل ليتم تحليلها.
  3. انقر على "المنطقةالاهتمام (ROI) يعني "للتبديل إلى" متوسط ​​رويس "واسطة. انقر على" المنطقة ذات الاهتمام (ROI) يعني "للتبديل إلى" يعني من رويس "واسطة.
  4. إيقاف عرض من القنوات الأخرى باستثناء قناة cpYFP 488 نانومتر لاختيار ومضات.
  5. تكبير الصورة ويدويا نقل شريط الشريحة للعب الصور 2D المسلسل.
  6. تحديد واحد ومضات الفائق الميتوكوندريا من خلال تحديد موقع الموقع حيث الزيادات إشارة الفلورسنت عابر. استخدام أداة ROI مناسبة للاحتفال ومضات. وسوف تتبع تظهر تعتمد على الوقت تغير مضان من كل ROI تظهر بجانب الصورة.
  7. بعد اختيار كل ومضات، بدوره على عرض من القنوات الأخرى. تحديد العائد على الاستثمار على الصورة خارج الخلية لخلفية إشارة الطرح. إخراج متوسط ​​مضان من كل ROI جنبا إلى جنب مع التسميات الوقت.
  8. تسجيل عدد من ومضات في كل من ملف صورة المسح المسلسل مع الوقت ومسح منطقةالخلية. استخدام Excel لحساب تردد فلاش كما عدد من ومضات في 100 ثانية / 1،000 ميكرون 2 مساحة الخلية.
  9. استخدام برنامج نموا العرف مكتوب في اللغة التفاعلية البيانات (IDL، ResearchSystems) لحساب المعلمات كل فلاش (السعة والوقت إلى الذروة ووقت تسوس). برامج IDL هو متاح تجاريا وبرنامج تطوير مخصصة لتحليل المعلمة فلاش يمكن الحصول عليها من المؤلف عند الطلب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وفقا لهذا البروتوكول، في الجسم الحي التصوير من الأحداث الميتوكوندريا واحد يمكن القيام به في عضلات الهيكل العظمي من الفئران تخدير تليها التصوير في الموقع perfused القلب (الشكل 1) في. سوف الإعداد الأمثل للظروف التصوير ضمان صور واضحة للأنسجة العضلات سليمة وطبقا لقرار واحد الحبيبات الخيطية (الشكل 2). وكثيرا ما يستخدم TMRM للتحقق من موقع MT-cpYFP وينبغي أن تبين وجود نمط التداخل الكامل مع الإشارة MT-cpYFP (الشكل 2). TMRM هو مؤشر المتاحة تجاريا لغشاء الميتوكوندريا المحتملة في قياس خلايا سليمة 23. أطياف لها يمكن تمييزها عن تلك التي cpYFP. علاوة على ذلك، باستخدام أسلوب الإثارة متتابعة، إشارات انبعاث TMRM وMT-cpYFP لن تتداخل مع بعضها 17 أخرى. صور ممثل هو مبين في الشكل 3 تشير إلى أن واحدة ACCO الميتوكوندريا الفائق فلاشmpanied بواسطة الاستقطاب غشاء يمكن تحديدها في المسلسل صور المسح 2D، مع زيادة عابرة مضان على خلفية إشارات في كل الأنسجة والعضلات والهيكل العظمي عضلة القلب (الشكل 3). إلى جانب ارتفاع القرار، ومطلوب أيضا كثافة مضان كافية. ويمكن تحقيق هذا عن طريق تحوير كثافة الليزر ومكاسب في قنوات جمع. بشكل عام، يتم تعيين إشارة مضان القاعدية من الخلية في ثلث إلى ربع كثافة القصوى من القناة. منذ مستوى التعبير عن MT-cpYFP وتحميل TMRM يمكن أن تختلف بين الحيوانات، وينبغي أن يتم صقل الشروط التصوير لكل تجربة. وقد استخدمت كل من الاضطرابات الفسيولوجية والمرضية، مثل ركائز الأيض 17،19، التحفيز الكهربائي (الشكل 4) 20، 17 الدماغية-ضخه، لإظهار أن يستجيب النشاط الفائق فلاش للتغيرات في حالة الأيض الخلوية. الشكل 1
الشكل 1. التوضيح التخطيطي من التصوير متحد البؤر من عضلات الهيكل العظمي والقلب Langendorff perfused. هو تخدير الماوس المعدلة وراثيا معربا عن MT-cpYFP وتتعرض عضلات الهيكل العظمي على أحد hindlimbs للتصوير متحد البؤر. ثم يتم perfused قلب في وضع Langendorff وتتم الصورة متحد البؤر. تستخدم لمعالجة الصور وتحليل البيانات والبرمجيات ومتحد البؤر برنامج تطوير العرف.

