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Biology

सिंगल mitochondrial superoxide बरकरार दिल में चमक या की confocal इमेजिंग Published: November 5, 2013 doi: 10.3791/50818
Automatic Translation
1, 1
1Mitochondria and Metabolism Center, Department of Anesthesiology and Pain Medicine, University of Washington

Summary

Confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग जीवित जानवर perfused दिल या कंकाल की मांसपेशियों में एक mitochondrial घटनाओं इमेजिंग के लिए आवेदन किया है. ऐसे superoxide चमक और झिल्ली संभावित उतार चढ़ाव के रूप में एकल mitochondrial प्रक्रियाओं के वास्तविक समय की निगरानी एक physiologically प्रासंगिक संदर्भ में और रोग perturbations दौरान mitochondrial समारोह के मूल्यांकन के लिए सक्षम बनाता है.

Abstract

माइटोकांड्रिया यूकेरियोटिक प्रणालियों में ऊर्जा उत्पादन और intracellular संकेत के लिए जिम्मेदार एक महत्वपूर्ण intracellular organelle है. Mitochondrial रोग अक्सर accompanies और मानव रोग के लिए योगदान देता है. Mitochondrial समारोह और रोग का मूल्यांकन करने के लिए विकसित किया गया है कि दृष्टिकोण के बहुमत इन विट्रो या पूर्व vivo माप में पर आधारित हैं. इन प्रयोगों से परिणाम विवो में mitochondrial समारोह का निर्धारण करने में क्षमता सीमित है. यहाँ, हम vivo में एक वास्तविक समय पर ढंग से एक mitochondrial समारोह के मूल्यांकन की अनुमति देता है जो लाइव aminals में बरकरार ऊतकों की इमेजिंग, के लिए confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग का उपयोग एक उपन्यास दृष्टिकोण का वर्णन. सबसे पहले, हम mitochondrial लक्षित superoxide सूचक, चक्राकार permuted पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (MT-cpYFP) व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों उत्पन्न करते हैं. Anesthetized मीट्रिक टन cpYFP माउस एक कस्टम निर्मित मंच अनुकूलक और समय चूक छवियों च लिया जाता है पर तय हो गई हैhindlimb के उजागर कंकाल की मांसपेशियों रोम. माउस बाद में बलिदान किया है और दिल 37 डिग्री सेल्सियस पर शारीरिक समाधान के साथ Langendorff छिड़काव के लिए निर्धारित है perfused दिल confocal खुर्दबीन के मंच पर एक विशेष कक्ष में तैनात है और कोमल दबाव दिल स्थिर और दिल की धड़कन प्रेरित गति विरूपण साक्ष्य को दबाने के लिए लागू किया जाता है. Superoxide चमक प्रति सेकंड एक फ्रेम की एक आवृत्ति पर वास्तविक समय 2 डी confocal इमेजिंग से पता चला रहे हैं. छिड़काव समाधान विभिन्न श्वसन substrates या अन्य फ्लोरोसेंट संकेतक शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. छिड़काव भी ऐसे ischemia और reperfusion के रूप में रोग मॉडलों का उत्पादन करने के लिए समायोजित किया जा सकता है. इस तकनीक को बरकरार ऊतकों में और vivo में एकल माइटोकांड्रिया के समारोह का निर्धारण करने के लिए एक अनूठा तरीका है.

Introduction

Mitochondria एक सेल bioenergetics में केंद्रीय भूमिका, मुफ्त कट्टरपंथी संकेतन, redox homeostasis, आयन विनियमन, और सेल भाग्य निर्धारण 1,2 खेलते हैं. Mitochondria शिथिलता अक्सर accompanies और रोगों 3-6 के रोगजनन underlies. विशेष रूप से ऐसे दिल और कंकाल की मांसपेशियों के रूप में मांसपेशियों सिस्टम में, mitochondrial श्वसन intracellular कैल्शियम और मजबूत बल विकास 7,8 के समय पर नियमन का समर्थन करने के लिए एटीपी के बहुमत प्रदान करता है. इन मांसपेशियों अक्सर कुल सेल मात्रा का 20-40% तक कब्जा है और myofilaments 2 के बीच में "तय" कर रहे हैं कि mitochondria की एक बड़ी संख्या के अधिकारी.

