Summary
מיקרוסקופיה confocal הסריקה מיושמת הדמיה אירועי המיטוכונדריה בודדות בלב perfused או שרירי שלד בבעלי חיים בשידור חי. ניטור של תהליכי המיטוכונדריה יחיד כגון הבזקי סופראוקסיד ותנודות פוטנציאל הממברנה בזמן אמת מאפשר ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה בהקשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ובמהלך ההפרעות פתולוגיות.
Abstract
Mitochondrion הוא אברון תאיים קריטי אחראי על ייצור אנרגיה ואיתות תאית במערכות אוקריוטים. תפקוד המיטוכונדריה לעתים קרובות מלווה ותורם למחלות בבני אדם. רוב הגישות שפותחו כדי להעריך את התפקוד ותפקוד המיטוכונדריה מבוססים על במבחנה או מדידות vivo לשעבר. יש תוצאות מניסויים אלה בקביעת יכולת תפקוד המיטוכונדריה in vivo מוגבלות. כאן, אנו מתארים גישה חדשנית אשר מנצלת מיקרוסקופיה confocal סריקה עבור ההדמיה של רקמות שלמות בaminals החי, המאפשרת ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה אחת באופן בזמן אמת בגוף חי. ראשית, עלינו ליצור עכברים מהונדסים המבטאים את מחוון סופראוקסיד המיטוכונדריה הממוקד, חלבון permuted מעגלית צהוב ניאון (MT-cpYFP). MT-cpYFP הרדים עכבר קבוע במתאם שלב מחוייט וזמן לשגות תמונות נלקחות from שרירי שלד החשוף של hindlimb. העכבר הקריב לאחר מכן והלב מוגדר לזלוף Langendorff עם פתרונות פיסיולוגיים ב 37 ° C. לב perfused ממוקם בתא מיוחד על הבמה מיקרוסקופ confocal ולחץ עדין מוחל כדי לשתק את הלב ולדכא את פעימות לב חפץ בתנועה מושרה. הבזקי סופראוקסיד מזוהים על ידי ההדמיה confocal 2D בזמן אמת בתדר של מסגרת אחת לשנייה. פתרון זלוף יכול להיות שונה כדי להכיל את מצעי נשימה שונים או אינדיקטורים ניאון אחרים. זלוף גם יכול להיות מותאם כדי לייצר מודלים מחלה כגון איסכמיה ו reperfusion. טכניקה זו היא גישה ייחודית לקביעת הפונקציה של המיטוכונדריה בודדת ברקמות שלמות וin vivo.
Introduction
מיטוכונדריה לשחק תפקיד מרכזי בbioenergetics תא, איתות של רדיקלים חופשיים, הומאוסטזיס חיזור, רגולציה יון, ו1,2 קביעת גורל תא. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה ולעתים קרובות מלווה ביסוד פתוגנזה של מחלות 3-6. במיוחד במערכות השרירים כגון לב ושרירי שלד, נשימה המיטוכונדריאלי מספקת את הרוב של ה-ATP לתמיכה ברגולציה בזמן של סידן תוך תאי ו7,8 פיתוח כוח חזק. שרירים אלה יש מספר גדול של מיטוכונדריה כי לעתים קרובות לכבוש עד 20-40% מכלל נפח התא והם "קבועים" בין myofilaments 2.
למרות מחקרים רבים, ההבנה של הרגולציה התפקוד המיטוכונדריה, במיוחד in vivo ובתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית שלנו, מוגבלת. אחת הסיבות הוא כי רוב השיטות שפותחו להערכת תפקוד המיטוכונדריה להסתמך על בvitro או vivo לשעבר גישות, כגון ניטור צריכת החמצן של מיטוכונדריה המבודדת בתוספת מצעים מלאכותיים, והקביעה העקיפה של תפקוד המיטוכונדריה באמצעות מורפולוגיה (מיקרוסקופיה למשל אלקטרון), פעילות האנזים (פעילות aconitase למשל), או רמות ה-ATP תאית 9-11 .
