Summary
Die konfokale Scanning-Mikroskopie zur Abbildung Einzel mitochondriale Ereignisse in perfundierten Herz-oder Skelettmuskulatur in lebenden Tieren angewendet. Echtzeit-Überwachung von einzelnen mitochondrialen Prozesse wie Superoxid blinkt und Membranpotentialschwankungen ermöglicht die Auswertung der mitochondrialen Funktion in einer physiologisch relevanten Kontext und bei pathologischen Störungen.
Abstract
Mitochondrium ist ein wichtiger intrazellulären Organellen für die Energieproduktion und intrazelluläre Signal in eukaryontischen Systemen verantwortlich. Mitochondriale Dysfunktion oft begleitet und trägt zur menschlichen Krankheit. Mehrzahl der Ansätze, die entwickelt wurden, um die mitochondriale Funktion und Dysfunktion beurteilen sich auf in vitro oder ex vivo-Messungen. Ergebnisse aus diesen Versuchen sind die Fähigkeit zur Bestimmung der mitochondrialen Funktion in vivo begrenzt. Hier beschreiben wir einen neuen Ansatz, die konfokale Scanning-Mikroskopie für die Abbildung von intakten Geweben im Live Aminalen, die die Bewertung der einzelnen Funktion der Mitochondrien in einer Echtzeitweise in vivo ermöglicht nutzt. Zunächst erzeugen wir transgene Mäuse, die mitochondriale gezielte Superoxid-Indikator, zirkular permutiert gelb fluoreszierende Protein (mt-cpYFP) ausdrückt. Betäubt mt-cpYFP Maus auf eine maßgeschneiderte Tischadapter und Zeitraffer-Bilder werden f genommen Festrom die freiliegenden Skelettmuskeln der hinteren Gliedmaßen. Die Maus wird anschließend getötet und das Herz wird für Langendorff-Perfusion mit physiologischen Lösungen bei 37 ° C eingestellt Perfundierten Herzen in einer speziellen Kammer auf der konfokalen Mikroskoptisch positioniert und leichtem Druck aufgebracht wird, um das Herz zu immobilisieren und Herzschlag induzierten Bewegungsartefakte zu unterdrücken. Superoxid Wallungen werden durch Echtzeit-2D-konfokale Bildgebung bei einer Frequenz von einem Bild pro Sekunde erfasst. Die Perfusionslösung können modifiziert werden, um verschiedene Substrate Atmung oder andere Fluoreszenzindikatoren enthalten. Die Perfusion kann auch eingestellt werden, um Krankheitsmodellen wie Ischämie und Reperfusion zu erzeugen. Diese Technik ist ein einzigartiger Ansatz zur Bestimmung der Funktion von Einzel Mitochondrium in intakten Geweben und in vivo.
Introduction
Mitochondrien spielen eine zentrale Rolle in der Zell Bioenergetik, Radikal Signalisierung, Redox-Homöostase, Ionenregulation und Zellschicksal Bestimmung 1,2. Mitochondrien Dysfunktion oft begleitet und die Voraussetzung für die Entstehung von Krankheiten 6.3. Insbesondere in den Muskelsysteme wie Herz-und Skelettmuskulatur liefert mitochondrialen Atmung der meisten ATP rechtzeitige Regulierung der intrazellulären Calcium und robuste Kraftentwicklung 7,8 unterstützen. Diese Muskeln besitzen eine große Anzahl von Mitochondrien, die oft besetzen bis 20-40% des gesamten Zellvolumens und "fixiert" zwischen Myofilamenten 2.
Trotz der zahlreichen Studien, das Verständnis der Regulation der mitochondrialen Funktion, insbesondere in vivo und unter physiologisch relevanten Bedingungen, begrenzt. Einer der Gründe ist, dass die Mehrheit der zur Auswertung der mitochondrialen Funktion entwickelten Methoden beruhen auf in vitro-oder ex vivo-Ansätze, wie die Überwachung des Sauerstoffverbrauchs von isolierten Mitochondrien mit künstlichen Substraten ergänzt, und die indirekte Bestimmung der mitochondrialen Funktion durch Morphologie (z. B. Elektronenmikroskopie), Enzymaktivität (z. B. Aconitaseaktivität) oder intrazellulären ATP-Spiegel 9-11 .