कई अध्ययनों के बावजूद, विशेष रूप से vivo में और physiologically प्रासंगिक परिस्थितियों में mitochondrial समारोह विनियमन, के बारे में हमारी समझ, सीमित है. कारणों में से एक mitochondrial समारोह के मूल्यांकन के लिए विकसित की विधियों की है कि बहुमत vitr में पर भरोसा हैओ या पूर्व में इस तरह के कृत्रिम substrates के साथ पूरक पृथक mitochondria की ऑक्सीजन की खपत, और आकृति विज्ञान के माध्यम से mitochondrial समारोह का अप्रत्यक्ष दृढ़ संकल्प (जैसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी), एंजाइम गतिविधि (जैसे aconitase गतिविधि), या intracellular एटीपी के स्तर 9-11 निगरानी के रूप में विवो दृष्टिकोण, .

हाल ही में, रिश्तेदार mitochondrial संवर्धन के साथ छोटे अणु फ्लोरोसेंट संकेतक बरकरार कोशिकाओं में झिल्ली क्षमता, कैल्शियम और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS), 11-13 सहित mitochondrial संकेतों की एक झलक, प्रदान करने के लिए लागू किया गया है. इसके अलावा, कई हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) redox आधारित और आरओएस संकेतक बंटे intracellular redox या आरओएस 14-16 संकेतों के अधिक विशिष्ट मूल्यांकन प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया है. इस के अलावा, हम एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग superoxide सूचक, परिपत्र permuted पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन, और targete विकसितmitochondria (MT-cpYFP) 17 में डी यह. MT-cpYFP 515 एनएम पर दोनों उत्सर्जन चोटियों के साथ 405 या 488 एनएम पर उत्साहित किया जा सकता है. 488 एनएम उत्तेजना पर उत्सर्जन में इन विट्रो और इन विवो calibrations 17,18 में पिछले द्वारा दिखाया के रूप में superoxide के लिए विशेष रूप से उत्तरदायी है. 405 एनएम उत्तेजना में उत्सर्जन (विभिन्न परिस्थितियों में मीट्रिक टन cpYFP के उत्सर्जन और उत्तेजना स्पेक्ट्रा पर विस्तृत जानकारी के लिए रेफरी 17 में से 1 चित्रा देखें) आंतरिक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है. समय चूक confocal इमेजिंग के साथ, इस सूचक बरकरार कोशिकाओं की एकल mitochondria में superoxide चमक नामित superoxide उत्पादन घटनाओं, फोड़ पता लगाता है. Superoxide फ़्लैश mitochondrial श्वसन, साथ क्षणिक mitochondrial झिल्ली विध्रुवण और आरओएस उत्पादन 17-20 की एक समग्र समारोह के रूप में कार्य करता है. हाल ही में, हम पीयूसी-CAGGS-MT-cpYFP वेक्टर C57/BL6 पृष्ठभूमि पर 17,19 का उपयोग अखिल ऊतक मीट्रिक टन cpYFP चूहों उत्पन्न और मजबूत अभिव्यक्ति सत्यापित किया हैदिल, कंकाल की मांसपेशियों और अन्य ऊतकों (चित्रा 2) में इस सूचक के सायन. ट्रांसजेनिक चूहों अनुरोध और वाशिंगटन विश्वविद्यालय द्वारा एमटीए अनुमोदन पर रुचि शैक्षिक जांचकर्ताओं के लिए उपलब्ध हो जाएगा.

इस अध्ययन में, हम सीटू Langendorff perfused दिल में superoxide चमक की इमेजिंग के साथ ही anesthetized मीट्रिक टन cpYFP ट्रांसजेनिक चूहों 17,19 के कंकाल की मांसपेशियों में फ्लैश घटनाओं के vivo इमेजिंग में वर्णन. यह तकनीक एक physiologically प्रासंगिक हालत में या विवो 21,22 में एक mitochondrial ROS उत्पादन घटनाओं के वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति देता है. यह ऐसी उपयुक्त फ्लोरोसेंट संकेतक के साथ झिल्ली क्षमता और कैल्शियम के रूप में अन्य एकल mitochondrial मानकों की निगरानी के लिए प्रणाली का उपयोग करने के लिए भी संभव है. Intracellular घटनाओं (जैसे कैल्शियम यात्रियों) या दिल समारोह (साथ mitochondrial समारोह के आगे, एक साथ या समानांतर मूल्यांकन जैसे. इंजेक्शन फ्रैक्शन) प्राप्त किया जा सकता है. ऐसे ischemia और reperfusion के रूप में रोग perturbations, बरकरार मायोकार्डियम में एकल mitochondrial समारोह पर तनाव के प्रभाव का आकलन करने के लिए perfused दिल के लिए लागू किया जा सकता है.