الرقم 2
الشكل 2. التصوير متحد البؤر من ألياف العضلات والهيكل العظمي في الجسم الحي وعضلة القلب في القلب perfused. A. صور الممثل تظهر عضلات الهيكل العظمي من nontransgenic (NTG) وMT-cpYFP المعدلة وراثيا (MT-cpYFP) الماوس محملة غشاء الميتوكوندريا المؤشر المحتملة، الصور TMRM. B. الممثل تبين ميوcardium من تي جي وMT-cpYFP الفئران في Langendorff perfused القلب. مثال: الإثارة الطول الموجي. هو متحمس MT-cpYFP في 405 و 488 نانومتر مع الانبعاثات التي تم جمعها في 505-530 نانومتر (الأزرق) و505-530 نانومتر (الأخضر)، على التوالي. هو متحمس TMRM في 543 نانومتر مع الانبعاثات التي تم جمعها في> 560 نانومتر (الأحمر). أشرطة النطاق = 50 ميكرومتر.

الرقم 3
الرقم 3. واحد ومضات الفائق الميتوكوندريا الكشف في عضلات الهيكل العظمي في الجسم الحي والقلب perfused. صور الممثل A. (اللوحة العليا) وآثار تعتمد على الوقت تغير مضان (MT-cpYFP في 405 و 488 نانومتر الإثارة وTMRM في 543 نانومتر الإثارة، اللوحة السفلى) مما يدل على واحد الميتوكوندريا فلاش الفائق (أبرزتها الأسهم البرتقالية في الموسع جزء من الصور) في ألياف العضلات والهيكل العظمي. لاحظ زيادة إشارة MT-cpYFP (في 488 نانومتر الإثارة) يرافقه انخفاض إشارة TMRM. B. الممثل ايماجوفاق (اللوحة العليا) وآثار تعتمد على الوقت تغير مضان (اللوحة السفلى) خلال واحدة الميتوكوندريا الفائق فلاش في عضلة القلب perfused. أشرطة النطاق = 50 ميكرومتر. اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 4
الشكل 4. زيادة تواتر فلاش الفائق في القلب perfused بواسطة التحفيز الكهربائي. وقد حفز القلب كهربائيا (سرعة، 4 V و 2 هرتز) لمدة 2 دقيقة. البيانات يعني ± SEM، ن = 8 خلايا. *: P <0.05 مقابل يستريح انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تصوير الأحداث الميتوكوندريا واحد في الحيوانات الحية أو الأجهزة perfused لديه ميزة كبيرة على الأساليب التقليدية لتقييم وظيفة الميتوكوندريا 17،19،21،22،24،25. تقنية الموضحة هنا يمكن أن يحقق في الوقت الحقيقي في تحديد الموضع وظيفة الميتوكوندريا في حالة فسيولوجية حقيقية في قرار التحت خلوية. وهذا مفيد بشكل خاص، عندما يقترن قياسات أخرى، لدراسة النظامية دور الميتوكوندريا في وظيفة طبيعية من جهاز معين أو نوع من الخلايا في الجسم الحي. هذا هو أسلوب معقد يجمع بين الفحص المجهري متحد البؤر ونظام نضح متطورة مع السيطرة على المعلمات المختلفة. مع ذلك، وقد استخدمت هذه التقنية لربط كامل الجسم مع ايض الجلوكوز في العضلات وظيفة الميتوكوندريا 17،19،20 ويعملون حاليا من قبلنا لدراسة ضعف الميتوكوندريا في أمراض القلب.