לאחרונה, אינדיקטורים ניאון מולקולה קטנים עם העשרת המיטוכונדריה היחסית יושמו כדי לספק הצצה אותות המיטוכונדריה, כוללים פוטנציאל ממברנה, סידן ומיני חמצן תגובתי (ROS), בתאים שלמים 11-13. יתר על כן, כמה חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) חיזור מבוסס ואינדיקטורים ROS פותחו כדי להשיג הערכה ספציפית יותר של חיזור תאיים הממודר או ROS מאותת 14-16. בקרב זה, פיתחנו אינדיקטור מקודד גנטי סופראוקסיד, חלבון פלואורסצנטי הצהוב permuted המעגלי, וtargeteד אותו למיטוכונדריה (MT-cpYFP) 17. יכול להיות נרגש MT-cpYFP ב405 או 488 ננומטר עם שתי פסגות הפליטה ב 515 ננומטר. הפליטה ב 488 עירור ננומטר היא דווקא מגיבה לסופראוקסיד כפי שמוצג על ידי קודם במבחנה בכיולי vivo 17,18. הפליטה ב 405 עירור ננומטר משמשת כבקרה פנימית (עיין באיור 1 של Ref 17 למידע מפורט על ספקטרום הפליטה ועירור של MT-cpYFP בתנאים שונים). עם confocal הדמיה הזמן לשגות, אינדיקטור זה מזהה מתפוצץ אירועי סופראוקסיד ייצור, בשם הבזקי סופראוקסיד, במיטוכונדריה בודדת של תאים שלמים. הבזק סופראוקסיד משמש כפונקציה משולבת של נשימה המיטוכונדריאלי, שלילת קוטביות קרום נלווית חולפת המיטוכונדריה וייצור ROS 17-20. לאחרונה, יש לנו שנוצרו העכברים הטרנסגניים MT-cpYFP הפאן רקמות באמצעות וקטור PUC-CAGGS-MT-cpYFP 17,19 על רקע C57/BL6 ואימתו את הביטויים חזקיםשיאון של אינדיקטור זה בלב, שרירי שלד ורקמות אחרות (איור 2). העכברים מהונדסים יהיו זמינים לחוקרים אקדמיים מעוניינים על פי דרישה וMTA אישור על ידי אוניברסיטת וושינגטון.
במחקר זה, אנו מתארים בהדמיה באתרו של הבזקי סופראוקסיד בלב perfused Langendorff כמו גם in vivo הדמיה של אירועי הבזק שברירי שלד של עכברים הטרנסגניים הרדים MT-cpYFP 17,19. טכנולוגיה זו מאפשרת ניטור של אירועי ייצור ROS המיטוכונדריה אחד במצב רלוונטי מבחינה פיזיולוגית או in vivo 21,22 זמן אמת. זה גם אפשרי על מנת להשתמש במערכת לניטור פרמטרים המיטוכונדריה אחת אחרים כגון פוטנציאל קרום וסידן עם אינדיקטורים ניאון מתאימים. הערכה נוספת, בו זמנית או במקביל של תפקוד המיטוכונדריה עם אירועים תאיים (למשל ארעיים סידן) או את תפקוד לב (לדוגמא:. פליטת חלקיק) יכול להיות מושגת. הפרעות פתולוגיות, כגון איסכמיה ו reperfusion, יכולות להיות מיושמות על לב perfused כדי להעריך את ההשפעה של מתח על תפקוד המיטוכונדריה בודד בשריר הלב ללא פגע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ניסוי הכנה
- הכן את התמיסה איזוטונית מאוזנת מלח (50 מיליליטר) המכילה: 140 mM NaCl, 5 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ CaCl 2, 2 מ"מ MgCl 2 ו10 HEPES מ"מ (pH 7.2) עבור in vivo הדמיה שרירי שלד.
- הכן 1 ליטר של חיץ קרבס-Henseleit (KHB) המכיל: 118 mM NaCl, 5.3 מ"מ KCl, 1.2 מ"מ MgSO 4, 0.5 mM EDTA ו25 מ"מ NaHCO 3.