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Protocol

1. प्रयोग तैयारी

  1. 140 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 2.5 मिमी 2 CaCl, 2 मिमी 2 MgCl और 10 मिमी HEPES में विवो कंकाल की मांसपेशी इमेजिंग के लिए (7.2 पीएच): युक्त isotonic संतुलित नमक समाधान (50 मिलीलीटर) तैयार करें.
  2. 118 मिमी NaCl, 5.3 मिमी KCl, 1.2 मिमी MgSO 4, 0.5 मिमी EDTA और 25 मिमी 3 NaHCO: युक्त क्रेब्स-Henseleit बफर (KHB) का 1 एल तैयार करें.
  3. बुलबुला गैस युक्त 95% 2 हे / 5 पिछले 2 मिमी 2 CaCl के अलावा 10-15 मिनट के लिए% सीओ 2 के साथ KHB. चयापचय (जैसे 10 मिमी ग्लूकोज और 0.5 मिमी पाइरूवेट) जोड़ें.
  4. 70% इथेनॉल में दबाना, कैंची, और संदंश स्टरलाइज़ और फिर निष्फल DDH 2 ओ में rinsing द्वारा सर्जिकल उपकरणों की तैयारी
  5. , दिल छिड़काव प्रणाली पर बारी पानी स्नान और फैलानेवाला पर तापमान को समायोजित, 6 मिलीग्राम / मिनट के लिए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप की गति निर्धारित किया है.
  6. 95% 2 हे के साथ बुलबुला KHB/ 5% सीओ 2 गैस, और प्रवाह के प्रवाह की दर और (एक फाइबर ऑप्टिक तापमान जांच से 37 डिग्री सेल्सियस) तापमान की निगरानी. सिस्टम गैस और तापमान संतुलन के बारे में 20 मिनट की जरूरत है.

2. Vivo में कंकाल की मांसपेशियों की confocal इमेजिंग

  1. Pentobarbital (80 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) के साथ माउस anesthetize. पशु 10-15 मिनट के भीतर शल्य संज्ञाहरण (पैर की अंगुली चुटकी करने के लिए कोई जवाब नहीं है) तक पहुँचने और कंकाल की मांसपेशियों के vivo इमेजिंग के लिए पर्याप्त 1-1.5 घंटा, के लिए इस स्थिति में रहेगा.
  2. Hindlimbs में से एक पर बाल निकालें और 70% इथेनॉल के साथ त्वचा बाँझ.
  3. Gastrocnemius मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए अंग के बाहरी पक्ष के साथ त्वचा पर एक चीरा बनाओ.
  4. एक तेज संदंश के साथ धीरे epimysium उठाओ और कैंची के साथ इसके माध्यम से एक चीरा बनाते हैं. इसके अलावा epimysium हटाने और यह नीचे मांसपेशी फाइबर का पर्दाफाश करने के लिए काटना.
  5. कंकाल में TMRM के vivo लोड करने के लिएपेशी, 30 मिनट के लिए मांसपेशियों को विसर्जित और फिर सूचक मुक्त समाधान से बाहर धोने के लिए isotonic संतुलित नमक के घोल में TMRM (500 एनएम) शामिल हैं.
  6. Confocal खुर्दबीन (Zeiss LSM 510) के मंच पर अपने पक्ष पर माउस रखो और उजागर कंकाल की मांसपेशी कक्ष के नीचे रूपों कि coverslip के खिलाफ सामना करना पड़ रहा है कि एक स्थिति में पीछे अंग को नियंत्रित करना. coverslip मांसपेशियों के ऊतकों और उल्टे उद्देश्य (40x तेल) के बीच में है.
  7. ऊतक और coverslip के बीच तंग संपर्क बनाने के लिए धीरे नीचे पैर प्रेस. Isotonic संतुलित नमक के घोल में उजागर मांसपेशियों को विसर्जित कर दिया.
  8. फ्रेम प्रति एक दूसरे के एक नमूना दर में रिकॉर्ड दो आयामी (2 डी, XY) confocal छवियों. प्रत्येक पिक्सेल की तीव्रता 8 बिट गहराई पर डिजीटल है. आमतौर पर, एक धारावाहिक स्कैन 100 फ्रेम शामिल हैं.
  9. > 505 एनएम पर पहले 405 एनएम पर रोमांचक और इकट्ठा करके अनुक्रमिक छवियों को इकट्ठा तो 488 एनएम पर दोहरी तरंगदैर्ध्य excitatio के लिए> 505 एनएम पर एकत्रित करते समयMT-cpYFP के एन इमेजिंग. MT-cpYFP और TMRM की ट्रिपल तरंगदैर्ध्य उत्तेजना इमेजिंग के लिए, क्रमश: 405, 488 और 543 एनएम पर अनुक्रमिक उत्तेजना का उपयोग, और, 505-545 पर 505-545 उत्सर्जन जमा है, और> 560 एनएम.

