Summary
共聚焦扫描显微镜是适用于在成像灌注心脏或骨骼肌线粒体单事件活的动物。单个线粒体过程，如超氧化物闪烁和膜电位的波动进行实时监控，使线粒体功能的评价在生理相关的背景和病理过程中的扰动。
Abstract
线粒体是负责能源生产和细胞内信号在真核系统中的关键细胞内的细胞器。线粒体功能障碍常伴随并有助于人类疾病。已开发，以评估线粒体功能和功能障碍的方法的大多数都是在体外或离体测量的基础上。这些实验的结果具有有限的在确定体内的线粒体功能的能力。在这里，我们描述了一种新的方法，利用激光共聚焦扫描显微镜对完整的组织的活缩醛胺的成像，其允许单个线粒体功能的评价在一个实时的方式在体内 。首先，我们生成表达线粒体超氧针对性的指标，循环置换黄色荧光蛋白（MT-cpYFP）转基因小鼠。麻醉MT-cpYFP鼠标固定在一个特制的舞台适配器和时间推移图像拍摄fROM中的后肢暴露的骨骼肌。鼠标随后被处死，心脏被设置为Langendorff灌流与生理溶液在37°C灌注心脏被定位在一个特殊的腔上的共聚焦显微镜阶段，温柔的压力施加到固定的心脏，抑制心脏的跳动引起的运动伪影。超氧化物闪烁是由实时二维共焦成像，每秒1帧的频率检测到。该灌注溶液可修改成包含不同呼吸底物或其它荧光指示剂。灌注也可以进行调整，以产生疾病模型，如缺血再灌注损伤。这种技术是用于确定单个线粒体在完整的组织和体内的功能的独特的方法。
Introduction
线粒体在细胞生物能量核心作用，自由基信号，氧化还原平衡，离子调控和细胞命运决定1,2。线粒体功能障碍常伴和的基础疾病3-6的发病机制。尤其是在肌肉系统，如心脏和骨骼肌线粒体呼吸提供了广大的ATP以支持及时调控细胞内钙离子和强大的开发力量7,8。这些肌肉具有大量线粒体经常占据高达总细胞体积的20-40％，并在肌丝2之间被“固定”的。
尽管大量的研究，我们对线粒体功能的调节，特别是在体内和在生理学相关条件的理解，是有限的。其中一个原因是，多数的评价线粒体功能开发的方法依赖于在VITRo或体外的方法，如监测分离线粒体辅以人工基质的耗氧量，并通过形态学（ 如电子显微镜），酶的活性（ 如乌头酸酶活性）的间接测定线粒体功能，或细胞内ATP水平9-11 。
最近，小分子荧光指示剂与线粒体相对富集已应用于提供一瞥线粒体信号，包括膜电位，钙和活性氧簇（ROS），在完整细胞中11-13。此外，一些绿色荧光蛋白（GFP）的氧化还原和ROS指标，已经开发了实现了条块细胞内的氧化还原或ROS信号14-16的更具体的评价。这中间，我们开发了一种基因编码的超指标，圆形排列的黄色荧光蛋白，并targeteD它进入线粒体（MT-cpYFP）17。 MT-cpYFP可以在405或488 nm的激发与在515 nm的两个发射峰。在488nm激发的发光是专门响应于在体外和体内的校准17,18所示由以前超氧。在405nm处激发的发光被用作内部控制（请参考图1号17的对MT-cpYFP的发射光谱和激发光谱的详细信息在各种条件下）。随着时间推移共焦成像，这一指标检测爆棚超生产活动，名为超氧化物闪烁，在单个线粒体完整细胞。超闪作为线粒体呼吸，伴随的瞬态线粒体膜去极化和活性氧的产生17-20的复合函数。最近，我们已经生成使用PUC-CAGGS-MT-cpYFP矢量17,19上C57/BL6背景的泛组织MT-cpYFP转基因小鼠和验证了强烈的表达锡永这一指标在心脏，骨骼肌等组织中（ 图2）。根据要求和MTA批准由华盛顿大学的转基因小鼠将供感兴趣的学术研究。
在这项研究中，我们描述了在超闪烁的Langendorff灌流心脏原位成像以及体内成像的麻醉MT-cpYFP转基因小鼠17,19骨骼肌Flash事件。此技术允许在生理相关的条件下或在体内21,22单个线粒体ROS产生事件的实时监控。它也是可行使用该系统来监测其它单线粒体参数如膜电位和钙与适当的荧光指示剂。与细胞内事件（ 如钙瞬变）或心脏功能（线粒体功能进一步，同步或并行的评价如。射血分数）就可以实现。病理扰动，如局部缺血和再灌注，可以被应用到灌注心脏评估应力对未受影响的心肌单线粒体功能的影响。
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Protocol
1。实验准备
- 制备含有等渗平衡盐溶液（50毫升）：140 mM氯化钠，5mM的氯化钾，2.5mM的氯化钙 ，2毫摩尔MgCl 2和10mM HEPES（pH 7.2）中， 在体内骨骼肌成像。
- 制备1升含的Krebs-Henseleit缓冲液（KHB）：118 mM氯化钠，5.3 mM的氯化钾，1.2mM的MgSO 4干燥，0.5mM的EDTA和25mM的NaHCO 3。