Kürzlich, kleines Molekül Fluoreszenzindikatoren mit relativer mitochondrialen Bereicherung wurden angewendet, um einen Einblick in die mitochondriale Signale, einschließlich Membranpotential, Kalzium und reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), in intakten Zellen 11-13 bieten. Außerdem haben mehrere grün fluoreszierende Protein (GFP) und ROS basierten Redox-Indikatoren entwickelt worden, um genauere Beurteilung des Fachintrazellulären Redox-oder ROS Signale 14-16 zu erreichen. Unter diesem, eine genetisch kodierte Superoxid-Indikator, der Kreis permutierter gelb fluoreszierendes Protein und Targete entwickelten wird in Mitochondrien (mt-cpYFP) 17. mt-cpYFP kann bei 405 oder 488 nm mit beiden Emissionspeaks bei 515 nm angeregt werden. Die Emission bei 488 nm Anregung, die auf Superoxid-spezifisch, wie durch vorherige in vitro-und in-vivo-Kalibrierung 17,18 dargestellt. Die Emission bei 405 nm Anregung wird als interne Kontrolle verwendet (siehe hierzu detaillierte Informationen über die Emissions-und Anregungsspektren von mt-cpYFP unter verschiedenen Bedingungen Abbildung 1 von Lit. 17). Mit Zeitraffer-konfokale Bildgebung, erkennt diese Anzeige platzen Superoxid-Produktion Veranstaltungen, namens Superoxid Wallungen, in Einzel Mitochondrien intakter Zellen. Superoxid-Flash dient als eine zusammengesetzte Funktion der mitochondrialen Atmung, vorübergehende Begleitmitochondrienmembran Depolarisation und ROS-Produktion 17-20. Kürzlich haben wir die pan-Gewebe mt-cpYFP transgenen Mäusen mit dem pUC-CAGGS-mt-cpYFP Vektor 17,19 auf C57/BL6 Hintergrund generiert und verifiziert die starken Ausdrucksion dieses Indikators in Herz, Skelettmuskeln und anderen Geweben (Abbildung 2). Die transgenen Mäuse werden auf Anfrage und MTA Genehmigung durch die Universität von Washington sein für interessierte akademischen Forschern zur Verfügung.
In dieser Studie beschreiben wir in situ-Bildgebung von Superoxid blinkt Langendorff perfundierten Herzen als auch in vivo-Abbildung von von Blitzereignissen in der Skelettmuskulatur von betäubten mt-cpYFP transgenen Mäusen 17,19. Diese Technologie ermöglicht die Echtzeitüberwachung der einzelnen mitochondrialen ROS-Produktion Ereignisse in einem physiologisch relevanten Bedingungen oder in vivo 21,22. Es ist auch möglich, das System zu verwenden, um andere einzelne Parameter wie mitochondriale Membranpotential und Calcium mit geeigneten fluoreszierenden Indikatoren. Ferner gleichzeitige oder parallele Auswertung der mitochondrialen Funktion mit intrazelluläre Ereignisse (z. B. Calcium Transienten) oder Herzfunktion (z. B.. Ejektionsfraktion) erreicht werden. Pathologischen Störungen, wie Ischämie und Reperfusion kann perfundierten Herzen angewandt werden, um die Auswirkungen von Stress auf die einzelnen mitochondrialen Funktion im intakten Myokard zu beurteilen.
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Protocol
1. Experiment Vorbereitung
- Bereiten Sie die isotonische balancierte Salzlösung (50 ml), enthaltend 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2 und 10 mM HEPES (pH 7,2) für die in vivo-Bildgebung Skelettmuskel.
- Herstellung von 1 l Krebs-Henseleit-Puffer (KHB) enthält: 118 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 0,5 mM EDTA und 25 mM NaHCO3.
- Blasen die KHB mit Gas, das 95% O 2/5% CO &sub2; für 10-15 min vor der Zugabe von 2 mM CaCl 2. In metabolischen Substrate (z. B. 10 mM Glucose und 0,5 mM Pyruvat).
