Summary
Konfokal scanning mikroskopi brukes for å avbilde enkelt mitokondrielle hendelser i perfundert hjerte eller skjelettmuskulatur i levende dyr. Real-time overvåkning av enkelt mitokondrielle prosesser som superoxide blinker og membran potensielle svingninger gjør at evalueringen av mitokondrienes funksjon i en fysiologisk relevant kontekst og i løpet av patologiske forstyrrelser.
Abstract
Mitokondrie er en kritisk intracellulære organeller ansvarlig for energiproduksjon og intracellulær signalisering i eukaryote systemer. Mitokondriell dysfunksjon ofte følger med og bidrar til sykdom hos mennesker. Flertallet av de tilnærmingene som er blitt utviklet for å evaluere mitokondrienes funksjon og dysfunksjon er basert på in vitro eller ex vivo målinger. Resultatene fra disse forsøkene har begrenset evne til å bestemme mitokondriell funksjon in vivo. Her beskriver vi en ny tilnærming som utnytter confocal scanning mikroskopi for avbildning av intakt vev i levende aminals, som tillater evaluering av enkeltmitokondriefunksjonen i en sanntid måte in vivo. Først genererer vi transgene mus som uttrykker mitokondrie målrettet superoksid indikator, sirkulært permuted gul fluoriserende protein (mt-cpYFP). Bedøvet mt-cpYFP musen er fiksert på et skreddersydd scene adapter og tid-lapse bildene er tatt fROM de utsatte musklene i bakbena. Musen ble deretter avlivet og hjerte er satt opp etter Langendorff perfusjon med fysiologiske løsninger ved 37 ° C. Den perfusert hjerte er anbragt i et særskilt kammer på konfokalmikroskop fase og lett trykk påføres for å immobilisere hjertet og undertrykke hjerterytme indusert bevegelsesartefakter. Superoksid blinker oppdages av sanntids 2D confocal avbildning med en frekvens på ett bilde per sekund. Perfusjon løsning kan bli endret for å inneholde ulike åndedrett underlag eller andre fluorescerende indikatorer. Den perfusjon kan også bli justert for å produsere sykdomsmodeller slik som iskemi og reperfusjon. Denne teknikken er en unik metode for å bestemme funksjonen av enkelt mitokondrie i intakt vev, og in vivo.
Introduction
Mitokondrier spille en sentral rolle i celle bioenergi, frie radikaler signalering, redoks homeostase, ion regulering, og celle skjebne besluttsomhet 1,2. Mitokondrier dysfunksjon ofte følger og ligger til grunn for patogenesen av sykdommer 3-6. Spesielt i de muskelsystemene som hjerte og skjelettmuskler, gir mitokondriell respirasjon flertallet av ATP til å støtte rettidig regulering av intracellulært kalsium og robust kraft utvikling 7,8. Disse muskler har et stort antall mitokondria som ofte opptar opp til 20-40% av det totale cellevolum, og er "fast" i mellom myofilaments 2.
Til tross for en rekke studier, vår forståelse av mitokondrienes funksjon regulering, spesielt in vivo og under fysiologisk relevante forhold, er begrenset. En av grunnene er at flertallet av de metodene som er utviklet for å vurdere mitokondrienes funksjon stole på i vitro eller ex vivo metoder, slik som å overvåke oksygenforbruk av isolerte mitokondrier supplert med kunstige substrater, og den indirekte bestemmelse av mitokondriell funksjon gjennom morfologi (f.eks elektronmikroskopi), enzymaktivitet (f.eks aconitase aktivitet), eller intracellulære ATP-nivåer 9-11 .