3. Perfused माउस दिल की confocal इमेजिंग

  1. इसके तत्काल बाद कंकाल की मांसपेशियों के vivo इमेजिंग के बाद, हेपरिन (आईपी) की 200 इकाइयों के साथ माउस इंजेक्षन. दस मिनट बाद, thoracotomy द्वारा माउस euthanize और इसे जल्दी से जुड़ी फेफड़ों और थाइमस साथ दिल को हटा दें.
  2. जल्दी ठंडा बफर में फेफड़ों को हटा दें. थाइमस की पालियों को पहचानें और धीरे आरोही महाधमनी का पर्दाफाश करने के लिए वापस छील.
  3. थाइमस निकालें और ध्यान से किसी भी आसपास के ऊतकों को हटाने के द्वारा महाधमनी अलग.
  4. महाधमनी चाप की पहली शाखा से पहले आरोही महाधमनी के ऊपरी छोर पर एक कटौती करें.
  5. लुमेन बेनकाब करने के लिए दो माइक्रो suturing संदंश के साथ धीरे महाधमनी की दीवार रखें और ध्यान से सीए पर महाधमनी जगहnnula (PE50 ट्यूब). टांके जल्दी महाधमनी के आसपास बंधे हैं, जबकि महाधमनी एक माइक्रो पोत क्लैंप के साथ जगह में आयोजित किया जाता है.
  6. प्रवेशनी की नोक महाधमनी जड़ से ऊपर है बनाना संदंश के साथ प्रवेशनी की जांच सावधानी से, दबाना निकालें. अपर संबंधों जगह में दिल पकड़ करने के लिए आवश्यक के रूप में जुड़ जाते हैं.
  7. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप पर बारी और / मिनट 1 मिलीलीटर में दिल छिड़कना. दिल छिड़काव पर पिटाई फिर से शुरू होगा.
  8. छिड़काव प्रणाली की स्थिति को समायोजित करें और खुर्दबीन मंच पर दिल डाल दिया. मंच दिल रखती है कि चैंबर के ताप की अनुमति देता है कि एक एडाप्टर है.
  9. आंशिक रूप से दिल डूब कक्ष में KHB छिड़काव समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर चैंबर के तापमान पर नजर एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर कक्ष से प्रवाह निकालें.
  10. धीरे - धीरे दिल को पर्याप्त प्रवाह (लगभग 2 मिलीग्राम / मिनट) प्रदान करने के लिए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप की गति में वृद्धि.
  11. स्थिरीकरण के 10 मिनट के बाद, hea छिड़कना10 माइक्रोन blebbistatin और 100-500 एनएम TMRM साथ RT. दिल की धड़कन 10 मिनट के बाद धीमी हो जाएगी.
  12. चैम्बर के तल पर coverslip के साथ दिल की तंग संपर्क सुनिश्चित करने के लिए और आगे की दिल की धड़कन को दबाने के लिए दिल पर कोमल दबाव लागू करें.
  13. ऊपर 2.8 कदम में वर्णित के रूप में बरकरार मायोकार्डियम के confocal इमेजिंग के लिए एक ही प्रक्रिया का पालन करें. ध्यान से संभव सबसे साफ़ छवि प्रकट करने के लिए केन्द्र विमान को समायोजित.