- בועת KHB עם 95% O גז המכיל 2/5% CO 2 למשך 10-15 דקות לפני התוספת של 2 מ"מ CaCl 2. הוספת מצעים מטבולים (למשל 10 גלוקוז מ"מ ו0.5 פירובט מ"מ).
- הכן את מכשירי ניתוח על ידי חיטוי המהדק, מספריים, מלקחיים ב70% אתנול ולאחר מכן לשטוף בDDH 2 O. מעוקר
- הפעל את מערכת זלוף לב, להתאים את הטמפרטורה באמבט המים וסירקולטור, לקבוע את המהירות של משאבת peristaltic עד 6 מיליליטר / דקה.
- בועת KHB עם 95% O 2גז / 5% CO 2, ולנטר את קצב זרימה ואת הטמפרטורה (37 מעלות צלזיוס, על ידי בדיקה טמפרטורת סיבים אופטית) של השפכים. המערכת צריכה על 20 דקות לאיזון גז וטמפרטורה.
2. ההדמיה confocal של שרירי שלד בVivo
- הרדימי עכבר עם pentobarbital (80 מ"ג / קילוגרם, ip). בעלי החיים יגיעו להרדמה כירורגית (אין תגובה לקמצוץ הבוהן) בתוך 10-15 דקות ולהישאר במצב זה עבור 1-1.5 שעות, מספיק לvivo ההדמיה של שרירי שלד.
- להסיר שערות על אחד hindlimbs ולעקר את העור עם 70% אתנול.
- עושה חתך בעור בצד החיצוני של האיבר כדי לחשוף את שרירי הגסטרוקנמיוס.
- תרים epimysium בעדינות עם מלקחיים חדים ועושה חתך דרכו במספריים. בהמשך לנתח כדי להסיר את epimysium ולחשוף את סיבי השריר שמתחתיו.
- לטעינת vivo של TMRM לתוך השלדשריר, כולל TMRM (500 ננומטר) בתמיסת מלח מאוזנת איזוטוני לטבול שרירים ל30 דקות ולאחר מכן לשטוף החוצה על ידי פתרון ללא חיווי.
- שים את העכבר בצד שלה במיקרוסקופ confocal (Zeiss LSM 510) השלב ולרסן את האיבר האחורי במצב שרירי שלד החשוף פונים נגד coverslip שמהווה את החלק התחתון של החדר. Coverslip הוא בין רקמת השריר והמטרה ההפוכה (שמן 40X).
- לחץ על הרגל בעדינות כדי ליצור קשר הדוק בין הרקמות וcoverslip. לטבול את השרירים החשופים בתמיסת מלח מאוזנת איזוטוני.
- שיא שני (2D, XY) תמונות confocal ממדיות בקצב דגימה של שנייה אחת לכל מסגרת. האינטנסיביות של כל פיקסל דיגיטציה בעומק של 8 ביט. בדרך כלל, סריקה סידורי מכילה 100 מסגרות.
- לאסוף תמונות רציפים על ידי ראשון מרגש ב405 ננומטר ואיסוף ב> 505 ננומטר אז ב488 ננומטר תוך איסוף ב> 505 ננומטר לexcitatio אורך גל כפולההדמיה n של MT-cpYFP. השתמש עירור רציף ב405, 488 ו543 ננומטר, ולאסוף פליטה ב 505-545, 505-545, ו> 560 ננומטר, בהתאמה, עבור הדמיה עירור גל משולשת של MT-cpYFP וTMRM.
3. ההדמיה confocal של לב perfused מאוס
- מייד לאחר vivo ההדמיה של שרירי שלד, להזריק את העכבר עם 200 יחידות של הפרין (IP). עשר דקות מאוחר יותר, להרדים את העכבר על ידי פתיחת בית החזה ובמהירות להסיר את הלב עם ריאות ובלוטת התימוס קשורות אליו.
- להסיר במהירות את הריאות במאגר קר כקרח. זהה את האונות של בלוטת התימוס ולקלף בעדינות לאחור כדי לחשוף את אב העורקים עולים.