- Vorbereitung der chirurgischen Instrumente durch Sterilisieren der Klemme, Scheren und Pinzetten in 70% Ethanol und anschließendes Spülen in sterilisiertem ddH 2 O.
- Schalten Sie den Herzdurchblutung System, stellen Sie die Temperatur auf dem Wasserbad und Thermostaten, die Geschwindigkeit der Schlauchpumpe bis 6 ml / min.
- Blase der KHB mit 95% O 2/ 5% CO 2-Gases und die Durchflussrate und Temperatur (37 ° C, durch eine faseroptische Temperatursonde) des Abwassers zu überwachen. Das System benötigt etwa 20 Minuten für Gas-und Temperaturausgleich.
2. Die konfokale Bildgebung der Skelettmuskulatur In Vivo
- Maus anästhesiert mit Pentobarbital (80 mg / kg, ip). Das Tier wird chirurgische Anästhesie (keine Reaktion auf Zehenklemm) innerhalb von 10-15 min erreicht und bleibt in diesem Zustand für 1-1,5 h, ausreichend für die in vivo-Abbildung von Skelettmuskeln.
- Haare entfernen auf einem der Hinterbeine und Sterilisieren der Haut mit 70% Ethanol.
- Einen Einschnitt auf der Haut entlang der Außenseite der Schenkel um die Wadenmuskeln freizulegen.
- Nehmen Sie den Epimysium vorsichtig mit einem scharfen Zangen und einen Einschnitt durch sie mit einer Schere. Weitere sezieren, um die Epimysium entfernen und setzen die Muskelfasern unter ihm.
- Für die in vivo Belastung der TMRM in die SkelettMuskel, gehören TMRM (500 nM) in der isotonischen Salzlösung ausgeglichen, um Muskeln für 30 Minuten eintauchen und dann waschen von Anzeige-freie Lösung.
- Setzen Sie die Maus auf seiner Seite auf dem konfokalen Mikroskop (Zeiss LSM 510) Stufe und der hinteren Gliedmaßen in einer Position, die der freiliegenden Skelettmuskel zugewandt ist gegen das Deckglas, das den Boden der Kammer bildet, zurückhalten. Das Deckglas ist zwischen dem Muskelgewebe und dem invertierten Objektiv (40x Öl).
- Drücken Sie das Bein leicht nach unten, um einen engen Kontakt zwischen dem Gewebe und dem Deckglas zu machen. Tauchen Sie die freiliegenden Muskeln in isotonischer Salzlösung ausgeglichen.
- Datensatz zweidimensionale (2D, xy) konfokale Bilder mit einer Abtastrate von einer Sekunde pro Rahmen. Die Intensität jedes Pixels wird in 8-Bit-Auflösung digitalisiert. Normalerweise enthält eine serielle Scan 100 Bilder.
- Sammeln aufeinanderfolgenden Bildern von aufregenden ersten bei 405 nm und Sammeln bei> 505 nm dann bei 488 nm, während das Sammeln bei> 505 nm für zwei Wellenlängen excitation Bild von mt-cpYFP. Verwenden sequentielle Anregung bei 405, 488 und 543 nm und Emission bei 505 bis 545 zu sammeln, 505-545 und> 560 nm, jeweils für Dreifachanregungswellenlänge Bildgebung von mt-cpYFP und TMRM.
3. Die konfokale Bildgebung von perfundierten Maus Herz
- Unmittelbar nach der in vivo-Abbildung von Skelettmuskeln, injizieren die Maus mit 200 Einheiten Heparin (ip). Zehn Minuten später einschläfern der Maus durch Thorakotomie und schnell zu entfernen, die das Herz mit Lunge und Thymus attached to it.
- Entfernen Sie schnell die Lunge in eiskaltem Puffer. Identifizieren Sie die Lappen des Thymus und vorsichtig abziehen, um den aufsteigenden Aorta aus.
- Entfernen Sie den Thymus und isolieren die Aorta durch vorsichtiges Entfernen von umgebenden Gewebe.
- Machen Sie einen Schnitt am oberen Ende der aufsteigenden Aorta vor dem ersten Zweig der Aortenbogen.