4. छवि प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण

  1. एकल mitochondrial चमक और झिल्ली संभावित परिवर्तनों का विश्लेषण करने के लिए confocal सॉफ्टवेयर की "शारीरिक विश्लेषण" मॉड्यूल द्वारा प्रदान की गई उपकरण का प्रयोग करें. इस मॉड्यूल अक्सर confocal प्रणाली की छवि प्राप्त सॉफ्टवेयर में शामिल और छवि में कुछ क्षेत्रों के निर्धारण के साथ ही समय लेबल के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता के उत्पादन की अनुमति देता है.
  2. डेटाबेस और विश्लेषण किया जाना है तो धारावाहिक 2 डी छवि फ़ाइल को खोलें.
  3. "क्षेत्र क्लिक करेंब्याज (आरओआई) मतलब ROIs के "करने के लिए स्विच करने के लिए" मतलब का मतलब ROIs की "मोड" के लिए स्विच करने के लिए "ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) मतलब" मोड. क्लिक करें ".
  4. चमक के चयन के लिए cpYFP 488 एनएम चैनल को छोड़कर अन्य चैनलों का प्रदर्शन बंद कर.
  5. छवि में और मैन्युअल ज़ूम धारावाहिक 2D छवियों खेलने के लिए स्लाइड पट्टी चाल है.
  6. जहां फ्लोरोसेंट संकेत बढ़ जाती है क्षणिक साइट का पता लगाने के द्वारा एकल mitochondrial superoxide चमक को पहचानें. चमक चिह्नित करने के लिए उचित लागत पर लाभ उपकरण का उपयोग करें. प्रत्येक रॉय के समय पर निर्भर प्रतिदीप्ति परिवर्तन दिखा ट्रेस छवि के बगल में दिखाई देगा.
  7. सब चमक चयन करने के बाद, अन्य चैनलों का प्रदर्शन चालू. पृष्ठभूमि संकेत घटाव के लिए कक्ष के बाहर छवि पर एक रॉय का चयन करें. एक साथ समय लेबल के साथ उत्पादन प्रत्येक रॉय की औसत प्रतिदीप्ति.
  8. स्कैन समय और क्षेत्र के साथ एक साथ धारावाहिक स्कैनिंग छवि फ़ाइल में से प्रत्येक में चमक की संख्या रिकॉर्डसेल. Excel का उपयोग करें 100 सेकंड / 1000 माइक्रोन 2 सेल क्षेत्र के प्रति चमक की संख्या के रूप में फ्लैश आवृत्ति की गणना करने के लिए.
  9. प्रत्येक फ्लैश (आयाम, पीक करने के लिए समय और क्षय समय) के मापदंडों की गणना करने के लिए इंटरएक्टिव डेटा भाषा (आईडीएल, ResearchSystems) में लिखा एक कस्टम विकसित प्रोग्राम का उपयोग करें. आईडीएल सॉफ्टवेयर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और फ्लैश पैरामीटर के विश्लेषण के लिए कस्टम विकसित कार्यक्रम अनुरोध पर लेखक की ओर से प्राप्त किया जा सकता है.

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल के अनुसार, एक mitochondrial घटनाओं के vivo इमेजिंग anesthetized चूहों के कंकाल की मांसपेशियों में किया जा सकता perfused दिल में सीटू इमेजिंग (चित्रा 1) में से पीछा किया. इमेजिंग शर्तों के इष्टतम सेटिंग बरकरार मांसपेशियों के ऊतकों की स्पष्ट छवियों को सुनिश्चित करने और एकल माइटोकांड्रिया संकल्प (चित्रा 2) के साथ होगा. TMRM अक्सर मीट्रिक टन cpYFP का स्थान सत्यापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है और माउंट-cpYFP संकेत के साथ एक पूर्ण ओवरलैपिंग पैटर्न (चित्रा 2) दिखाना चाहिए. TMRM बरकरार कोशिकाओं 23 में mitochondrial झिल्ली संभावित माप के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सूचक है. इसके स्पेक्ट्रा cpYFP के उस से अलग पहचाना जाता है. इसके अलावा, अनुक्रमिक उत्तेजना विधि का उपयोग कर, TMRM और MT-cpYFP के उत्सर्जन का संकेत है एक दूसरे को 17 के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा. 3 चित्र में दिखाया प्रतिनिधि छवियों से संकेत मिलता है कि एकल mitochondrial superoxide फ़्लैश ACCOझिल्ली विध्रुवण द्वारा mpanied दोनों कंकाल मांसपेशियों के ऊतकों में पृष्ठभूमि संकेतों पर एक क्षणिक प्रतिदीप्ति वृद्धि और मायोकार्डियम (चित्रा 3) के साथ, धारावाहिक 2D स्कैनिंग छवियों में पहचाना जा सकता है. उच्च संकल्प के अलावा, पर्याप्त प्रतिदीप्ति तीव्रता भी आवश्यक है. यह लेजर तीव्रता और एकत्रित चैनलों में लाभ modulating द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. सामान्य में, सेल से बेसल प्रतिदीप्ति संकेत चैनल के अधिक से अधिक तीव्रता के चौथे करने के एक तिहाई पर सेट किया जाता है. MT-cpYFP और TMRM की लोडिंग की अभिव्यक्ति के स्तर जानवरों के बीच भिन्न हो सकते हैं, इमेजिंग शर्तों के ठीक ट्यूनिंग एक प्रयोग के लिए किया जाना चाहिए. ऐसे चयापचय 17,19, बिजली की उत्तेजना (चित्रा 4) के 20, इस्कीमिक-reperfusion की 17, के रूप में दोनों शारीरिक और रोग perturbations, कि superoxide फ़्लैश गतिविधि सेलुलर चयापचय की स्थिति में परिवर्तन का जवाब दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. चित्रा 1
चित्रा 1. कंकाल की मांसपेशियों और Langendorff perfused दिल की confocal इमेजिंग की योजनाबद्ध चित्रण. मीट्रिक टन cpYFP व्यक्त ट्रांसजेनिक माउस anesthetized है और hindlimbs में से एक पर कंकाल की मांसपेशियों confocal इमेजिंग के लिए सामने आ रहे हैं. दिल तो Langendorff मोड में perfused है और confocal छवि आयोजित किया जाता है. छवि प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण confocal सॉफ्टवेयर और कस्टम विकसित कार्यक्रम का इस्तेमाल किया.