Nylig har lite molekyl fluorescerende indikatorer med relativ mitokondrie berikelse blitt brukt til å gi et glimt av de mitokondrielle signaler, inkludert membranpotensialet, kalsium og reaktive oksygen arter (ROS), i intakte celler 11-13. Dessuten er flere grønt fluorescerende protein (GFP) basert Redox og ROS indikatorer har blitt utviklet for å oppnå en mer konkret vurdering av den compartmentalized intracellulære redoks eller ROS signaliserer 14-16. Blant dette, har vi utviklet en genetisk kodet superoksid indikator, den sirkulære permuted gul fluoriserende protein, og targeted det inn i mitokondriene (mt-cpYFP) 17. mt-cpYFP kan bli opphisset på 405 eller 488 nm med både utslipps topper på 515 nm. Den emisjon ved 488 nm eksitasjon er spesielt tilpasset superoksid som vist ved foregående in vitro og in vivo kalibreringer 17,18. Utslippet på 405 nm eksitasjon brukes som intern kontroll (se Figur 1 av Ref 17 for detaljert informasjon om utslipp og eksitasjon spektra av mt-cpYFP under ulike forhold). Med time-lapse confocal bildebehandling, oppdager denne indikatoren sprengning superoksydproduksjon hendelser, kalt superoxide blinker, i enkelt mitokondriene av intakte celler. Superoksid flash fungerer som en sammensatt funksjon av mitokondriell respirasjon, medfølgende forbigående mitokondriemembranen depolarisering og ROS produksjon 17-20. Nylig, har vi generert de pan-vev mt-cpYFP transgene mus ved hjelp av pUC-CAGGS-mt-cpYFP vektor 17,19 på C57/BL6 bakgrunn og bekreftet den sterke uttrykksjon av denne indikator i hjerte, skjelettmusklene og andre vev (fig. 2). Den transgene mus vil være tilgjengelig for interesserte akademiske etterforskere på forespørsel og MTA godkjenning ved University of Washington.
I denne studien, vi beskrive in situ avbildning av superoxide blinker i Langendorff perfundert hjertet så vel som in vivo avbildning av flash hendelser i skjelettmuskulatur av bedøvede mt-cpYFP transgene mus 17,19. Denne teknologien gjør det mulig for sanntids overvåkning av enkelt mitokondrielle ROS produksjons hendelser i en fysiologisk relevant tilstand eller in vivo 21,22. Det er også mulig å bruke systemet for å overvåke andre enkelt mitokondrielle parametere som membranpotensialet og kalsium med egnede fluorescerende indikatorer. Videre, samtidig eller parallell evaluering av mitokondrienes funksjon med intracellulære hendelser (f.eks kalsium transienter) eller hjertefunksjon (f.eks. Ejeksjonsfraksjon) kan oppnås. Patologiske forstyrrelser, slik som iskemi og reperfusjon, kan påføres på den perfusert hjerte å vurdere virkningen av belastningen på enkel mitokondriefunksjon i det intakte myokardium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Eksperiment Forberedelse
- Klargjør isotonisk balanserte saltløsning (50 ml) inneholdende: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 2 mM MgCl2 og 10 mM HEPES (pH 7,2) for in vivo avbildning skjelettmuskel.
- Tilbered en L av Krebs-Henseleit buffer (KHB) inneholdende: 118 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 1,2 mM MgSo4, 0,5 mM EDTA og 25 mM NaHCO3.
- Boble den KHB med gass inneholdende 95% O2 / 5% CO2 i 10-15 minutter før tilsetning av 2 mM CaCl 2. Legg metabolske substrater (f.eks 10 mM glukose og 0,5 mM pyruvat).
- Forbered kirurgiske instrumenter ved sterilisering klemmen, saks og pinsett i 70% etanol og deretter skylle i sterilisert DDH 2 O.
- Slå på hjerte perfusjon system, justere temperaturen på vannbadet og sirkulasjonspumpe, sette hastigheten på peristaltisk pumpe til 6 ml / min.
- Bubble den KHB med 95% O 2/ 5% CO 2-gass, og overvåke strømningshastigheten og temperaturen (37 ° C, ved en fiberoptisk temperatur probe) i avløpsvannet. Systemet trenger ca 20 min for gass-og temperaturstabilisering.
2. Confocal Imaging av skjelett muskler i Vivo
- Anesthetize mus med pentobarbital (80 mg / kg, ip). Dyret vil nå kirurgisk anestesi (ingen respons til tå klemme) i løpet av 10-15 minutter, og forbli i denne statusen i 1-1,5 timer, er tilstrekkelig for in vivo avbildning av skjelettmuskulatur.