- הסר את בלוטת התימוס ולבודד את אב העורקים על ידי הסרת כל רקמה הסובבת בזהירות.
- לעשות חתך בקצה העליון של אב העורקים עולים לפני הסניף הראשון של קשת אב העורקים.
- החזק את הקיר של אב העורקים בעדינות עם שני מלקחיים תפירת מיקרו כדי לחשוף את לומן ומניח בזהירות את אב העורקים על cannula (PE50 צינור). אב העורקים הוא נערך במקום עם מהדק כלי מיקרו בזמן שתפרים קשורים במהירות ברחבי אב העורקים.
- הסר את המהדק, לבדוק היטב את הצינורית עם מלקחיים כדי לוודא שהקצה של הצינורית הוא מעל שורש אב העורקים. קשרים נוספים מתווספים ככל שיידרשו כדי להחזיק את הלב במקום.
- הפעל את משאבת peristaltic ותנקב לב ב1 מיליליטר / דקה. הלב יתחדש מכה על זלוף.
- להתאים את המיקום של מערכת זלוף ולשים לב על הבמה מיקרוסקופ. יש שלב מתאם המאפשר חימום של החדר שמחזיק את הלב.
- הוסף 1 מיליליטר של תמיסת זלוף KHB בתא עד להטביע את הלב באופן חלקי. לפקח על טמפרטורה של החדר על 37 ° C. הסר את השפכים מהתא באמצעות משאבת peristaltic.
- להגדיל את המהירות של משאבת peristaltic בהדרגה כדי לספק זרימה מספקת (כ 2 מיליליטר / דקה) ללב.
- לאחר 10 דקות של התייצבות, תנקב heart עם 10 blebbistatin מיקרומטר ו100-500 TMRM ננומטר. פעימת לב תהיה להאט לאחר 10 דקות.
- להפעיל לחץ עדין על הלב כדי להבטיח קשר הדוק של הלב עם coverslip בחלק התחתון של החדר ולדכא את פעימות לב נוסף.
- בצע את אותו תהליך הדמיה confocal של שריר הלב שלם כמתואר בשלב 2.8 לעיל. להתאים את מישור המוקד בזהירות כדי לחשוף את התמונה הברורה ביותר האפשרית.
4. עיבוד תמונה וניתוח נתונים
- השתמש בכלים המסופקים על ידי מודול "פיזיולוגי ניתוח" של תוכנת confocal לנתח שינויי חום וקרום המיטוכונדריה בודדים פוטנציאליים. מודול זה נכלל לעתים קרובות בתוכנת תמונת רכישה של מערכת confocal ומאפשר קביעה של אזורים מסוימים בתמונה, כמו גם תפוקה של עוצמת הקרינה עם תוויות זמן.
- פתח את מסד הנתונים ולאחר מכן את קובץ התמונה 2D הסידורי להיות מנותחת.
- לחץ על "האזורשל העניין (ROI) אומר "כדי לעבור ל" ממוצע של ROIs" המצב. לחץ על "האזור של העניין (ROI) אומר" כדי לעבור למצב "אומר של ROIs".
- לבטל את התצוגה של ערוצים אחרים מלבד ערוץ cpYFP 488 ננומטר לבחירת ההבזקים.
- זום בתמונה באופן ידני להעביר פס שקף לשחק תמונות 2D סדרתי.
- לזהות הבזקי סופראוקסיד המיטוכונדריה אחת על ידי איתור האתר שבו עליות אות ניאון transiently. השתמש בכלי ROI המתאים כדי לסמן את ההבזקים. העקבות מראים שינוי הקרינה תלוי זמן של כל החזר על השקעה תופיע לצד התמונה.
- לאחר בחירת כל ההבזקים, להפעיל את התצוגה של ערוצים אחרים. בחר את ההחזר על ההשקעה על התמונה חיצונית של התא לחיסור אות רקע. פלט הקרינה הממוצעת של כל החזר על השקעה יחד עם תוויות הזמן.