चित्रा 2
चित्रा 2. Perfused दिल में विवो और मायोकार्डियम में कंकाल की मांसपेशी फाइबर के confocal इमेजिंग. ए प्रतिनिधि nontransgenic (Ntg) के कंकाल की मांसपेशियों दिखा छवियों और MT-cpYFP ट्रांसजेनिक mitochondrial झिल्ली संभावित सूचक के साथ लोड (MT-cpYFP) माउस, Myo दिखा TMRM. बी प्रतिनिधि छवियाँLangendorff में Ntg की cardium और MT-cpYFP चूहों दिल perfused. पूर्व: उत्तेजना तरंगदैर्ध्य. MT-cpYFP क्रमश: 505-530 एनएम (नीला) और 505-530 एनएम (हरा), पर एकत्र उत्सर्जन के साथ 405 और 488 एनएम पर उत्साहित है. TMRM> 560 एनएम (लाल) में एकत्र उत्सर्जन के साथ 543 एनएम पर उत्साहित है. स्केल सलाखों 50 माइक्रोन =.

चित्रा 3
चित्रा 3. सिंगल mitochondrial superoxide चमक विवो में और perfused दिल में कंकाल की मांसपेशियों में पाया. ए प्रतिनिधि छवियों (ऊपरी पैनल) और बढ़े में नारंगी तीर से प्रकाश डाला एक एकल mitochondrial superoxide फ्लैश (दिखा समय पर निर्भर (405 में मीट्रिक टन cpYFP और 543 एनएम उत्तेजना पर 488 एनएम उत्तेजना और TMRM, कम पैनल) प्रतिदीप्ति परिवर्तन के निशान कंकाल की मांसपेशी फाइबर में छवियों का भाग). TMRM संकेत की कमी हुई द्वारा (488 एनएम उत्तेजना पर) की वृद्धि हुई मीट्रिक टन cpYFP संकेत नोट के साथ है. बी प्रतिनिधि imagतों (ऊपरी पैनल) और perfused मायोकार्डियम में एक भी mitochondrial superoxide फ्लैश के दौरान समय पर निर्भर प्रतिदीप्ति परिवर्तन (कम पैनल) के निशान. स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. . बिजली की उत्तेजना से perfused दिल में superoxide फ़्लैश आवृत्ति में वृद्धि हुई दिल विद्युत 2 मिनट के लिए (4 वी और 2 हर्ट्ज पेसिंग) प्रेरित किया गया था. डेटा मतलब ± SEM हैं, एन = 8 कोशिकाओं. *:. पी <आराम बनाम 0.05 बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