- Fjern hår på en av bakbena og sterilisere huden med 70% etanol.
- Gjøre et snitt på huden langs den ytre side av lemmer for å eksponere gastrocnemius muskler.
- Plukk opp epimysium forsiktig med en skarp tang og lage et snitt gjennom den med saks. Videre dissekere å fjerne epimysium og utsette muskelfibrene under den.
- For in vivo-lasting av TMRM inn i skjelettmuskler, omfatter TMRM (500 nM) i isotonisk balanserte saltløsning for å dyppe muskel i 30 min og deretter vaske ut av indikator-fri oppløsning.
- Sett mus på sin side på confocal mikroskop (Zeiss LSM 510) fasen og begrense den bakre lem i en stilling som utsettes skjelettmuskel er vendt mot dekkglass som danner bunnen av kammeret. Den dekkglass er mellom muskelvevet og den inverterte objektiv (40X olje).
- Trykk på beinet forsiktig ned for å gjøre tett kontakt mellom vev og dekkglass. Fordyp de utsatte musklene i isotonisk balanserte saltløsning.
- Record todimensjonale (2D, xy) confocal bilder på en samplingsfrekvens på ett sekund per ramme. Intensiteten til hver piksel blir digitalisert ved 8-bit dybde. Vanligvis inneholder en serie scan 100 rammer.
- Samle sekvensielle bilder ved første spennende på 405 nm og samle ved> 505 nm deretter ved 488 nm mens samle ved> 505 nm for dobbelt bølgelengde excitation avbildning av mt-cpYFP. Bruk sekvensiell eksitasjon ved 405, 488 og 543 nm, og samle utslipp på 505-545, 505-545, og> 560 nm, henholdsvis for trippel bølgelengde eksitasjon avbildning av mt-cpYFP og TMRM.
Tre. Confocal Imaging av perfundert Mouse Hjerte
- Umiddelbart etter in vivo avbildning av skjelettmusklene, injisere mus med 200 enheter av heparin (ip). Ti minutter senere, avlive mus ved Thoracotomi og raskt fjerne hjertet med lungene og thymus knyttet til den.
- Raskt fjerne lunge i iskald buffer. Identifiser fliker av thymus og forsiktig skrelle tilbake utsette stigende aorta.
- Fjern thymus og isolere aorta ved å forsiktig fjerne noen omliggende vev.
- Gjør et kutt i den øvre enden av stigende aorta før den første grenen av aortabuen.
- Hold i veggen i aorta forsiktig med to mikro suturering tang for å eksponere hulrommet og nøye plassere aorta på cannula (PE50 rør). Den aorta holdes på plass med en mikro fartøy klemmen mens suturer blir raskt knyttet rundt aorta.
- Fjern klemmen, sjekk forsiktig kanylen med tang for å være sikker på at spissen av kanylen er over aortaroten. Ytterligere bånd tilsettes som nødvendig for å holde den midt på plass.
- Slå på den peristaltiske pumpe og perfuse midt på 1 ml / min. Hjertet vil fortsette å slå på perfusjon.
- Justere posisjonen til perfusjons-systemet og sette hjertet på objektbordet. I trinn har en adapter som gjør det mulig for oppvarming av kammeret som holder hjertet.
- Tilsett 1 ml KHB perfusjon løsning i kammeret for delvis å senke hjertet. Overvåke temperaturen i kammeret ved 37 ° C. Fjern Avløpet fra kammeret ved hjelp av en peristaltisk pumpe.
- Øke hastigheten på peristaltiske pumpe gradvis å tilveiebringe tilstrekkelig mengde (ca. 2 ml / min) til hjertet.
- Etter 10 min av stabilisering, perfuse heart med 10 mikrometer Blebbistatin og 100-500 nM TMRM. Hjerteslag vil avta etter 10 min.
- Bruk lett trykk på hjertet for å sikre tett kontakt av hjertet med dekkglass i bunnen av kammeret og for ytterligere å undertrykke hjerteslag.