- Halten Sie die Wand der Aorta vorsichtig mit zwei Mikronahtzange, um den Hohlraum freizulegen, und vorsichtig die Aorta auf die ca.nnula (PE50-Rohr). Die Aorta wird an Ort und Stelle mit einem Mikro-Gefäßklemme gehalten, während Nähte werden schnell um die Aorta verbunden.
- Entfernen Sie die Klemme, sorgfältig zu prüfen, die Kanüle mit einer Pinzette, um sicherzustellen, dass die Spitze der Kanüle über Aortenwurzel ist. Zusätzliche Verbindungen werden nach Bedarf hinzugefügt, um das Herz in Position zu halten.
- Schalten Sie die peristaltische Pumpe und Perfusion des Herzens bei 1 ml / min. Das Herz wird wieder schlagen auf Perfusion.
- Stellen Sie die Position des Perfusionssystems legte das Herz auf dem Mikroskoptisch. Die Bühne hat einen Adapter, der Erwärmung der Kammer, die das Herz hält kann.
- 1 ml KHB Perfusionslösung in der Kammer, um das Herz teilweise eintauchen. Überwachung der Temperatur der Kammer bei 37 ° C Entfernen Abfluß aus der Kammer unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe.
- Erhöhen die Geschwindigkeit der peristaltischen Pumpe allmählich auf eine ausreichende Strömung (ca. 2 ml / min), um das Herz zu liefern.
- Nach 10 min Stabilisierung versorgen die HEArt mit 10 uM blebbistatin und 100-500 nM TMRM. Herzschlag wird nach 10 min zu verlangsamen.
- Sanften Druck auf das Herz, um engen Kontakt des Herzens mit dem Deckglas auf dem Boden der Kammer zu gewährleisten und um weiter zu unterdrücken Herzschlag.
- Verfahren Sie ebenso für die konfokale Bildgebung von intakten Herzmuskel, wie in Schritt 2.8 oben beschrieben. Die Brennebene sorgfältig anpassen, um das klarste Bild möglich zu offenbaren.
4. Bildverarbeitung und Datenanalyse
- Verwenden Sie Tools von der "Physiologische Analysis"-Modul des konfokalen Software, um Einzel mitochondriale Membranpotential Wallungen und Veränderungen zu analysieren ist. Dieses Modul ist häufig in der Bildaufnahme-Software des konfokalen Systems enthalten und ermöglicht die Bestimmung bestimmter Bildbereiche sowie Ausgangs der Fluoreszenzintensität mit der Zeit Etiketten.
- Öffnen Sie die Datenbank und dann die Serien 2D-Image-Datei zu analysieren.
- Klicken Sie auf die "Regionof Interest (ROI) bedeuten Mittelwert von ROIs ", um zum Schalter" "-Modus. Klicken Sie auf die" Region of Interest (ROI) Mittelwert Mittelwert von ROIs "-Modus", um zum Schalter. "
- Schalten Sie die Anzeige der anderen Kanäle außer dem Kanal der cpYFP 488 nm für die Auswahl der blinkt.
- Zoom in das Bild und bewegen manuell Schieberegler, um die seriellen 2D-Bildern zu spielen.
- Identifizieren Einzel mitochondrialen Superoxid blinkt durch Anordnen der Ort, an dem Fluoreszenzsignal steigt vorübergehend. Verwenden Sie den entsprechenden ROI-Tool, um die Blitze zu markieren. Die Spur, die zeitabhängige Fluoreszenzänderung jedes ROI zeigen sich neben dem Bild.
- Nach der Auswahl aller blinkt, schalten Sie die Anzeige der anderen Kanäle. Wählen Sie eine ROI auf das Bild außerhalb der Zelle für die Hintergrundsignal Subtraktion. Ausgangs die durchschnittliche Fluoreszenz jedes ROI zusammen mit den Zeit Etiketten.
- Notieren Sie die Anzahl der Blitze in jeder der seriellen Scan-Image-Datei zusammen mit der Scan-Zeit und Flächedie Zelle. Verwenden von Excel zum Blitzfrequenz als Anzahl der Blitze pro 100 sec / 1000 um 2 Zellfläche zu berechnen.