जीवित पशु या perfused अंगों में एक mitochondrial घटनाओं इमेजिंग mitochondrial समारोह मूल्यांकन 17,19,21,22,24,25 के लिए पारंपरिक तरीकों से अधिक महत्वपूर्ण लाभ है. यहाँ वर्णित तकनीक subcellular संकल्प पर एक वास्तविक शारीरिक हालत में mitochondrial समारोह की सीटू निर्धारण में वास्तविक समय हासिल कर सकते हैं. प्रणालीबद्ध विवो में एक विशेष अंग या सेल प्रकार की सामान्य समारोह में mitochondria की भूमिका का अध्ययन करने के लिए, अन्य माप के साथ संयुक्त जब यह विशेष रूप से उपयोगी है. यह विभिन्न मापदंडों के नियंत्रण के साथ confocal माइक्रोस्कोपी और परिष्कृत छिड़काव प्रणाली को जोड़ती है एक जटिल तकनीक है. फिर भी, इस तकनीक पेशी mitochondrial समारोह 17,19,20 के साथ पूरे शरीर में ग्लूकोज चयापचय से जोड़ने के लिए इस्तेमाल किया गया है और वर्तमान में हृदय रोग में mitochondrial रोग अध्ययन करने के लिए हमारे द्वारा नियोजित कर रहे हैं.

Langendorff दिल perfusion प्रणाली बाएं वेंट्रिकल दबाव की निगरानी और प्रत्येक धड़कन के दौरान intracellular सीए 2 + यात्रियों इमेजिंग के माध्यम से हृदय समारोह मूल्यांकन करने के लिए संगत है. वैकल्पिक रूप से, इस तरह के MitoSOX या डीसीएफ के रूप में अन्य फ्लोरोसेंट संकेतक मायोकार्डियम में स्थिर राज्य ROS स्तर के सीटू इमेजिंग में सुविधाजनक बनाने के लिए perfused किया जा सकता है. Langendorff perfused दिल व्यापक रूप से शारीरिक (dobutamine द्वारा जैसे β एड्रीनर्जिक उत्तेजना) या रोग (जैसे ischemia reperfusion) perturbations 26-28 को दिल की प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस तरह के उपचार तनावों के जवाब में एक mitochondrial समारोह का आकलन करने के लिए confocal इमेजिंग सिस्टम में शामिल किया जा सकता है.

इस विधि की सीमाओं जीवित पशु इमेजिंग के लिए संभव है कि ऊतकों / अंगों के चयन में शामिल हैं. ऐसे कंकाल की मांसपेशियों, चमड़े के नीचे संरचनाओं और सतही नसों के रूप में सतही ऊतकों लाइव ani में confocal इमेजिंग के लिए आदर्श होते हैंमॉल. अंग को उजागर करते हुए आंतरिक अंगों की वजह से माउस को व्यापक क्षति के लिए जीना पशु इमेजिंग के लिए तकनीकी रूप से अनुपयुक्त हैं. हालांकि, आंतरिक अंगों एक शारीरिक अनुकरण करनेवाला वातावरण बनाए रखा जा सकता है, तो ऐसे Langendorff perfused दिल या मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृति के रूप में, अंग छिड़काव / संस्कृति के लिए स्थापित किया जा सकता है. इसके अलावा, confocal खुर्दबीन अंग सतह के नीचे कोशिकाओं की कुछ परतों की अनुमति देता है इमेजिंग जो 30-50 मीटर, के एक प्रभावी इमेजिंग गहराई है. यह इस सिस्टम (1 मिमी तक उदाहरण के लिए) एक बहुत अधिक प्रवेश गहराई है जो एक बहु - फोटोन खुर्दबीन के साथ जोड़ा जा सकता है और बरकरार दिल 29 में mitochondrial समारोह का आकलन किया गया है कि संभव है. गति artifact विचार किया जाना चाहिए कि एक और महत्वपूर्ण मुद्दा है. कंकाल की मांसपेशियों और हृदय myocytes में mitochondria स्कैन के दौरान कम से कम आंदोलन दिखाया. इसके अलावा, दिल की धड़कन प्रेरित गति artifact blebbistatin एक साथ छिड़काव द्वारा दबा दिया या समाप्त किया जा सकताND दिल पर कोमल दबाव के आवेदन. ऐसे न्यूरॉन्स और fibroblasts के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं में mitochondria लगातार और नाटकीय आंदोलनों से गुजरना सकता है. इमेजिंग प्रसंस्करण और विश्लेषण के दौरान, गति artifact की वजह से किसी भी संकेत परिवर्तन को ध्यान से पहचान की है और बाहर रखा जाना चाहिए.