- Frem på samme måte for konfokal avbildning av intakte myokardium som beskrevet i trinn 2.8 over. Justere fokusplanet nøye for å avdekke det klareste bildet mulig.
4. Bildebehandling og dataanalyse
- Bruk verktøy levert av "Fysiologisk Analysis" modul av confocal programvare for å analysere enkelt mitokondrielle blinker og membran potensielle endringer. Denne modulen er ofte inkludert i bildet skaffe programvare for konfokal systemet og tillater bestemmelse av visse områder i bildet, så vel som produksjonen av fluorescens-intensitet med tidsangivelse.
- Åpne databasen og deretter serie 2D bildefil som skal analyseres.
- Klikk på "Regionav interesse (ROI) mener "for å bytte til" gjennomsnittet av Rois "-modus. Klikk på" Region of Interest (ROI) mener "for å bytte til" bety av Rois mode ".
- Slå av visning av andre kanaler bortsett kanalen cpYFP 488 nm for å velge de blinker.
- Zoom inn bildet og manuelt flytte glidebryteren til å spille serie 2D-bilder.
- Identifisere enkelt mitokondrie superoxide blinker ved å finne stedet der fluorescerende signal øker forbigående. Bruk riktig ROI verktøy for å markere de blinker. Sporet som viser tidsavhengig endring av fluorescens hver ROI vil vise seg ved siden av bildet.
- Når du har valgt alle blinker, slå på visning av andre kanaler. Velg en avkastning på bildet på utsiden av cellen for bakgrunnssignalet subtraksjon. Utgang gjennomsnittlig fluorescens av hver ROI sammen med tidsangivelse.
- Registrere antall blink i hver av serie skanning bildefilen sammen med skannetiden og areal avcellen. Bruk Excel til å beregne flash frekvens som antall blink per 100 sek / 1000 mikrometer to celleområdet.
- Bruk en spesialutviklede program skrevet i Interactive Data Language (IDL, ResearchSystems) til å beregne parametrene for hver flash (amplitude, tid til maksimal og forfall tid). IDL programvare er kommersielt tilgjengelig, og den spesialutviklede program for flash parameter analyse kan fås fra forfatteren på forespørsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I henhold til denne protokollen, kan in vivo-avbildning av enkelt mitokondrielle arrangementer gjøres i skjelettmuskulaturen i bedøvede mus, etterfulgt av in situ avbildning i perfusert hjerte (figur 1). Den optimale innstilling av de bildedannende betingelser vil sikre klare bilder av de intakte muskelvev og med enkelt mitokondrie-oppløsning (figur 2). TMRM blir ofte brukt til å bekrefte plasseringen av mt-cpYFP og bør vise en komplett overlappende mønster med mt-cpYFP signal (figur 2). TMRM er et kommersielt tilgjengelig indikator for mitokondriemembranen potensialet måling i intakte celler 23. Dens spektra kan skjelnes fra det av cpYFP. Videre, ved å bruke sekvensiell eksitering metoden, utslipps signaler av TMRM og mt-cpYFP ikke vil interferere med hverandre 17. Representative bildene som er vist i Figur 3 viser at én mitokondrie superoksid flash accompanied av membran depolarisering kan bli identifisert i den serielle 2D skanning-bilder, med en forbigående økning fluorescens i løpet av bakgrunnssignaler i begge skjelett muskelvev og myokard (figur 3). Foruten høy oppløsning, er tilstrekkelig fluorescensintensiteten også nødvendig. Dette kan oppnås ved å modulere laserintensitet, og gevinsten i oppsamlingskanaler. Generelt er den basale fluorescens-signalet fra cellen satt til en tredjedel til en fjerdedel av den maksimale intensitet av kanalen. Siden uttrykket nivået av mt-cpYFP og lasting av TMRM kan variere mellom dyr, bør finjustering av imaging forhold gjøres for hvert forsøk. Både fysiologiske og patologiske forstyrrelser, som for eksempel metabolske substrater 17,19, elektrisk stimulering (figur 4) 20, iskemisk-reperfusjon 17, har blitt brukt til å vise at superoksid flash aktivitet reagerer på endringer i mobilnettet metabolske status. 
