Die konfokale Bildgebung von Einzel Mitochondrial Super Blinkt Intact Herz oder In Vivo

Zusammenfassung

Die konfokale Scanning-Mikroskopie zur Abbildung Einzel mitochondriale Ereignisse in perfundierten Herz-oder Skelettmuskulatur in lebenden Tieren angewendet. Echtzeit-Überwachung von einzelnen mitochondrialen Prozesse wie Superoxid blinkt und Membranpotentialschwankungen ermöglicht die Auswertung der mitochondrialen Funktion in einer physiologisch relevanten Kontext und bei pathologischen Störungen.

Zusammenfassung

Mitochondrium ist ein wichtiger intrazellulären Organellen für die Energieproduktion und intrazelluläre Signal in eukaryontischen Systemen verantwortlich. Mitochondriale Dysfunktion oft begleitet und trägt zur menschlichen Krankheit. Mehrzahl der Ansätze, die entwickelt wurden, um die mitochondriale Funktion und Dysfunktion beurteilen sich auf in vitro oder ex vivo-Messungen. Ergebnisse aus diesen Versuchen sind die Fähigkeit zur Bestimmung der mitochondrialen Funktion in vivo begrenzt. Hier beschreiben wir einen neuen Ansatz, die konfokale Scanning-Mikroskopie für die Abbildung von intakten Geweben im Live Aminalen, die die Bewertung der einzelnen Funktion der Mitochondrien in einer Echtzeitweise in vivo ermöglicht nutzt. Zunächst erzeugen wir transgene Mäuse, die mitochondriale gezielte Superoxid-Indikator, zirkular permutiert gelb fluoreszierende Protein (mt-cpYFP) ausdrückt. Betäubt mt-cpYFP Maus auf eine maßgeschneiderte Tischadapter und Zeitraffer-Bilder werden f genommen Festrom die freiliegenden Skelettmuskeln der hinteren Gliedmaßen. Die Maus wird anschließend getötet und das Herz wird für Langendorff-Perfusion mit physiologischen Lösungen bei 37 ° C eingestellt Perfundierten Herzen in einer speziellen Kammer auf der konfokalen Mikroskoptisch positioniert und leichtem Druck aufgebracht wird, um das Herz zu immobilisieren und Herzschlag induzierten Bewegungsartefakte zu unterdrücken. Superoxid Wallungen werden durch Echtzeit-2D-konfokale Bildgebung bei einer Frequenz von einem Bild pro Sekunde erfasst. Die Perfusionslösung können modifiziert werden, um verschiedene Substrate Atmung oder andere Fluoreszenzindikatoren enthalten. Die Perfusion kann auch eingestellt werden, um Krankheitsmodellen wie Ischämie und Reperfusion zu erzeugen. Diese Technik ist ein einzigartiger Ansatz zur Bestimmung der Funktion von Einzel Mitochondrium in intakten Geweben und in vivo.

Einleitung

Mitochondrien spielen eine zentrale Rolle in der Zell Bioenergetik, Radikal Signalisierung, Redox-Homöostase, Ionenregulation und Zellschicksal Bestimmung ^1,2. Mitochondrien Dysfunktion oft begleitet und die Voraussetzung für die Entstehung von Krankheiten ^6.3. Insbesondere in den Muskelsysteme wie Herz-und Skelettmuskulatur liefert mitochondrialen Atmung der meisten ATP rechtzeitige Regulierung der intrazellulären Calcium und robuste Kraftentwicklung ^7,8 unterstützen. Diese Muskeln besitzen eine große Anzahl von Mitochondrien, die oft besetzen bis 20-40% des gesamten Zellvolumens und "fixiert" zwischen Myofilamenten ^2.

Protokoll

1. Experiment Vorbereitung

1. Bereiten Sie die isotonische balancierte Salzlösung (50 ml), enthaltend 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl _{2, 2} mM MgCl ₂ und 10 mM HEPES (pH 7,2) für die in vivo-Bildgebung Skelettmuskel.
2. Herstellung von 1 l Krebs-Henseleit-Puffer (KHB) enthält: 118 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 1,2 mM MgSO _4, 0,5 mM EDTA und 25 mM _NaHCO3.
3. Blasen die KHB mit Gas, das 95% O _{2/5% CO &sub2;} für 10-15 min vor der Zugabe von 2 mM CaCl _2. In metabolischen Substrate (z. B. 10 mM Glucose und 0,5 mM Pyruvat).
4. Vorbereitung der chirurgischen Instrumente....

Ergebnisse

Gemäß diesem Protokoll können in vivo Bildgebung von Einzel mitochondriale Ereignisse in der Skelettmuskulatur von betäubten Mäusen durchgeführt werden, gefolgt von in situ-Bildgebung in perfundierten Herzen (Fig. 1). Die optimale Einstellung der Aufnahmebedingungen wird dafür sorgen, klare Bilder der intakten Muskeln und mit Einzel Mitochondrium Auflösung (Abbildung 2). TMRM wird oft verwendet, um die Position der mt-cpYFP überprüfen und sollte eine vollständige überl.......

Diskussion

Imaging Einzel mitochondriale Ereignisse in lebenden Tier oder durchbluteten Organen hat erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden für die mitochondriale Funktion Auswertung ^{17,19,21,22,24,25.} Die hier beschriebene Technik kann Echtzeit-in-situ-Bestimmung der mitochondrialen Funktion in einem echten physiologischen Zustand auf subzellulärer Auflösung zu erreichen. Dies ist besonders nützlich, wenn sie mit anderen Messungen kombiniert werden, um systemisch Studium der Rolle von Mitochondrie.......

Materialien

EQUIPMENT

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
REAGENTS
Blebbistatin	Toronto Research Chemicals	B592500
CaCl2	Acros Organics	AC34961-5000
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1
HEPES	Sigma-Aldrich	H7006-500
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-1
MgCl2• 6H2O	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO4• 7H2O	Sigma-Aldrich	M1880-1
NaCl	Fisher Scientific	BP358-212
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282-500
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-1
Pyruvat	Sigma-Aldrich	P2256-25
TMRM	Invitrogen	T-668<
Konfokales Linienrastermikroskop (LSM 510 Meta, Zeiss), Softwareversion 4.2 SP1 inklusive Modul "Physiologische Analyse".

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