इस तकनीक के अतिरिक्त चुनौतियों प्रयोग के दौरान उचित हालत, सकारात्मक नियंत्रण और डेटा व्याख्या को बनाए रखने में शामिल हैं. Anesthetized चूहों में कंकाल की मांसपेशी इमेजिंग के लिए, उजागर मांसपेशी सतह सभी समय पर शारीरिक बफ़र्स में डूब जाना चाहिए. ऐसी श्वास के रूप में माउस के महत्वपूर्ण संकेत प्रयोग के दौरान निगरानी की जानी चाहिए. Perfused दिल पढ़ाई के लिए, उचित oxygenation, तापमान नियंत्रण और सब्सट्रेट आपूर्ति के लिए आवश्यक हैं. सकारात्मक नियंत्रण ऊतकों की हालत और जवाबदेही को सत्यापित करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं. ऐसा करने के लिए, चूहों इंसुलिन या ग्लूकोज और perfused दिल के साथ इंजेक्शन जा सकता है विद्युत stimu हो सकता हैlated या isoproterenol साथ perfused. बढ़ी हुई superoxide चमक इन उपचार (चित्रा 4) 19,20 के बाद मनाया जाना चाहिए. प्रस्ताव विरूपण साक्ष्य के कारण कमी आई काम के बोझ के उप शारीरिक स्थिति पैदा करता है जो बाधा दिल की धड़कन, के माध्यम से दबा दिया जाता है जब इसके अलावा, समय चूक छवियों ले रहे हैं. इस प्रकार, perfused दिल प्रयोग में vivo स्थिति के एक करीबी अनुकरण करनेवाला के रूप में माना जाना चाहिए.

अंत में, तकनीक एक Zeiss confocal (एल एस एम 510) का उपयोग कर विकसित किया गया था. अन्य confocal प्रणाली (जैसे Nikon, ओलिंप या Leica) प्रणाली निम्न आवश्यकताओं को पूरा करती है इस्तेमाल किया जा सकता है: (1) समय चूक फ्रेम स्कैन विधा है, (2) 1 सेकंड / फ्रेम का एक नमूना दर है, और (3) एकल माइटोकांड्रिया संकल्प (जैसे 1 माइक्रोन एक्स 2 माइक्रोन) तक पहुंच सकता है. एक confocal सिस्टम के सॉफ्टवेयर आमतौर पर अनुमति देता है इस तरह के टी के साथ ROIs और प्रतिदीप्ति तीव्रता उत्पादन को परिभाषित करने के रूप में सरल इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण,लेबल IME. वैकल्पिक रूप से, छवि जम्मू सॉफ्टवेयर छवि विश्लेषण और फ्लैश पैरामीटर गणना दोनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

संक्षेप में, इस तरह के vivo में या perfused दिल में कंकाल की मांसपेशियों में superoxide चमक के रूप में एकल mitochondrial घटनाओं की इमेजिंग mitochondrial समारोह की वास्तविक समय निर्धारण के लिए एक अनूठा तरीका है. इस तकनीक को परंपरागत इन विट्रो माप एक महत्वपूर्ण प्रगति पर है और mitochondrial समारोह और वास्तविक शारीरिक शर्तों के तहत सेलुलर प्रक्रियाओं / कार्यों के साथ अपने रिश्ते के एक अधिक सटीक मूल्यांकन प्रदान करेगा.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

लेखकों डीआरएस को धन्यवाद देना चाहूंगा. Heping चेंग, उनके सहायक टिप्पणियों और इस विधि को विकसित करने में तकनीकी सहायता के लिए Huiliang जांग और स्टीफन Kolwicz. इस अध्ययन एनआईएच अनुदान और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन से WW वैज्ञानिक विकास अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Blebbistatin Toronto Research Chemicals B592500
CaCl2 Acros Organics AC34961-5000
EDTA Fisher Scientific BP120-500
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1
HEPES Sigma-Aldrich H7006-500
KCl Sigma-Aldrich P9541-1
MgCl2•6H2O Fisher Scientific BP214-500
MgSO4•7H2O Sigma-Aldrich M1880-1
NaCl Fisher Scientific BP358-212
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S8282-500
NaHCO3 Sigma-Aldrich S6014-1
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256-25
TMRM Invitrogen T-668
EQUIPMENT
Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module.

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Gong, G., Wang, W. Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo. J. Vis. Exp. (81), e50818, doi:10.3791/50818 (2013).

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