قلب perfusio Langendorffن نظام متوافق لتقييم وظيفة القلب من خلال مراقبة ضغط البطين الأيسر والتصوير داخل الخلايا كا 2 + العابرين خلال كل نبضة. بدلا من ذلك، المؤشرات الفلورسنت الأخرى مثل MitoSOX أو DCF يمكن perfused لتسهيل التصوير في الموقع من الحالة المستقرة مستويات ROS في عضلة القلب في. وقد Langendorff perfused القلب تستخدم على نطاق واسع لتقييم الاستجابة الفسيولوجية من القلب إلى (التحفيز مثل β-الأدرينالية التي كتبها الدوبوتامين) أو المرضية (مثل نقص التروية ضخه) الاضطرابات 26-28. ويمكن إدراج مثل هذه العلاجات في نظام التصوير متحد البؤر لتقييم وظيفة الميتوكوندريا واحد ردا على الضغوط.

وتشمل القيود المفروضة على هذه الطريقة في اختيار الأنسجة / الأجهزة التي هي مجدية للتصوير الحيوانات الحية. الأنسجة سطحية مثل العضلات والهيكل العظمي، وهياكل تحت الجلد والأعصاب السطحية هي مثالية لتصوير متحد البؤر في حي العانيسوء. الأعضاء الداخلية من الناحية الفنية غير ملائمة لتصوير الحيوانات الحية ويرجع ذلك إلى إلحاق أضرار جسيمة في الماوس أثناء تعريض الجهاز. ومع ذلك، يمكن تعيين الأعضاء الداخلية للحصول نضح الجهاز / الثقافة، مثل قلب Langendorff perfused أو ثقافة شريحة الدماغ، وإذا كان يمكن الحفاظ على بيئة المحاكاة الفسيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، متحد البؤر المجهر لديه عمق التصوير فعالة من 30-50 ميكرومتر، والذي يسمح التصوير من عدد قليل من طبقات من الخلايا تحت سطح الجهاز. فمن الممكن أن هذا النظام يمكن دمجها مع مجهر متعدد الفوتون، والتي لديها عمق الاختراق أعلى بكثير (على سبيل المثال تصل إلى 1 مم) واستخدمت لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في قلب سليمة 29. الحركة قطعة أثرية هو مسألة حاسمة أخرى ينبغي النظر فيها. أظهرت الميتوكوندريا في العضلات والهيكل العظمي وmyocytes القلب الحد الأدنى من الحركة أثناء الفحص. علاوة على ذلك، ضربات القلب التي يسببها الحركة قطعة أثرية يمكن قمعها أو القضاء عليه من خلال نضح مع blebbistatin لالثانية تطبيق ضغط لطيف على القلب. في أنواع الخلايا الأخرى، مثل الخلايا العصبية والخلايا الليفية، قد الميتوكوندريا الخضوع المستمر وحركات مثيرة. أثناء معالجة التصوير والتحليل، وأية تغييرات إشارة إلى الحركة بسبب قطعة أثرية ينبغي تحديد بعناية والمستبعدين.