- רשום את מספר ההבזקים בכל אחד מקובץ תמונת הסריקה הסידורי יחד עם הזמן ושטח של הסריקההתא. השימוש ב-Excel כדי לחשב הבזק תדירות כמו מספר הבזקים לכל 100 שניות / שטח תא 1,000 מיקרומטר 2.
- השתמש בתכנית שפותחה במיוחד עבור כתובה בנתונים אינטראקטיביים שפה (IDL, ResearchSystems) כדי לחשב את הפרמטרים של כל פלאש (אמפליטודה, זמן להגיע לשיא וזמן דעיכה). תוכנת IDL היא זמינה באופן מסחרי וניתן לקבל את התכנית שפותחה במיוחד עבור ניתוח לבזק פרמטר מן המחבר על פי דרישה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על פי פרוטוקול זה, in vivo הדמיה של אירועי המיטוכונדריה אחד יכולה לעשות בשרירי שלד של עכברים מורדמים ואחריו בהדמיה באתרו בלב perfused (איור 1). ההגדרה האופטימלית של תנאי ההדמיה תבטיח תמונות ברורות של רקמות שרירים ללא פגע ועם הרזולוציה mitochondrion אחד (איור 2). TMRM משמש לעתים קרובות כדי לוודא את מיקומו של MT-cpYFP וצריך להראות דפוס חפיפה מלא עם אות MT-cpYFP (איור 2). TMRM הוא אינדיקטור זמין מסחרי למדידת פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה בתאים שלמים 23. הספקטרום שלה ניתן להבחין מזה של cpYFP. יתר על כן, על ידי שימוש בשיטת העירור הרציף, אותות הפליטה של TMRM וMT-cpYFP לא להפריע זה ל17 אחרים. נציג תמונות שמוצגים באיור 3 מצביעות על כך שעכו הבזק סופראוקסיד המיטוכונדריה אחתmpanied ידי שלילת קוטביות קרום יכול להיות מזוהה בתמונות סריקת 2D סדרתי, עם עלייה חולפת הקרינה לאורך אותות הרקע בשתי רקמות שריר השלד ושריר הלב (איור 3). חוץ מזה ברזולוציה גבוהה, עוצמת הקרינה מתאימה נדרשה גם. זו יכולה להיות מושגת על ידי ויסות עוצמת הלייזר והרווח בערוצי האיסוף. באופן כללי, אותות הקרינה הבסיסיים מהתא מוגדר בשליש לרבע מהעצמה המרבית של הערוץ. מאז רמת הביטוי של MT-cpYFP והטעינה של TMRM יכולה להשתנות בין בעלי חיים, הכוונון עדין של תנאי ההדמיה צריך להיעשות עבור כל ניסוי. שני הפרעות פיסיולוגיות ופתולוגיים, כגון מצעים מטבולי 17,19, גירוי חשמלי (איור 4) 20, איסכמי-reperfusion 17, שנוצלו כדי להראות שפעילות הבזק סופראוקסיד מגיבה לשינויים במצב מטבולים סלולריים. 
איור 1. איור סכמטי של ההדמיה confocal של שרירי שלד ולב perfused Langendorff. העכבר המהונדס מבטא MT-cpYFP הוא הרדים ושרירי שלד על אחד hindlimbs נחשפים להדמית confocal. הלב אז perfused במצב Langendorff ותמונת confocal מתנהלת. ניתוח עיבוד תמונה והנתונים המשמש את תוכנת confocal ותכנית שפותחה בהתאמה אישית.
איור 2. ההדמיה confocal של סיבי שריר שלד ובשריר הלב vivo בלב perfused. תמונות א 'נציג מראים שרירי השלד של nontransgenic (NTG) ומהונדס MT-cpYFP עכבר (MT-cpYFP) עמוס מחוון פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה, תמונות TMRM. ב הנציג מראים מיועכברי cardium של NTG וMT-cpYFP בLangendorff perfused לב. אקס: גל עירור. MT-cpYFP הוא נרגש ב405 ו488 ננומטר עם פליטה שנאסף ב505-530 ננומטר (כחול) ו505-530 ננומטר (ירוק), בהתאמה. TMRM הוא נרגש בננומטר 543 עם פליטה שנאסף ב> 560 ננומטר (אדום). ברים סולם = 50 מיקרומטר.