- Verwenden Sie eine benutzerdefinierte entwickelte Programm in Interactive Data Language (IDL, ResearchSystems) geschrieben, um die Parameter der einzelnen Flash-(Amplitude, Zeit, Höhepunkt erreichen und Abfallzeit) zu berechnen. IDL-Software ist im Handel erhältlich und der speziell entwickelten Programm für Flash-Parameteranalyse können beim Autor angefordert werden.
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Representative Results
Gemäß diesem Protokoll können in vivo Bildgebung von Einzel mitochondriale Ereignisse in der Skelettmuskulatur von betäubten Mäusen durchgeführt werden, gefolgt von in situ-Bildgebung in perfundierten Herzen (Fig. 1). Die optimale Einstellung der Aufnahmebedingungen wird dafür sorgen, klare Bilder der intakten Muskeln und mit Einzel Mitochondrium Auflösung (Abbildung 2). TMRM wird oft verwendet, um die Position der mt-cpYFP überprüfen und sollte eine vollständige überlappenden Muster mit der mt-cpYFP Signal (Abbildung 2) zu zeigen. TMRM ist eine kommerziell erhältliche Anzeige für mitochondriale Membranpotential-Messung in intakten Zellen 23. Seine Spektren sind unterscheidbar von derjenigen cpYFP. Ferner kann durch Verwendung der sequentiellen Anregung Verfahren werden die Sendesignale von TMRM und mt-cpYFP nicht miteinander interferieren 17. In Abbildung 3 dargestellt repräsentative Bilder zeigen, dass einzelne mitochondrialen Superoxid-Flash accodurch Membrandepolarisation mpanied in den seriellen Scan-2D-Bilder identifiziert werden, mit einer transienten Zunahme der Fluoreszenz in den Hintergrundsignalen in beide Gewebe Skelettmuskel und Myokard (Abbildung 3). Neben der hohen Auflösung ist eine ausreichende Fluoreszenzintensität erforderlich. Dies kann durch die Modulation der Laserintensität und die Verstärkung in der Sammelkanäle erreicht werden. Im allgemeinen wird die Grundfluoreszenzsignal von der Zelle auf ein Drittel bis ein Viertel der maximalen Intensität des Kanals. Da die Expression von mt-cpYFP und das Laden von TMRM können unter Tieren unterscheiden kann, ist die Feinabstimmung der Abbildungsbedingungen für jedes Experiment durchgeführt werden. Beide physiologischen und pathologischen Störungen, wie z. B. metabolische Substrate 17,19, elektrische Stimulation (Fig. 4) 20, ischämischer Reperfusions-17, wurden verwendet, um zu zeigen, dass Superoxid-Flash-Aktivität reagiert auf Veränderungen der zellulären Stoffwechsellage. 
Fig. 1 ist. Schematische Darstellung des konfokalen Abbildungs der Skelettmuskeln und Langendorff perfundierten Herzen. Transgene Maus exprimieren mt-cpYFP anästhesiert und die Skelettmuskeln auf einem der Hinterbeine für konfokale Bildgebung ausgesetzt. Das Herz wird dann in der Langendorff-Modus perfundiert und konfokalen Bild durchgeführt wird. Bildverarbeitung und Datenanalyse des konfokalen Software und individuell entwickelte Programm.
2. Konfokale Bildgebung von Skelettmuskelfasern in vivo und in Myokard perfundiert Herzen. A. Repräsentative Bilder, welche die Skelettmuskulatur von nicht-transgenen (Ntg) und mt-cpYFP transgenen (mt-cpYFP) Maus mit mitochondrialen Membranpotentials Anzeige geladen, TMRM. B. Repräsentative Bildern, die die Myocardium von Ntg und mt-cpYFP Mäuse in Langendorff-perfundierten Herzen. Ex: Anregungswellenlänge. mt-cpYFP wird bei 405 und 488 nm mit 505 bis 530 nm (blau) und 505 bis 530 nm (grün), jeweils gesammelt Emissionen angeregt werden. TMRM wird bei 543 nm mit einer Emission bei> 560 nm (rot) gesammelt angeregt wird. Maßstabsbalken = 50 um.