- 气泡的KHB与含氧气体95％O 2/5％CO 2 10-15分钟之前，加入2mM的CaCl 2。添加代谢底物（ 如 10毫米的葡萄糖和0.5 mM的丙酮酸）。
- 通过灭菌在70％乙醇钳，剪刀，镊子和然后漂洗于灭菌双蒸2 O制备的外科器械
- 打开心脏灌注系统上，调整在水浴和环行器的温度，设置蠕动泵的速度到6毫升/分钟。
- 泡沫高雄港务局与95％的O 2/ 5％CO 2气体，并监测流出物的流率和温度（37℃，通过一个光纤温度探头）。该系统需要大约20分钟的气体和温度平衡。
2。骨骼肌在体内的共聚焦成像
- 麻醉小鼠用戊巴比妥（80毫克/千克，IP）。动物将在10-15分钟达到手术麻醉（以脚趾捏无响应），并保持在此状态为1-1.5小时，足以使骨骼肌的体内成像。
- 在后肢之一除去毛发和消毒用70％乙醇在皮肤上。
- 使上沿肢体，以暴露腓肠肌外侧皮肤上的切口。
- 轻轻拿起肌外膜用锋利的钳子和做一个切口，通过用剪刀。进一步剖析，除去肌外膜和揭露肌纤维下方。
- 用于体内装载TMRM进入骨骼肌肉，包括TMRM（500纳米）的等渗平衡盐溶液浸渍肌肉30分钟，然后洗出由指示器无解。
- 把鼠标在其一侧上的共聚焦显微镜（Zeiss LSM 510）的阶段，抑制后肢在该露出骨骼肌面临对形成所述腔室的底部的盖玻片的位置上。盖玻片是在肌肉组织和反相物镜（40X油）之间。
- 按腿轻轻放下，使组织和盖玻片之间的紧密接触。沉浸在等渗平衡盐溶液暴露的肌肉。
- 记录二维（2D，xy）的共焦图象以每帧一秒的采样率。每个像素的强度被数字化，以8位深度。通常，一个串行扫描包含100帧。
- 在> 505nm处收集顺序图像由第1激励在405nm处，并收集，然后在488nm处> 505 nm的收集，同时对双波长激励下MT-cpYFP n个影像。使用顺序激发在405，488和543 nm，而在505-545收集排放，505-545，和> 560 nm处，分别为MT-cpYFP和TMRM的三波长激发成像。
3。的灌注小鼠心脏共聚焦成像
- 骨骼肌的体内成像后立即用200单位肝素钠（IP）的注射的小鼠。十几分钟后，安乐死鼠标开胸并迅速连接到它的肺和胸腺取出心脏。
- 在冰冷的缓冲液快速清除肺部。识别胸腺瓣，轻轻剥开，露出升主动脉。
- 取出胸腺和仔细去除任何周围组织分离主动脉。
- 主动脉弓的第一分支之前做一个切口在升主动脉的上端。
- 用两个微缝合镊持有的主动脉壁轻轻地以暴露腔和主动脉小心放置到大约nnula（PE50管）。主动脉被保持在适当位置用一个微型钳容器而缝合线围绕主动脉迅速栓。
- 取出钳，仔细检查套管钳，以确保套管的尖端高于主动脉根部。其他关系都根据需要添加，以固定的心脏。
- 打开蠕动泵并在1毫升/分钟灌注心脏。心脏会恢复灌注后跳动。
- 调整灌注系统的位置，把心脏上的显微镜载物台。该阶段有一个适配器，允许保存心脏的腔室加热。
- 加入1 ml的KHB灌注液在室部分淹没的心脏。监视室的温度在37℃。通过使用蠕动泵从腔室中移除流出物。
- 提高蠕动泵的速度逐渐以提供足够的流量（大约2毫升/分钟）至心脏。
- 后稳定10分钟，灌注老天室温下用10μMII型肌球蛋白和100-500纳米TMRM。 10分钟后，心脏跳动会减慢。
- 适用于心脏温和的压力，以确保心脏的紧密接触盖玻片在腔室的底部，并进一步抑制心跳。
- 按照相同的程序，如上面的步骤2.8所描述完整的心肌的共聚焦成像。仔细调整焦平面显露最清晰的图像成为可能。
4。图像处理和数据分析
- 使用由共聚焦软件来分析单个线粒体闪烁和膜电位变化的“生理学分析”模块提供的工具。该模块通常被包括在共聚焦系统的图像获取软件，并允许确定的特定区域的图像中，以及荧光强度的输出与时间标签。
- 打开数据库并进行分析，然后串行2D图像文件。
- 点击“区域权益回报率（ROI）的意思是“切换到”平均投资回报率的“模式。点击”感兴趣区域（ROI）的意思是“切换到”平均投资回报率的“模式。
- 关闭其它信道的不同之处cpYFP 488nm的用于选择闪烁的信道的显示。
- 放大图像并手动移动滑动条玩串行2D图像。
- 通过查找网站，荧光信号增加瞬时识别单个线粒体超氧化物闪烁。使用适当的投资回报率的工具，以纪念闪烁。跟踪显示每个ROI的时间依赖性荧光的变化将出现在图像旁。
- 选择所有闪烁后，打开其他渠道的显示屏上。选择单元格的背景信号减法之外在图像上的投资回报率。输出的每个ROI的平均荧光连同时间标记。
- 与扫描时间和面积闪烁记录在每个串行扫描的图像文件的数目一起的细胞。使用Excel来计算闪光频率为每100秒/ 1,000μm2的电池面积闪烁的数字。