Figur 1. Skjematisk illustrasjon av confocal avbildning av skjelettmuskulatur og Langendorff perfundert hjerte. Den transgene mus som uttrykker mt-cpYFP er bedøvet og skjelettmuskulaturen på en av bakbena er utsatt for confocal bildebehandling. Hjertet blir deretter perfusert på Langendorff-modus og confocal bilde er utført. Bildebehandling og dataanalyse brukt confocal programvare og spesialutviklede program.
Figur 2. Confocal avbildning av skjelettmuskelfibre i vivo og myokard i perfundert hjerte. A. Representative bilder som viser skjelettmuskulatur av nontransgenic (NTG) og mt-cpYFP transgen (mt-cpYFP) mus lastet med mitokondriemembranen potensiell indikator, TMRM. B. Representative bilder som viser myoCardium av NTG og mt-cpYFP mus i Langendorff perfundert hjerte. Ex: Eksitasjon bølgelengde. mt-cpYFP er spent på 405 og 488 nm med utslipp samlet på 505-530 nm (blått) og 505-530 nm (grønn), henholdsvis. TMRM er spent på 543 nm med utslipp samles ved> 560 nm (rød). Scale barer = 50 mikrometer.
Figur 3. Enkelt mitokondrie superoxide blinker oppdaget i skjelettmuskulaturen in vivo og i perfundert hjerte. A. Representative bilder (øvre panel) og spor av tidsavhengig fluorescens endring (mt-cpYFP ved 405 og 488 nm eksitasjon og TMRM på 543 nm eksitasjon, nedre panel) viser et enkelt mitokondrie superoksid flash (markert med oransje piler i et utvidet del av bildene) i skjelettmuskelfibre. Legg merke til den økte mt-cpYFP signal (ved 488 nm eksitasjon) er ledsaget av redusert TMRM signal. B. Representant images (øvre panel) og spor av tidsavhengig fluorescens endring (nedre panel) i løpet av en enkelt mitokondrie superoksid flash i perfundert myokard. Scale barer = 50 mikrometer. Klikk her for å se større figur .
Figur 4. Økt superoksid flash frekvens i perfusert hjerte ved elektrisk stimulering. Hjertet ble elektrisk stimulert (Pacing, 4 V og 2 Hz) i 2 min. Dataene er gjennomsnitt ± SEM, n = 8 celler. *:. P <0,05 versus Resting Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Imaging enkelt mitokondrielle hendelser i levende dyr eller perfusert organer har betydelig fordel i forhold til tradisjonelle metoder for mitokondrienes funksjon evaluering 17,19,21,22,24,25. Teknikken som beskrives her kan oppnå sanntids-bestemmelse på stedet av mitokondriell funksjon i en fast fysiologisk tilstand ved subcellulære oppløsning. Dette er spesielt nyttig i kombinasjon med andre målinger for å systemisk studere rollen til mitokondrier i den normale funksjonen til et bestemt organ eller celletype in vivo. Dette er en komplisert teknikk som kombinerer konfokal mikroskopi og sofistikert perfusjon system med kontroll av forskjellige parametere. Likevel har denne teknikken er brukt for å knytte hele kroppen glukose metabolisme med muskel mitokondriefunksjon 17,19,20 og er for tiden ansatt av oss å studere mitokondriell dysfunksjon i hjertesykdommer.
Den Langendorff hjerte perfusion Systemet er kompatibelt til hjertefunksjon evaluering gjennom overvåking av venstre ventrikkel press og bildebehandling intracellulære Ca 2 + transienter under hver beat. Alternativt kan andre fluorescerende indikatorer som MitoSOX eller DCF bli perfundert til rette in situ avbildning av steady-state ROS nivåer i hjertemuskelen. Langendorff perfundert hjerte har vært mye brukt for å evaluere responsen av hjertet til fysiologisk (f.eks β-adrenerge stimulering av dobutamin) eller patologisk (f.eks iskemi reperfusjon) forstyrrelsene 26-28. Slike behandlinger kan innlemmes i confocal avbildningssystemet for å vurdere én mitokondrielle funksjon som respons på stress.