איור 3. הבזקי סופראוקסיד המיטוכונדריה יחיד שזוהו בשרירי שלד in vivo ו בלב perfused. תמונות א 'נציג (פנל עליון) ועקבות של שינוי תלוי זמן הקרינה (MT-cpYFP ב405 ו488 עירור ננומטר וTMRM ב543 עירור ננומטר, פנל תחתון) מראה הבזק בודד המיטוכונדריה סופראוקסיד (מודגש על ידי חצים כתומים במוגדל חלק מהתמונות) בסיבי שריר שלד. שים לב לאות המוגברת MT-cpYFP (ב 488 עירור ננומטר) מלווה בירידת אות TMRM. מתאר לעצמי ב 'נציגes (פנל עליון) ועקבות של שינוי הקרינה תלוי זמן (פנל תחתון) במהלך הבזק סופראוקסיד המיטוכונדריה בודד בשריר לב perfused. ברים סולם = 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 4. הגברת תדירות הבזק סופראוקסיד בלב perfused על ידי גירוי חשמלי. הלב היה מגורה חשמלי (צעדה, הרץ 4 V ו -2) במשך 2 דקות. הנתונים הם ממוצע ± SEM, n = 8 תאים. *:. P <0.05 לעומת מנוחה לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש הדמיה אירועי המיטוכונדריה אחת בחי או באיברי perfused יתרון משמעותי על פני שיטות מסורתיות ל17,19,21,22,24,25 הערכת תפקוד המיטוכונדריה. הטכניקה המתוארת כאן יכולה להשיג בזמן אמת בנחישות באתרו של תפקוד המיטוכונדריה במצב פיסיולוגי אמיתי ברזולוציה subcellular. התכונה זו שימושית במיוחד, בשילוב עם מדידות אחרות, כדי ללמוד את התפקיד של המיטוכונדריה בתפקוד התקין של איבר מסוים או סוג תא in vivo מערכתי. זוהי טכניקה מורכבת, המשלבת מערכת זלוף מתוחכמת מיקרוסקופיה confocal ועם השליטה בפרמטרים שונים. עם זאת, טכניקה זו נעשתה שימוש כדי לקשר את חילוף החומרים של הגלוקוז בגוף כולו עם תפקוד המיטוכונדריה שרירים 17,19,20 ומועסקת כיום על ידי בנו ללמוד את התפקוד המיטוכונדריה במחלות לב.
Perfusio לב Langendorffמערכת n תואמת להערכת תפקוד לב באמצעות ניטור לחץ החדר השמאלי והדמית 2 + ארעיים תאיים Ca בכל פעימה. לחלופין, ניתן perfused אינדיקטורים ניאון אחרים כגון MitoSOX או DCF כדי להקל בהדמיה באתרו של רמות ROS מצב יציב בשריר הלב. לב Langendorff perfused כבר בשימוש נרחב כדי להעריך את התגובה של לב (למשל גירוי β-adrenergic ידי dobutamine) פיסיולוגי או (reperfusion איסכמיה למשל) פתולוגי הפרעות 26-28. ניתן לשלב טיפולים מסוג זה במערכת confocal ההדמיה כדי להעריך את התפקוד המיטוכונדריה אחת בתגובה ללחצים.