- 使用写在交互式数据语言（IDL，ResearchSystems）来计算每个闪存（振幅，达峰时间和衰减时间）的参数定制开发的程序。 IDL软件是市售和闪光灯参数分析的定制开发的程序可以从作者要求索取。
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Representative Results
原位成像灌注心脏（ 图1），根据该协议，单个线粒体事件的体内成像可以在麻醉小鼠的骨骼肌完成之后。的成像条件的最佳设置将确保清晰的图像的完整肌肉组织中，并与单一的线粒体的分辨率（ 图2）。 TMRM经常被用来验证的mt-cpYFP的位置和应显示一个完整的重叠图案与MT-cpYFP信号（ 图2）。 TMRM对于在完整细胞中23线粒体膜电位的测定使用市售的指标。它的光谱是从cpYFP的区分。此外，通过使用顺序激励方法，TMRM和mt-cpYFP的发射信号不会互相干扰17。在图3中所示的代表图像表示单个线粒体超闪ACCO通过膜去极化mpanied可以在串行2D扫描图像被识别，与在背景信号中的瞬态荧光增加在两个骨骼肌组织和心肌（ 图3）。除了分辨率高，还需要足够的荧光强度。这可以通过调节激光强度，并在收集通道的增益来实现。在一般情况下，从细胞基底荧光信号设定为三分之一到该信道的最大强度的四分之一。因为MT-cpYFP和TMRM的装载的表达水平可以在动物中各不相同，微调的成像条件应为每个实验来完成。生理和病理的扰动，如代谢底物17,19，电刺激（ 图4）20，局部缺血性再灌注17，已被用来表明超氧闪光活动的响应，以改变细胞的代谢状态。 
图1。骨骼肌的Langendorff灌流心脏的共焦成像的示意图。的转基因小鼠表达MT-cpYFP麻醉和骨骼肌上的后肢中的一个被暴露的共聚焦成像。在心脏再灌注的Langendorff离模和共聚焦图像进行的。图像处理和数据分析中使用的共聚焦软件和定制开发的程序。
图2。 在体内和心肌灌注心脏骨骼肌纤维共聚焦成像。显示非转基因（NTG）的骨骼肌A.代表图像和mt-cpYFP转基因（MT-cpYFP）鼠标装有线粒体膜电位指示器，显示肌TMRM。B.代表性的图像NTG的鸟蛤属和mt-cpYFP小鼠的Langendorff灌流心脏。例：激发波长。 MT-cpYFP被激发在405和488 nm处分别为505-530纳米（蓝色）和505-530纳米（绿色），收集排放。 TMRM是兴奋的在> 560纳米（红色）收集到543 nm的发射。比例尺=50μm以下。
图3。在骨骼肌在体内和心脏灌注单检测线粒体超氧化物闪烁。 A.代表图像（上图）和时间依赖性荧光变化（MT-cpYFP在405和488 nm激发和TMRM在543 nm激发，下图），显示一个线粒体超氧闪存（由橙色箭头高亮显示在放大的痕迹图像的骨骼肌纤维的部分）。注意增加的MT-cpYFP信号（在488 nm激发）是伴随着降低TMRM信号。B.代表IMAGES（上图）和时间依赖性荧光变化（下图）在心肌灌注单线粒体超闪过程中的痕迹。比例尺= 50微米。 点击这里查看大图 。
图4。通过电刺激增加超闪光频率在灌流心脏，将心脏电刺激（起搏，4 V和2赫兹），持续2分钟。数据为均值±标准差，N = 8个细胞。 *：P <0.05与休息点击这里查看大图 。
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Discussion
成像在活的动物或器官灌注线粒体单事件具有比传统方法的线粒体功能评价17,19,21,22,24,25显著优势。这里描述的技术可以实现实时的在一个真实的生理状态在亚细胞分辨率线粒体功能的原位测定。这是特别有用的，当与其它测量值相结合，系统地研究线粒体在体内特定器官或细胞类型的正常功能的作用。这是一个复杂的技术，它结合了共焦显微术和复杂的灌注系统的各种参数的控制。然而，这种技术已被用于与肌肉线粒体功能17,19,20连结全身葡萄糖代谢和目前由我们来研究在心脏疾病线粒体功能障碍。
在豚鼠心脏perfusioN制式兼容的心功能评估通过监测左心室压力和每个节拍中成像的细胞内的Ca 2 +瞬变。另外，其他的荧光指标如MitoSOX或DCF可以灌注，以便在稳定状态下ROS水平在心肌中的原位成像。的Langendorff灌注心脏已被广泛用于评价心脏的生理（由多巴酚丁胺如 β-肾上腺素能刺激）或病理（ 例如，缺血再灌注损伤）的扰动26-28的响应。这样的处理可以并入共焦成像系统中，以响应于应力评估单的线粒体功能。
