Imagerie confocale de simples mitochondriales superoxyde Flashs à coeur Intact ou In Vivo

Résumé

Microscopie confocale à balayage est appliqué pour l'imagerie des événements mitochondriaux simples dans le cœur perfusé ou les muscles squelettiques dans les animaux vivants. Surveillance en temps réel des processus mitochondriaux simples tels que les bouffées de superoxydes et les fluctuations potentielles membrane permet l'évaluation de la fonction mitochondriale dans un contexte physiologiquement pertinente et pendant perturbations pathologiques.

Résumé

Mitochondrie est un organite intracellulaire critique responsable de la production d'énergie et la signalisation intracellulaire dans les systèmes eucaryotes. Dysfonction mitochondriale accompagne souvent et contribue à la maladie humaine. La majorité des approches qui ont été développées pour évaluer la fonction mitochondriale et le dysfonctionnement sont basées sur in vitro ou ex vivo mesures. Les résultats de ces expériences ont la capacité à déterminer la fonction mitochondriale in vivo est limitée. Ici, nous décrivons une nouvelle approche qui utilise la microscopie à balayage confocal pour l'imagerie de tissus intacts en aminals vivants, ce qui permet l'évaluation de la fonction mitochondriale unique d'une manière en temps réel in vivo. Tout d'abord, on génère des souris transgéniques exprimant la cible mitochondriale indicateur de superoxyde, la protéine fluorescente jaune circulairement permuté (mt-cpYFP). Mt-cpYFP anesthésiés souris est fixé sur un adaptateur de platine sur mesure et images de time-lapse sont prises felon les muscles squelettiques exposées de la patte arrière. La souris est ensuite sacrifiée et le coeur est mis en place pour la perfusion de Langendorff avec des solutions physiologiques à 37 ° C. Le cœur perfusé est placé dans une chambre spéciale sur la platine du microscope confocal et une légère pression est appliquée pour immobiliser le cœur et supprimer rythme cardiaque induite par l'artefact de mouvement. Superoxydes sont détectés par les bouffées de 2D en temps réel imagerie confocale à une fréquence d'une image par seconde. La solution de perfusion peut être modifié pour contenir des substrats différents de respiration ou d'autres indicateurs fluorescents. La perfusion peut également être ajustée pour produire des modèles de maladies telles que l'ischémie et la reperfusion. Cette technique est une approche unique pour déterminer la fonction de mitochondrie unique dans les tissus intacts et in vivo.

Introduction

Les mitochondries jouent un rôle central dans la bioénergétique cellulaire, la signalisation des radicaux libres, homéostasie redox, la régulation ionique, et le destin des cellules détermination ^1,2. le dysfonctionnement des mitochondries et accompagne souvent la base de la pathogenèse des maladies ^6.3. En particulier dans les systèmes musculaires tels que le cœur et les muscles squelettiques, la respiration mitochondriale fournit la majorité de l'ATP pour soutenir la réglementation en temps opportun de calcium intracellulaire et robuste ^7,8 de développement des forces. Ces muscles possèdent un grand nombre de mitochondries qui o....

Protocole

Une. Expérience Préparation

1. Préparer la solution isotonique équilibrée de sel (50 ml) contenant: 140 mM de NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM de _CaCl2, 2 mM de _MgCl2 et 10 mM de HEPES (pH 7,2) pour l'imagerie du muscle squelettique in vivo.
2. Préparer 1 L de tampon Krebs-Henseleit (KHB) contenant: 118 mM de NaCl, KCl 5,3, 1,2 mM MgSO _4, EDTA 0,5 mM et 25 mM NaHCO _3.
3. La bulle KHB avec un gaz contenant 95% d'O _{2/5% de} CO2 pendant 10 à 15 min avant l'addition de 2 mM de _CaCl2. Ajouter substrats métaboliques (glucose par exemple 10 mM et de pyruvate 0,5).

Résultats

Selon ce protocole, l'imagerie in vivo des événements mitochondriaux simples peut être fait dans les muscles squelettiques de souris anesthésiées suivie par imagerie in situ coeur perfusé (figure 1) en. Le réglage optimal des conditions d'imagerie permettra d'assurer des images claires des tissus musculaires intactes et à la résolution de mitochondrie unique (figure 2). TMRM est souvent utilisé pour vérifier l'emplacement du mt-cpYFP et devrait montrer un modè.......

Discussion

Imagerie des événements mitochondriaux simples dans l'animal vivant ou organes perfusés a avantage significatif par rapport aux méthodes traditionnelles pour évaluation de la fonction mitochondriale ^{17,19,21,22,24,25.} La technique décrite ici peut obtenir en temps réel la détermination in situ de la fonction mitochondriale dans un véritable état ​​physiologique à la résolution subcellulaire dans. Ceci est particulièrement utile, lorsque combinés à d'autres mesures, par voie systémiqu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RÉACTIFS
Blebbitatine	Toronto Research Chemicals	B592500
CaCl2	Acros Organics	AC34961-5000
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1
HEPES	Sigma-Aldrich	H7006-500
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-1
MgCl2&bull ; 6H2O	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO4&bull ; 7H2O	Sigma-Aldrich	M1880-1
NaCl	Fisher Scientific	BP358-212
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282-500
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-1
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256-25
TMRM	Invitrogen	T-668
EQUIPMENT
Microscope à balayage linéaire confocal (LSM 510 Meta, Zeiss), logiciel version 4.2 SP1 avec module « Analyse physiologique ».