מגבלות של שיטה זו כוללות את הבחירה של רקמות / איברים שהם אפשריים עבור הדמיה חיה חיות. רקמות שטחיות כגון שרירי שלד, מבנים תת עורי ועצבים שטחיים הן אידיאליים עבור ההדמיה confocal בani החיmal. איברים פנימיים מבחינה טכנית בלתי הולמים עבור הדמיה חיה חיים בשל הפגיעה הנרחבת בעכבר תוך חשיפת האיברים. עם זאת, ניתן להגדיר איברים פנימיים עד לזלוף איבר / תרבות, כגון לב Langendorff perfused או תרבות הפרוסה מוח, אם ניתן לקיים סביבה כוזב פיזיולוגית. בנוסף, למיקרוסקופ confocal עומק הדמיה אפקטיבי של 30-50 מיקרומטר, המאפשר ההדמיה של כמה שכבות של תאים שמתחת לפני השטח האיברים. זה אפשרי, כי מערכת זו יכולה להיות משולבת עם המיקרוסקופ רב פוטון, שבו יש עומק הרבה יותר גבוה חדירה (למשל עד 1 מ"מ) וכבר בשימוש כדי להעריך את התפקוד המיטוכונדריה בלב שלם 29. חפץ תנועה הוא נושא קריטי נוסף שצריך להילקח בחשבון. מיטוכונדריה שברירי שלד ולב myocytes הראתה תנועה מינימאלית במהלך הסריקה. יתר על כן, חפץ תנועה מושרה דופק ניתן לדכא או בוטל על ידי זלוף עם blebbistatinnd הפעלת לחץ עדין על הלב. בסוגי תאים אחרים, כמו תאי עצב וfibroblasts, מיטוכונדריה עשויה לעבור תנועות קבועה ודרמטיות. במהלך עיבוד הדמיה וניתוח, צריך להיות מזוהה כל שינוי אות בשל חפץ תנועה בזהירות ומורחק.
אתגרים נוספים של טכניקה זו כוללים שמירה על מצבו המתאים לאורך כל הניסוי, בקרות חיוביות ונתונים לפרשנות. הדמיה שרירי שלד בעכברים מורדמים, משטח השריר החשוף צריך להיות שקוע במאגרים פיסיולוגיים בכל זמנים. סימנים חיוניים של העכבר כמו נשימה צריכים להיות במעקב לאורך כל הניסוי. ללימודי לב perfused, חמצון מתאים, בקרת טמפרטורה ואספקת מצע נדרשים. בקרות חיוביות מומלץ לוודא את מצבו ואת ההיענות של הרקמות. לשם כך, ניתן להזריק עכברים עם אינסולין או גלוקוז ולבבות perfused יכול להיות stimu חשמליlated או perfused עם isoproterenol. יש לשים לב הבזקי סופראוקסיד מוגבר לאחר טיפולים אלה (איור 4) 19,20. בנוסף, הזמן לשגות התמונות נלקחות כאשר חפץ התנועה מדוכא דרך פעימות לב עיכוב, אשר מייצר תנאים תת פיסיולוגיים עקב ירידה בעומס עבודה. לכן, ניסוי לב perfused צריך להיחשב ככוזב מדוקדקת של מצב in vivo.
לבסוף, הטכניקה פותחה באמצעות confocal Zeiss (LSM 510). מערכת confocal אחרת (למשל ניקון, אולימפוס או לייקה) יכול לשמש אם המערכת עומדת בדרישות הבאות: (1) יש מצב סריקת מסגרת הזמן לשגות, (2) יש לו קצב דגימה של 1 שניות / מסגרת, ו (3) יכול להגיע לרזולוציה אחת mitochondrion (מיקרומטר x 2 מיקרומטר לדוגמא 1). התוכנה של מערכת confocal בדרך כלל מאפשרת עיבוד תמונה פשוטה וניתוח, כגון הגדרת פלט ROIs ועוצמת הקרינה עם tIME תוויות. לחלופין, תוכנת J תמונה יכולה לשמש לניתוח תמונה וחישוב פרמטר הבזק.