3. Einzel mitochondrialen Superoxid blinkt in der Skelettmuskulatur in vivo und in perfundierten Herzen detektiert. A. Repräsentative Bilder (oben) und Spuren von zeitabhängigen Fluoreszenz-Änderung (mt-cpYFP bei 405 und 488 nm Anregung und TMRM bei 543 nm Anregung, unteres Bild), die einen einzelnen mitochondrialen Superoxid-Blitz (von Orangen Pfeilen hervorgehoben in der erweiterten Teil der Bilder) in Skelettmuskelfasern. Beachten Sie die erhöhten mt-cpYFP Signal (Anregung bei 488 nm) wird begleitet durch eine verminderte TMRM Signal. B. Repräsentative images (oben) und Spuren von zeitabhängigen Fluoreszenz-Änderung (unten) während eines einzigen mitochondrialen Superoxid-Blitz in perfundierten Myokard. Maßstabsbalken = 50 um. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
4. Erhöhte Superoxid Blitzfrequenz in perfundierten Herzen durch elektrische Stimulation. Das Herz wurde elektrisch stimuliert (Stimulations, 4 V und 2 Hz) für 2 min. Daten sind Mittelwerte ± SEM, n = 8 Zellen. *:. P <0,05 gegenüber Ruhe Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Discussion
Imaging Einzel mitochondriale Ereignisse in lebenden Tier oder durchbluteten Organen hat erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden für die mitochondriale Funktion Auswertung 17,19,21,22,24,25. Die hier beschriebene Technik kann Echtzeit-in-situ-Bestimmung der mitochondrialen Funktion in einem echten physiologischen Zustand auf subzellulärer Auflösung zu erreichen. Dies ist besonders nützlich, wenn sie mit anderen Messungen kombiniert werden, um systemisch Studium der Rolle von Mitochondrien in der normalen Funktion eines bestimmten Organ oder Zelltyp in vivo. Dies ist eine komplizierte Technik, die konfokale Mikroskopie und anspruchsvolle Perfusionssystem mit der Steuerung der verschiedenen Parameter kombiniert. Dennoch wurde diese Technik verwendet, um den ganzen Körper Glukose-Stoffwechsel mit Muskelmitochondrienfunktion 17,19,20 verknüpfen und werden derzeit von uns verwendet, um das mitochondriale Funktionsstörungen bei Herzerkrankungen zu untersuchen.
Der Langendorff-Herz perfusion System durch Überwachen des linken Ventrikels Druck und Abbilden der intrazellulären Ca 2 +-Transienten in jedem Schlag kompatibel zu Herzfunktionsbewertung. Alternativ können auch andere fluoreszierende Indikatoren wie MitoSOX oder DCF perfundiert werden, um in situ Darstellung von stationären ROS im Myokard zu erleichtern. Langendorff perfundierten Herzen wurde weithin verwendet, um die Reaktion des Herzens auf physiologische (z. B. β-adrenerge Stimulation durch Dobutamin) oder pathologische (z. B. Ischämie-Reperfusion) 26-28 Störungen auszuwerten. Solche Behandlungen können in das konfokale Abbildungssystem nach Einzel mitochondrialen Funktion in Reaktion auf die Spannungen zu beurteilen eingearbeitet werden.
Einschränkungen dieser Methode sind die Auswahl von Geweben / Organen, die machbar ist für Live-Tierbildgebung sind. Oberflächliche Gewebe wie Skelettmuskulatur, subkutane Strukturen und oberflächlichen Nerven sind ideal für die konfokale Bildgebung in der Live-animal. Innere Organe sind technisch ungeeignet für Live-Tierbildgebung auf Grund der umfangreichen Schäden an der Maus, während Aussetzen der Orgel. Allerdings können die inneren Organe für die Organdurchblutung / Kultur eingestellt werden, wie Langendorff perfundierten Herz-oder Hirnschnittkultur, wenn eine physiologische mimetischen Umwelt aufrechterhalten werden kann. Zusätzlich hat Konfokalmikroskop eine effektive Abbildungstiefe von 30-50 &mgr; m, was die Abbildung von einigen Zellschichten unterhalb der Organoberfläche ermöglicht. Es ist möglich, dass dieses System mit einer Multiphotonen-Mikroskop, das einen viel höheren Eindringtiefe (beispielsweise bis zu 1 mm) wird kombiniert und verwendet worden, um die Funktion der Mitochondrien im intakten Herzens 29 zu beurteilen. Bewegungsartefakte ist ein weiterer kritischer Punkt, der berücksichtigt werden sollte. Die Mitochondrien in der Skelettmuskulatur und Herzmuskelzellen zeigten minimale Bewegung während des Scans. Ferner kann Herzschlag-induzierte Bewegungsartefakte durch Perfusion mit blebbistatin ein drückt oder eliminiert werden,nd Anwendung von leichtem Druck auf das Herz. In anderen Zelltypen, wie Fibroblasten, Neuronen und können die Mitochondrien konstant und dramatischen Bewegungen zu unterziehen. Während der Bildverarbeitung und-analyse, sollten alle Signaländerungen aufgrund von Bewegungsartefakten sorgfältig identifiziert und ausgeschlossen werden.
