Summary
Konfokal scanning mikroskopi används för att avbilda enskilda mitokondriella händelser i perfusion hjärta eller muskler i levande djur. Realtidsövervakning av enstaka mitokondriella processer såsom superoxidvallningar och membranpotentialen fluktuationer möjliggör utvärderingen av mitokondriell funktion i ett fysiologiskt relevant sammanhang och under patologiska störningar.
Abstract
Mitokondrien är en viktig intracellulär organell som ansvarar för energiproduktion och intracellulär signalering i eukaryota system. Mitokondriell dysfunktion ofta följer med och bidrar till mänskliga sjukdomar. Majoriteten av de metoder som har utvecklats för att utvärdera mitokondriell funktion och dysfunktion är baserade på in vitro-eller ex vivo-mätningar. Resultaten från dessa experiment har begränsad förmåga vid bestämning mitokondriell funktion in vivo. Här beskriver vi en ny metod, som utnyttjar konfokal scanning mikroskopi för avbildning av intakta vävnader i levande aminaler, som tillåter utvärdering av enkelmitokondriefunktion i en realtids sätt in vivo. Först skapar vi transgena möss som uttrycker den mitokondriella riktade superoxid indikator, cirkulärt permuterat gula fluorescerande protein (mt-cpYFP). Sövda mt-cpYFP musen är fast på en skräddarsydd scen adapter och time-lapse bilder tas from de exponerade muskler i bakdelen. Musen därefter offras och hjärtat är inställd för Langendorff perfusion med fysiologiska lösningar vid 37 ° C. Den perfunderade hjärtat är placerad i en speciell kammare på konfokalmikroskop scenen och ett lätt tryck appliceras för att immobilisera hjärtat och undertrycka hjärtrytm inducerad rörelseartefakt. Superoxid blinkar upptäcks av realtids 2D konfokala avbildning med en frekvens av en bildruta per sekund. Perfusionen lösningen kan modifieras till att innehålla olika respirationssubstrat eller andra fluorescerande indikatorer. Perfusionen kan också justeras för att producera sjukdomsmodeller, såsom ischemi och reperfusion. Denna teknik är en unik metod för att bestämma funktionen av inre mitokondrie, i intakta vävnader och in vivo.
Introduction
Mitokondrier har en central roll i cell bioenergetics, friradikal-signalering, redox-homeostas, jon-reglering, och cellöde bestämning 1,2. Mitokondrier dysfunktion ofta följer och ligger bakom patogenesen av sjukdomar 3-6. Särskilt i muskelsystem såsom hjärtat och skelettmuskulaturen, ger mitokondrie andning majoriteten av ATP för att stödja snabb reglering av intracellulär kalcium och robust kraft utveckling 7,8. Dessa muskler besitter ett stort antal mitokondrier som ofta upptar upp till 20-40% av den totala cellvolymen och "fixerade" mellan myofilamenten 2.
Trots ett stort antal studier, vår förståelse av mitokondriefunktionen förordningen, särskilt in vivo och under fysiologiskt relevanta förhållanden, är begränsad. En av anledningarna är att majoriteten av de metoder som utvecklats för att utvärdera mitokondriell funktion är beroende av i VITRo eller ex vivo-metoder, till exempel övervakning av syreförbrukning av isolerade mitokondrier kompletterat med artificiella substrat, och indirekt bestämning av mitokondriefunktion genom morfologi (t.ex. elektronmikroskop), enzymaktivitet (t.ex. aconitase aktivitet), eller intracellulära ATP-nivåer 9-11 .
Nyligen har små molekyler fluorescerande indikatorer med relativ mitochondrial anrikning använts för att ge en glimt av de mitokondriella signaler, inklusive membranpotential, kalcium och reaktiva syreföreningar (ROS), i intakta celler 11-13. Dessutom flera grönt fluorescerande protein (GFP) baserad redox och ROS indikatorer har utvecklats för att uppnå mer specifik bedömning av den compartmentalized intracellulära redox eller ROS signalerar 14-16. Bland detta har vi utvecklat en genetiskt kodad superoxid indikator, den cirkulära permuterad gula fluorescerande protein, och targeted det i mitokondrier (mt-cpYFP) 17. mt-cpYFP kan exciteras vid 405 eller 488 nm med båda emissionstoppar vid 515 nm. The emission vid 488 nm excitation är speciellt mottaglig för superoxid såsom visas av föregående in vitro-och in vivo-kalibreringar 17,18. Utsläppen vid 405 nm excitation används som intern kontroll (se figur 1 i Ref 17 för detaljerad information om utsläpp och excitationsspektra av mt-cpYFP under olika förhållanden). Med tidsförlopp konfokala imaging, upptäcker denna indikator spricker superoxid produktion händelser, som heter superoxid blinkar, i enstaka mitokondrier i intakta celler. Superoxid flash fungerar som en sammansatt funktion av mitokondrie andning, medföljande gående mitochondrial membran depolarisation och ROS produktion 17-20. Nyligen har vi genererat de pan-vävnads mt-cpYFP transgena möss med användning av pUC-CAGGS-mt-cpYFP vektor 17,19 på C57/BL6 bakgrund och kontrollerade de starka uttrycksionen av denna indikator i hjärtat, skelettmuskler och andra vävnader (figur 2). Den transgena möss kommer att vara tillgänglig för intresserade akademiska utredare på begäran och MTA godkännande av University of Washington.