לסיכום, ההדמיה של אירועי המיטוכונדריה יחיד כגון הבזקי סופראוקסיד בשרירי שלד in vivo או בלב perfused היא גישה ייחודית לקביעת תפקוד המיטוכונדריה בזמן אמת. טכניקה זו היא התקדמות משמעותית מעל במבחנה המדידות המסורתיות ותספק הערכה מדויקת יותר של תפקוד המיטוכונדריה ומערכת היחסים שלה עם תהליכים תאיים / פונקציות בתנאים פיסיולוגיים אמיתיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לבני זוג. הפינג נג, Huiliang ז'אנג וסטיבן Kolwicz על הערותיהם מועילות ותמיכה טכנית בפיתוח בשיטה זו. מחקר זה נתמך על ידי מענקי NIH ומדען הפיתוח גרנט מאיגוד לב האמריקאי למלחמת העולם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Blebbistatin | Toronto Research Chemicals | B592500 | |
| CaCl2 | Acros Organics | AC34961-5000 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006-500 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1 | |
| MgCl2•6H2O | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | M1880-1 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282-500 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014-1 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25 | |
| TMRM | Invitrogen | T-668 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module. | |||
References
- Brookes, P. S., Yoon, Y., Robotham, J. L., Anders, M. W., Calcium Sheu, S. S. Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, 817-833 (2004).
- Scheffler, I. E. Mitochondria. , 2nd, J. Wiley and Sons, Inc. (2008).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondria in heart failure. Cardiovasc. Res. 88, 40-50 (2010).
- Griffiths, E. J. Mitochondria and heart disease. Adv. Exp. Med. Biol. 942, 249-267 (2012).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).
- Pieczenik, S. R., Neustadt, J. Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease. Exp. Mol. Pathol. 83, 84-92 (2007).
- Szentesi, P., Zaremba, R., van Mechelen, W., Stienen, G. J. M. ATP utilization for calcium uptake and force production in different types of human skeletal muscle fibres. J. Physiol. 531, 393-403 (2001).
- Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J. Bioenerg. Biomembr. 41, 99-106 (2009).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. J. Biol. Chem. 217, 409-427 (1955).
- Lambert, A. J., Brand, M. D. Reactive oxygen species production by mitochondria. Methods Mol Biol. 554, 165-181 (2009).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
- Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15038-15043 (2006).
- Dickinson, B. C., Srikun, D., Chang, C. J. Mitochondrial-targeted fluorescent probes for reactive oxygen species. Curr. Opin. Chem. Biol. 14, 50-56 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 13044-13053 (2004).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat. Methods. 3, 281-286 (2006).
- Wang, W., et al. Superoxide Flashes in Single Mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
- Wei-Lapierre, L., et al. Respective Contribution of Mitochondrial Superoxide and pH to Mitochondria-targeted Circularly Permuted Yellow Fluorescent Protein (mt-cpYFP) Flash Activity. J. Biol. Chem. 288, 10567-10577 (2013).
- Fang, H., et al. Imaging superoxide flash and metabolism-coupled mitochondrial permeability transition in living animals. Cell Res. 21, 1295-1304 (2011).
- Wei, L., et al. Mitochondrial superoxide flashes: metabolic biomarkers of skeletal muscle activity and disease. FASEB J. 25, 3068-3078 (2011).
- Sheu, S. S., Wang, W., Cheng, H., Dirksen, R. T. Superoxide flashes: illuminating new insights into cardiac ischemia/reperfusion injury. Future Cardiol. 4, 551-554 (2008).
- Wei, L., Dirksen, R. T. Perspectives on: SGP symposium on mitochondrial physiology and medicine: mitochondrial superoxide flashes: from discovery to new controversies. J. Gen. Physiol. 139, 425-434 (2012).
- Johnson, I., Spence, M. T. Z. Ch. 12.2. The Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , Life Technologies Corp. 510-511 (2013).
- Wang, X., et al. Superoxide flashes: elemental events of mitochondrial ROS signaling in the heart. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 940-948 (2012).
- Li, K., et al. Superoxide flashes reveal novel properties of mitochondrial reactive oxygen species excitability in cardiomyocytes. Biophys. J. 102, 1011-1021 (2012).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
- Pasdois, P., et al. Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers. Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).
- Granville, D. J., et al. Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1321-1326 (2004).
- Davidson, S. M., Yellon, D. M., Murphy, M. P., Duchen, M. R. Slow calcium waves and redox changes precede mitochondrial permeability transition pore opening in the intact heart during hypoxia and reoxygenation. Cardiovasc. Res. 93, 445-453 (2012).