Zusätzliche Herausforderungen dieser Technik gehören die Aufrechterhaltung der geeigneten Zustand während des Experiments, positive Kontrollen und Dateninterpretation. Für Skelettmuskel-Bildgebung bei narkotisierten Mäusen, sollte der freiliegenden Muskelfläche in physiologischen Puffern zu jeder Zeit eingetaucht werden. Vital der Maus wie Atmung sollte während des gesamten Experiments überwacht. Für durchbluteten Herz Studien, werden entsprechende Sauerstoffversorgung, Temperaturkontrolle und Substratversorgung erforderlich. Positive Kontrollen werden empfohlen, um den Zustand und die Reaktionsfähigkeit der Gewebe zu überprüfen. Um dies zu tun, können Mäuse mit Insulin oder Glukose und durchbluteten Herzen injiziert werden kann elektrisch stimu seinlated oder mit Isoproterenol perfundiert. Erhöhte Superoxid blinkt sollte nach dieser Behandlung (Fig. 4) 19,20 beobachtet werden. Darüber hinaus werden die Zeitraffer-Bilder aufgenommen, wenn der Bewegungsartefakten wird durch Hemmung der Herzschlag, die sub-physiologischen Bedingungen durch verminderte Arbeitsbelastung produziert drückt. Somit sollte der perfundierten Herzen Experiment als enger Mimetikum der in vivo Situation betrachtet werden.
Schließlich wurde das Verfahren unter Verwendung eines konfokalen Zeiss (LSM 510) entwickelt. Andere konfokalen System (zB Nikon, Olympus oder Leica) kann verwendet werden, wenn das System die folgenden Anforderungen erfüllt: (1) Zeitraffer-Rahmen-Scan-Modus, (2) hat eine Abtastrate von 1 sec / Rahmen, und (3) können einzelne Mitochondrium Auflösung (zB 1 um x 2 um) zu erreichen. Die Software eines konfokalen System erlaubt meist einfache Bildverarbeitung und Analyse, wie beispielsweise die Definition der ROIs und Fluoreszenzintensitätsausgabe mit time Etiketten. Alternativ können Bild J Software für die Bildanalyse-und Blitzparameter Berechnung verwendet werden.
Zusammenfassend ist die Abbildung einzelner mitochondriale Ereignisse wie Superoxid blinkt in der Skelettmuskulatur in vivo oder in perfundierten Herzen ein einzigartiger Ansatz zur Echtzeit-Bestimmung der mitochondrialen Funktion. Diese Technik ist ein bedeutender Fortschritt gegenüber den herkömmlichen in vitro-Messungen und eine genauere Beurteilung der Mitochondrienfunktion und seine Beziehung mit zellulären Prozessen / Funktionen unter realen physiologischen Bedingungen bereitzustellen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Dr. danken. Heping Cheng, Huiliang Zhang und Stephen Kolwicz für ihre hilfreichen Kommentare und technische Unterstützung bei der Entwicklung dieser Methode. Diese Studie wurde vom NIH Zuschüsse und der Entwicklung Scientist Grant von der American Heart Association WW unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Blebbistatin | Toronto Research Chemicals | B592500 | |
| CaCl2 | Acros Organics | AC34961-5000 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006-500 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1 | |
| MgCl2•6H2O | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | M1880-1 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282-500 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014-1 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25 | |
| TMRM | Invitrogen | T-668 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module. | |||
References
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