وتشمل تحديات إضافية لهذه التقنية الحفاظ على حالة مناسبة في كافة مراحل التجربة، والضوابط الإيجابية وتفسير البيانات. لتصوير الهيكل العظمي والعضلات في الفئران تخدير، يجب أن تكون مغمورة السطح العضلات التي تتعرض لها من مخازن الفسيولوجية في كل وقت. وينبغي رصد العلامات الحيوية من الماوس مثل التنفس في كافة مراحل التجربة. للدراسات القلب perfused، الأوكسجين المناسبة، التحكم في درجة الحرارة والعرض الركيزة مطلوبة. ينصح الضوابط الإيجابية للتحقق من حالة واستجابة الأنسجة. للقيام بذلك، ويمكن حقن الفئران مع الأنسولين أو الجلوكوز وقلوب perfused يمكن أن يكون stimu كهربائياذا الصلة أو مع perfused ايزوبروتيرينول. ينبغي مراعاة زيادة مضات الفائق بعد هذه العلاجات (الشكل 4) 19،20. بالإضافة إلى ذلك، يتم أخذ الوقت الفاصل بين الصور عندما يتم قمعها قطعة أثرية الحركة من خلال تثبيط ضربات القلب، التي تنتج ظروف شبه الفسيولوجية بسبب انخفاض عبء العمل. وبالتالي، ينبغي النظر في التجربة القلب perfused بمثابة المحاكاة قريبة من الوضع في الجسم الحي.

أخيرا، تم تطوير هذه التقنية باستخدام متحد البؤر زايس (LSM 510). نظام متحد البؤر الأخرى (مثل نيكون، أوليمبوس أو لايكا) يمكن استخدامها إذا كان النظام يلبي المتطلبات التالية: (1) لديه الوقت الفاصل بين وضع إطار المسح الضوئي، (2) لديه معدل أخذ العينات من 1 ثانية / الإطار، و (3) يمكن أن تصل إلى قرار الحبيبات الخيطية واحد (على سبيل المثال 1 ميكرومتر × 2 ميكرون). البرنامج من نظام متحد البؤر يسمح عادة معالجة الصور بسيطة والتحليل، مثل تحديد رويس وكثافة مضان الإخراج مع رIME التسميات. بدلا من ذلك، يمكن استخدام البرمجيات J صورة لكل من تحليل الصور والفلاش حساب المعلمة.