Begrensninger av denne metoden, inkluderer valg av vev / organer som er gjennomførbare for levende dyr bildebehandling. Overfladiske vev som skjelettmuskulatur, subkutane strukturer og overfladiske nerver er ideelle for confocal bildebehandling i levende animal. Indre organer er teknisk upassende for levende dyr bildebehandling på grunn av omfattende skader på musen mens utsette orgelet. Imidlertid kan indre organer settes opp for organperfusjon / kultur, som for eksempel Langendorff perfundert hjerte eller hjernen skive kultur, dersom en fysiologisk mimetisk miljø kan opprettholdes. I tillegg har konfokalmikroskop en effektiv avbildning dybde på 30 til 50 mikrometer, som tillater avbildning av noen få lag av celler under organflate. Det er mulig at dette systemet kan kombineres med en multi-foton mikroskop, som har en mye høyere inntrengningsdybde (for eksempel opp til 1 mm), og har blitt brukt for å vurdere mitokondriell funksjon hos det intakte hjertet 29.. Bevegelsesartefakt er et annet kritisk problem som bør vurderes. Mitokondriene i musklene og i hjertemuskelceller viste minimal bevegelse under skanningen. Videre kan hjerterytme-indusert bevegelsesartefakt undertrykkes eller elimineres ved perfusjon med Blebbistatin ennd anvendelse av lett trykk på hjertet. Med andre celletyper, slik som nerveceller og fibroblaster, kan mitokondriene gjennomgår konstant og dramatiske bevegelser. Under bildeprosessering og analyse, bør eventuelle signalforandringer på grunn av bevegelsesartefakt nøye identifisert og ekskludert.
Andre utfordringer ved denne teknikken er å opprettholde den aktuelle tilstand gjennom hele forsøket, positive kontroller og tolking. For skjelettmuskulatur bildebehandling i bedøvede mus, bør den eksponerte muskeloverflaten være nedsenket i fysiologiske buffere til enhver tid. Vitale tegn på mus som for eksempel puste skal overvåkes gjennom hele eksperimentet. For perfusert hjerte studier, er riktig oksygenering, temperaturkontroll og substrat forsyning nødvendig. Positive kontroller anbefales å kontrollere tilstanden og reaksjonsevne i vevet. For å gjøre dette, kan musene injiseres med insulin eller glukose og perfusert hjerter kan være elektrisk stimulertelert eller perfundert med isoproterenol. Økte superoxide blinker bør observeres etter disse behandlinger (figur 4) 19,20. I tillegg blir tidsintervallbilder tatt når bevegelsesartefakter undertrykkes ved å hemme hjerterytme, som produserer sub-fysiologiske betingelser på grunn av nedsatt arbeidsbelastning. Derfor bør perfundert hjerte eksperimentet anses å ha en nær mimetisk av in vivo-situasjon.
Til slutt ble teknikken utviklet ved hjelp av et Zeiss confocal (LSM 510). Andre confocal system (f.eks Nikon, Olympus eller Leica) kan brukes hvis systemet oppfyller følgende krav: (1) har time-lapse ramme skannemodus, (2) har en samplingsfrekvens på 1 sek / ramme, og (3) kan nå enkelt mitokondrie-oppløsning (f.eks en mikrometer x 2 mikrometer). Programvaren i en konfokal system vanligvis tillater enkel bildebehandling og analyse, slik som definerer ROIs og fluorescensintensiteten utgang med tIME etiketter. Alternativt, kan bilde J programvare kan brukes for både bildeanalyse og flash parameter beregning.