这种方法的局限性，包括组织/器官，这对于活体动物成像是可行的选择。浅表组织如骨骼肌肉，皮下结构和肤浅的神经是理想的共聚焦成像在活ANI正常。内脏器官在技术上是不恰当的活体动物成像，由于鼠标的大面积损坏，同时暴露器官。然而，内脏可以设置为器官灌注/文化，如Langendorff离体灌注心脏或脑部切片文化，如果能维持生理模拟环境。此外，共聚焦显微镜具有30-50微米，其允许细胞的几个层中的器官表面之下的成像的有效成像深度。这是可能的，该系统可以结合多光子显微镜，它具有高得多的透入深度（ 例如，可达1毫米），并已用于评估在完整心脏29的线粒体功能。运动伪影是一个应该考虑的另一个重要问题。在骨骼肌和心肌细胞中的线粒体在扫描过程中表现出最小的运动。此外，心跳引起的运动伪影可以通过灌注II型肌球蛋白一个被抑制或消除ND应用对心脏温和的压力。在其他类型的细胞，如神经细胞和成纤维细胞中，线粒体可以经历恒定和剧烈运动。在图像处理和分析，由于运动伪影的任何信号的变化，应仔细鉴别和排除。
这种技术的另外的挑战包括保持整个实验过程中适当的条件下，阳性对照和数据解释。对于麻醉小鼠骨骼肌成像，露出肌肉表面应在所有的时间沉浸在生理缓冲液。鼠标如呼吸生命体征应在整个实验进行监测。对于灌注心脏的研究，适当充氧，温度控制和基板供应是必需的。阳性对照建议，以验证该组织的状况和响应能力。要做到这一点，老鼠可以用胰岛素或葡萄糖和体心脏注射可电stimulated或灌注异丙肾上腺素。增加超氧化物闪烁应这些处理（ 图4）19,20后进行观察。此外，时间推移的图像时的运动伪影是通过抑制心跳，产生子生理条件下由于降低工作负荷抑制措施。因此，心脏灌注实验应被视为在体内的状况密切模拟物。
最后，该技术是使用Zeiss共焦（LSM 510）开发。其它共焦系统（ 例如尼康，奥林巴斯或Leica），如果系统满足以下要求，可以用：（1）具有延时帧扫描模式中，（2）具有1秒/帧的采样率，和（3）可以达到单个线粒体分辨率（ 例如 1微米×2微米）。共焦系统的软件通常允许简单的图像处理和分析，如定义与T的投资回报率和荧光强度输出IME标签。或者，Image J软件可以同时用于图像分析和闪光灯参数计算。
总之，单线粒体的事件，如超氧化物闪烁骨骼肌在体内或体灌注心脏的成像是对线粒体功能的实时确定一个独特的方法。这种技术是在传统的体外测量值的显著进步，并会提供线粒体功能及其与下真实的生理条件的细胞过程/功能关系的更精确的评估。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
作者要感谢博士。郑和平，惠良张和斯蒂芬Kolwicz的宝贵意见，并在开发这种方法的技术支持。这项研究是由美国国立卫生研究院资助和科学家发展资助从美国心脏协会WW支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Blebbistatin | Toronto Research Chemicals | B592500 | |
| CaCl2 | Acros Organics | AC34961-5000 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006-500 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1 | |
| MgCl2•6H2O | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | M1880-1 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282-500 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014-1 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25 | |
| TMRM | Invitrogen | T-668 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module. | |||
References
- Brookes, P. S., Yoon, Y., Robotham, J. L., Anders, M. W., Calcium Sheu, S. S. Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, 817-833 (2004).