وباختصار، فإن تصوير الأحداث الميتوكوندريا واحد مثل ومضات الفائق في عضلات الهيكل العظمي في الجسم الحي أو في القلب perfused هو نهج فريد لتحديد الوقت الحقيقي وظيفة الميتوكوندريا. هذا الأسلوب هو تقدم كبير خلال القياسات التقليدية في المختبر وسيوفر تقييم أكثر دقة من وظيفة الميتوكوندريا وعلاقته مع العمليات الخلوية / وظائف تحت الظروف الفسيولوجية الحقيقية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر الدكاترة. خه بينغ تشنغ، Huiliang تشانغ وستيفن Kolwicz على تعليقاتهم المفيدة والدعم التقني في تطوير هذا الأسلوب. وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح والمنح الإنمائية العلماء من جمعية القلب الأمريكية لWW.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Blebbistatin Toronto Research Chemicals B592500
CaCl2 Acros Organics AC34961-5000
EDTA Fisher Scientific BP120-500
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1
HEPES Sigma-Aldrich H7006-500
KCl Sigma-Aldrich P9541-1
MgCl2•6H2O Fisher Scientific BP214-500
MgSO4•7H2O Sigma-Aldrich M1880-1
NaCl Fisher Scientific BP358-212
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S8282-500
NaHCO3 Sigma-Aldrich S6014-1
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256-25
TMRM Invitrogen T-668
EQUIPMENT
Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brookes, P. S., Yoon, Y., Robotham, J. L., Anders, M. W., Calcium Sheu, S. S. Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, 817-833 (2004).
  2. Scheffler, I. E. Mitochondria. , 2nd, J. Wiley and Sons, Inc. (2008).
  3. Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondria in heart failure. Cardiovasc. Res. 88, 40-50 (2010).
  4. Griffiths, E. J. Mitochondria and heart disease. Adv. Exp. Med. Biol. 942, 249-267 (2012).
  5. Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).
  6. Pieczenik, S. R., Neustadt, J. Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease. Exp. Mol. Pathol. 83, 84-92 (2007).
  7. Szentesi, P., Zaremba, R., van Mechelen, W., Stienen, G. J. M. ATP utilization for calcium uptake and force production in different types of human skeletal muscle fibres. J. Physiol. 531, 393-403 (2001).
  8. Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J. Bioenerg. Biomembr. 41, 99-106 (2009).
  9. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. J. Biol. Chem. 217, 409-427 (1955).
  10. Lambert, A. J., Brand, M. D. Reactive oxygen species production by mitochondria. Methods Mol Biol. 554, 165-181 (2009).
  11. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
  12. Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15038-15043 (2006).
  13. Dickinson, B. C., Srikun, D., Chang, C. J. Mitochondrial-targeted fluorescent probes for reactive oxygen species. Curr. Opin. Chem. Biol. 14, 50-56 (2010).
  14. Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 22284-22293 (2004).
  15. Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 13044-13053 (2004).
  16. Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat. Methods. 3, 281-286 (2006).
  17. Wang, W., et al. Superoxide Flashes in Single Mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
  18. Wei-Lapierre, L., et al. Respective Contribution of Mitochondrial Superoxide and pH to Mitochondria-targeted Circularly Permuted Yellow Fluorescent Protein (mt-cpYFP) Flash Activity. J. Biol. Chem. 288, 10567-10577 (2013).
  19. Fang, H., et al. Imaging superoxide flash and metabolism-coupled mitochondrial permeability transition in living animals. Cell Res. 21, 1295-1304 (2011).
  20. Wei, L., et al. Mitochondrial superoxide flashes: metabolic biomarkers of skeletal muscle activity and disease. FASEB J. 25, 3068-3078 (2011).
  21. Sheu, S. S., Wang, W., Cheng, H., Dirksen, R. T. Superoxide flashes: illuminating new insights into cardiac ischemia/reperfusion injury. Future Cardiol. 4, 551-554 (2008).
  22. Wei, L., Dirksen, R. T. Perspectives on: SGP symposium on mitochondrial physiology and medicine: mitochondrial superoxide flashes: from discovery to new controversies. J. Gen. Physiol. 139, 425-434 (2012).
  23. Johnson, I., Spence, M. T. Z. Ch. 12.2. The Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , Life Technologies Corp. 510-511 (2013).
  24. Wang, X., et al. Superoxide flashes: elemental events of mitochondrial ROS signaling in the heart. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 940-948 (2012).
  25. Li, K., et al. Superoxide flashes reveal novel properties of mitochondrial reactive oxygen species excitability in cardiomyocytes. Biophys. J. 102, 1011-1021 (2012).
  26. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
  27. Pasdois, P., et al. Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers. Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).
  28. Granville, D. J., et al. Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1321-1326 (2004).
  29. Davidson, S. M., Yellon, D. M., Murphy, M. P., Duchen, M. R. Slow calcium waves and redox changes precede mitochondrial permeability transition pore opening in the intact heart during hypoxia and reoxygenation. Cardiovasc. Res. 93, 445-453 (2012).

Tags

علم وظائف الأعضاء، العدد 81، أمراض القلب، أمراض استقلابية، المجهري، متحد البؤر، الوقت الفاصل بين التصوير والعمليات الفسيولوجية، متحد البؤر التصوير، MT-cpYFP الفئران المعدلة وراثيا، ومضات الأكسيد، وقياس الميتوكوندريا واحدة، قلب Langendorff perfused، عضلات الهيكل العظمي،
التصوير متحد البؤر واحدة من الميتوكوندريا الأكسيد ومضات في القلب سليمة أو<em&gt; في فيفو</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gong, G., Wang, W. Confocal Imaging… More

Gong, G., Wang, W. Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo. J. Vis. Exp. (81), e50818, doi:10.3791/50818 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter