Imaging confocale delle singole mitocondriali superossido illumina di cuore intatto o In Vivo

Sommario

La microscopia confocale a scansione viene applicato per l'imaging eventi mitocondriali singoli in cuore perfuso o muscoli scheletrici in animale vivo. Monitoraggio in tempo reale dei processi mitocondriali singoli, come vampate di superossido e di membrana potenziali fluttuazioni consente la valutazione della funzione mitocondriale in un contesto fisiologicamente rilevanti e durante le perturbazioni patologiche.

Abstract

Mitocondrio è un organello intracellulare critico responsabile per la produzione di energia e di segnalazione intracellulare nei sistemi eucarioti. Disfunzione mitocondriale spesso accompagna e contribuisce alla malattia umana. La maggior parte dei metodi che sono stati sviluppati per valutare la funzione mitocondriale e la disfunzione si basano su in vitro o ex vivo misurazioni. I risultati di questi esperimenti hanno limitato la capacità di determinare la funzione mitocondriale in vivo. Qui, descriviamo un nuovo approccio che utilizza la microscopia confocale a scansione per l'imaging di tessuti intatti in aminals vivi, che permette di valutare singola funzione mitocondriale in maniera tempo reale in vivo. In primo luogo, generiamo topi transgenici che esprimono la mitocondriale mirato indicatore superossido, proteina fluorescente giallo circolarmente permutato (mt-cpYFP). Mt-cpYFP anestetizzato mouse è fissato su una scheda palcoscenico su misura e time-lapse immagini sono prese fRom muscoli scheletrici esposte del arti posteriori. Il mouse viene successivamente sacrificato e il cuore è impostato per Langendorff perfusione con soluzione fisiologica a 37 ° C. Il cuore perfuso è posizionato in una camera speciale sul palco microscopio confocale e leggera pressione viene applicata per immobilizzare il cuore e sopprimere battito cardiaco indotto artefatti da movimento. Superossido lampi vengono rilevati mediante real-time confocale 2D immagini ad una frequenza di un fotogramma al secondo. La soluzione di perfusione può essere modificata per contenere diversi substrati respiratori o altri indicatori fluorescenti. La perfusione può anche essere regolata per produrre modelli di malattie come l'ischemia e riperfusione. Questa tecnica è un approccio unico per la determinazione della funzione di singolo mitocondrio in tessuti normali e in vivo.

Introduzione

I mitocondri svolgono un ruolo centrale nella bioenergetica di cellule, di segnalazione dei radicali liberi, redox omeostasi, regolazione ione, e il destino delle cellule determinazione ^1,2. La disfunzione dei mitocondri spesso accompagna e sottende la patogenesi delle malattie ^3-6. Soprattutto nei sistemi muscolari come il cuore e nei muscoli scheletrici, respirazione mitocondriale fornisce la maggior parte di ATP per sostenere regolamentazione tempestiva di calcio intracellulare e robusto ^7,8 sviluppo della forza. Questi muscoli in possesso di un gran numero di mitocondri, che spesso occupano fino al 20-40% del volume cellulare tota....

Protocollo

1. Esperimento Preparazione

1. Preparare la soluzione isotonica salina bilanciata (50 ml) contenente: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl _2, 2 mM MgCl ₂ e HEPES 10 mM (pH 7,2) per imaging in vivo muscolo scheletrico.
2. Preparare 1 L di tampone Krebs-Henseleit (KHB) contenente: 118 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 1,2 MgSO mm _4, EDTA 0,5 mm e 25 NaHCO mm _3.
3. Bubble il KHB con gas contenente 95% O _2/5% di CO ₂ per 10-15 minuti prima dell'aggiunta di 2 mM CaCl _2. Aggiungi substrati metabolici (glucosio ad esempio 10 mm e piruvato 0,5 mm).
4. Preparare gl....

Risultati

Secondo questo protocollo, imaging in vivo di eventi mitocondriali singoli può essere realizzata in muscoli scheletrici di topi anestetizzati, seguita da in situ imaging cuore perfuso (Figura 1). La regolazione ottimale delle condizioni di imaging garantisce immagini chiare dei tessuti muscolari intatte e con una risoluzione singolo mitocondrio (Figura 2). TMRM viene spesso utilizzato per verificare la posizione del mt-cpYFP e dovrebbe mostrare un pattern completa sovr.......

Discussione

Imaging eventi mitocondriali singoli organi irrorati di animali vivi o ha un vantaggio significativo rispetto ai metodi tradizionali di valutazione della funzione mitocondriale ^{17,19,21,22,24,25.} La tecnica qui descritta può realizzare in tempo reale in situ determinazione della funzionalità mitocondriale in una condizione fisiologica reale alla risoluzione subcellulare. Ciò è particolarmente utile, quando combinato con altre misurazioni, per studiare sistematicamente il ruolo dei mitocondri nel norm.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
REAGENTS
Blebbistatin	Toronto Research Chemicals	B592500
CaCl2	Acros Organics	AC34961-5000
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
D-Glucosio	Sigma-Aldrich	G8270-1
HEPES	Sigma-Aldrich	H7006-500
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-1
MgCl2• 6H2O	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO4• 7H2O	Sigma-Aldrich	M1880-1
NaCl	Fisher Scientific	BP358-212
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282-500
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-1
Piruvato	Sigma-Aldrich	P2256-25
TMRM	Invitrogen	T-668
EQUIPMENT
Microscopio a scansione a linea confocale (LSM 510 Meta, Zeiss), versione software 4.2 SP1 incluso il modulo "Analisi fisiologica".