I sammendraget, avbildning av enkelt mitokondrielle arrangementer som superoxide blinker i skjelettmuskulaturen in vivo eller i perfundert hjerte er en unik tilnærming for sanntids fastsettelse av mitokondrienes funksjon. Denne teknikken er et betydelig fremskritt i løpet av de tradisjonelle in vitro målinger, og vil gi en mer nøyaktig vurdering av mitokondrienes funksjon og sitt forhold til cellulære prosesser / funksjoner under reelle fysiologiske forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke legene. Heping Cheng, Huiliang Zhang og Stephen Kolwicz for nyttige kommentarer og teknisk støtte i å utvikle denne metoden. Denne studien ble støttet av NIH tilskudd og Scientist Development Grant fra American Heart Association til WW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Blebbistatin | Toronto Research Chemicals | B592500 | |
| CaCl2 | Acros Organics | AC34961-5000 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006-500 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1 | |
| MgCl2•6H2O | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | M1880-1 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282-500 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014-1 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25 | |
| TMRM | Invitrogen | T-668 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module. | |||
References
- Brookes, P. S., Yoon, Y., Robotham, J. L., Anders, M. W., Calcium Sheu, S. S. Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, 817-833 (2004).
- Scheffler, I. E. Mitochondria. , 2nd, J. Wiley and Sons, Inc. (2008).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondria in heart failure. Cardiovasc. Res. 88, 40-50 (2010).
- Griffiths, E. J. Mitochondria and heart disease. Adv. Exp. Med. Biol. 942, 249-267 (2012).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).
- Pieczenik, S. R., Neustadt, J. Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease. Exp. Mol. Pathol. 83, 84-92 (2007).
- Szentesi, P., Zaremba, R., van Mechelen, W., Stienen, G. J. M. ATP utilization for calcium uptake and force production in different types of human skeletal muscle fibres. J. Physiol. 531, 393-403 (2001).
- Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J. Bioenerg. Biomembr. 41, 99-106 (2009).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. J. Biol. Chem. 217, 409-427 (1955).
- Lambert, A. J., Brand, M. D. Reactive oxygen species production by mitochondria. Methods Mol Biol. 554, 165-181 (2009).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
- Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15038-15043 (2006).
- Dickinson, B. C., Srikun, D., Chang, C. J. Mitochondrial-targeted fluorescent probes for reactive oxygen species. Curr. Opin. Chem. Biol. 14, 50-56 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 13044-13053 (2004).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat. Methods. 3, 281-286 (2006).
- Wang, W., et al. Superoxide Flashes in Single Mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
- Wei-Lapierre, L., et al. Respective Contribution of Mitochondrial Superoxide and pH to Mitochondria-targeted Circularly Permuted Yellow Fluorescent Protein (mt-cpYFP) Flash Activity. J. Biol. Chem. 288, 10567-10577 (2013).
- Fang, H., et al. Imaging superoxide flash and metabolism-coupled mitochondrial permeability transition in living animals. Cell Res. 21, 1295-1304 (2011).
- Wei, L., et al. Mitochondrial superoxide flashes: metabolic biomarkers of skeletal muscle activity and disease. FASEB J. 25, 3068-3078 (2011).
- Sheu, S. S., Wang, W., Cheng, H., Dirksen, R. T. Superoxide flashes: illuminating new insights into cardiac ischemia/reperfusion injury. Future Cardiol. 4, 551-554 (2008).
- Wei, L., Dirksen, R. T. Perspectives on: SGP symposium on mitochondrial physiology and medicine: mitochondrial superoxide flashes: from discovery to new controversies. J. Gen. Physiol. 139, 425-434 (2012).
- Johnson, I., Spence, M. T. Z. Ch. 12.2. The Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , Life Technologies Corp. 510-511 (2013).
- Wang, X., et al. Superoxide flashes: elemental events of mitochondrial ROS signaling in the heart. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 940-948 (2012).
- Li, K., et al. Superoxide flashes reveal novel properties of mitochondrial reactive oxygen species excitability in cardiomyocytes. Biophys. J. 102, 1011-1021 (2012).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
- Pasdois, P., et al. Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers. Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).
- Granville, D. J., et al. Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1321-1326 (2004).
- Davidson, S. M., Yellon, D. M., Murphy, M. P., Duchen, M. R. Slow calcium waves and redox changes precede mitochondrial permeability transition pore opening in the intact heart during hypoxia and reoxygenation. Cardiovasc. Res. 93, 445-453 (2012).