- Scheffler, I. E. Mitochondria. , 2nd, J. Wiley and Sons, Inc. (2008).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondria in heart failure. Cardiovasc. Res. 88, 40-50 (2010).
- Griffiths, E. J. Mitochondria and heart disease. Adv. Exp. Med. Biol. 942, 249-267 (2012).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).
- Pieczenik, S. R., Neustadt, J. Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease. Exp. Mol. Pathol. 83, 84-92 (2007).
- Szentesi, P., Zaremba, R., van Mechelen, W., Stienen, G. J. M. ATP utilization for calcium uptake and force production in different types of human skeletal muscle fibres. J. Physiol. 531, 393-403 (2001).
- Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J. Bioenerg. Biomembr. 41, 99-106 (2009).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. J. Biol. Chem. 217, 409-427 (1955).
- Lambert, A. J., Brand, M. D. Reactive oxygen species production by mitochondria. Methods Mol Biol. 554, 165-181 (2009).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
- Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15038-15043 (2006).
- Dickinson, B. C., Srikun, D., Chang, C. J. Mitochondrial-targeted fluorescent probes for reactive oxygen species. Curr. Opin. Chem. Biol. 14, 50-56 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 13044-13053 (2004).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat. Methods. 3, 281-286 (2006).
- Wang, W., et al. Superoxide Flashes in Single Mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
- Wei-Lapierre, L., et al. Respective Contribution of Mitochondrial Superoxide and pH to Mitochondria-targeted Circularly Permuted Yellow Fluorescent Protein (mt-cpYFP) Flash Activity. J. Biol. Chem. 288, 10567-10577 (2013).
- Fang, H., et al. Imaging superoxide flash and metabolism-coupled mitochondrial permeability transition in living animals. Cell Res. 21, 1295-1304 (2011).
- Wei, L., et al. Mitochondrial superoxide flashes: metabolic biomarkers of skeletal muscle activity and disease. FASEB J. 25, 3068-3078 (2011).
- Sheu, S. S., Wang, W., Cheng, H., Dirksen, R. T. Superoxide flashes: illuminating new insights into cardiac ischemia/reperfusion injury. Future Cardiol. 4, 551-554 (2008).
- Wei, L., Dirksen, R. T. Perspectives on: SGP symposium on mitochondrial physiology and medicine: mitochondrial superoxide flashes: from discovery to new controversies. J. Gen. Physiol. 139, 425-434 (2012).
- Johnson, I., Spence, M. T. Z. Ch. 12.2. The Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , Life Technologies Corp. 510-511 (2013).
- Wang, X., et al. Superoxide flashes: elemental events of mitochondrial ROS signaling in the heart. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 940-948 (2012).
- Li, K., et al. Superoxide flashes reveal novel properties of mitochondrial reactive oxygen species excitability in cardiomyocytes. Biophys. J. 102, 1011-1021 (2012).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
- Pasdois, P., et al. Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers. Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).
- Granville, D. J., et al. Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1321-1326 (2004).
- Davidson, S. M., Yellon, D. M., Murphy, M. P., Duchen, M. R. Slow calcium waves and redox changes precede mitochondrial permeability transition pore opening in the intact heart during hypoxia and reoxygenation. Cardiovasc. Res. 93, 445-453 (2012).