I denna studie beskriver vi in situ avbildning av superoxid blinkar i Langendorff perfusion hjärta och in vivo imaging av flash händelser i skelettmuskler sövda mt-cpYFP transgena möss 17,19. Denna teknik möjliggör realtidsövervakning av enskilda mitokondriella ROS produktion händelser i en fysiologiskt relevant tillstånd eller in vivo 21,22. Det är också möjligt att använda systemet för att övervaka andra ensamstående mitokondriella parametrar såsom membranpotential och kalcium med lämpliga fluorescerande indikatorer. Vidare, samtidig eller parallell utvärdering av mitokondriefunktion med intracellulära händelser (t.ex. kalcium transienter) eller hjärtfunktion (t ex. Ejektionsfraktion) kan uppnås. Patologiska störningar, såsom ischemi och reperfusion, kan tillämpas på den perfusion hjärtat för att bedöma effekterna av stress på enstaka mitokondriefunktion i intakta hjärtmuskeln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Experiment Framställning
- Förbered isoton balanserad saltlösning (50 ml) innehållande: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 och 10 mM HEPES (pH 7,2) för in vivo-skelettmuskel avbildning.
- Bered 1 L av Krebs-Henseleit-buffert (KHB) innehållande: 118 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 0,5 mM EDTA och 25 mM NaHCO 3.
- Bubbla den KHB med gas innehållande 95% O2 / 5% CO2 under 10 till 15 min före tillsats av 2 mM CaCl2. Lägg metaboliska substrat (t ex 10 mM glukos och 0,5 mM pyruvat).
- Förbered de kirurgiska instrumenten genom sterilisering kläm, sax och pincett i 70% etanol och sedan skölja i steriliserad DDH 2 O.
- Slå på hjärtat perfusion systemet, justera temperaturen på vattenbadet och cirkulationspumpen, ställ in hastigheten på peristaltiska pumpen till 6 ml / min.
- Bubbla den KHB med 95% O 2/ 5% CO2 gas, och övervakning av flödet och temperatur (37 ° C, med en fiberoptisk temperatursond) av utflödet. Systemet behöver ca 20 min för gas-och temperaturjämvikt.
2. Confocal avbildning av skelettmuskulaturen in vivo
- Söva musen med pentobarbital (80 mg / kg, ip). Djuret kommer att nå kirurgisk anestesi (inget svar på tå nypa) inom 10-15 minuter och stanna kvar i denna status för 1-1,5 timmar, tillräckligt för vivo avbildning av skelettmuskulaturen i.
- Ta bort hår på ett av bakbenen och sterilisera huden med 70% etanol.
- Gör ett snitt på huden längs den yttre sidan av benet för att exponera gastrocnemius muskler.
- Plocka upp epimysium försiktigt med en vass pincett och göra ett snitt genom den med en sax. Ytterligare dissekera att ta bort epimysium och exponera muskelfibrerna under den.
- För in vivo-lastning av TMRM in i skelettmuskel, inkluderar TMRM (500 nM) i isoton balanserad saltlösning fördjupa muskel under 30 minuter och sedan tvätta ut genom indikator-fri lösning.
- Placera musen på dess sida på konfokalmikroskop (Zeiss LSM 510)-steget och hålla tillbaka den bakre lem i en position som den exponerade skelettmuskel är vänd mot täckglas, som bildar botten av kammaren. Den täckglas är mellan muskelvävnad och den inverterade mål (40X olja).
- Tryck benet ner försiktigt för att göra tät kontakt mellan vävnaden och täckglas. Sänk ned de exponerade muskler i isoton balanserad saltlösning.
- Record tvådimensionella (2D, xy) konfokala bilder med en samplingsfrekvens på en sekund per bildruta. Intensiteten för varje pixel digitaliseras på 8-bitars djup. Vanligtvis innehåller en seriell avsökning 100 bildrutor.
- Samla sekventiella bilder av första spännande vid 405 nm och samla på> 505 nm sedan vid 488 nm samtidigt samla på> 505 nm för dubbel våglängd excitation avbildning av mt-cpYFP. Använd sekventiell excitation vid 405, 488 och 543 nm, och samla emission vid 505-545, 505-545 och> 560 nm, respektive, för triple våglängd excitation avbildning av mt-cpYFP och TMRM.
3. Confocal avbildning av perfusion Mouse Heart
- Omedelbart efter vivo avbildning av skelettmuskulaturen i, injicera musen med 200 enheter heparin (ip). Tio minuter senare, avliva musen genom torakotomi och snabbt ta bort hjärtat med lungorna och tymus fäst vid den.
- Snabbt bort lungan i iskall buffert. Identifiera lober bräss och försiktigt skära ner för att exponera stigande aorta.
- Ta bräss och isolera aorta genom att försiktigt ta bort alla omgivande vävnad.
- Skär ett snitt vid den övre änden av den uppåtgående aorta innan den första delen av aortabågen.
- Håll i väggen i aorta försiktigt med två mikrosuturering pincett för att exponera lumen och försiktigt placera aorta på cannula (PE50-rör). Aorta hålls på plats med en mikrokärl klämma medan suturer snabbt knuten runt aorta.
- Ta bort klämman, noga kontrollera kanylen med pincett för att säkerställa att kanylens spets befinner sig ovanför aortaroten. Ytterligare band tillsätts efter behov för att hålla hjärtat på plats.
- Slå på den peristaltiska pumpen och BEGJUTA hjärtat vid en ml / min. Hjärtat fortsätter att slå på perfusion.
- Justera positionen för perfusion systemet och sätta hjärtat på mikroskop scenen. Scenen har en adapter som tillåter uppvärmning av kammaren som håller hjärtat.
- Tillsätt 1 ml KHB perfusionslösningen i kammaren för att partiellt nedsänkas i hjärtat. Övervaka temperaturen i kammaren vid 37 ° C. Avlägsna effluenten från kammaren med hjälp av en peristaltisk pump.
- Öka hastigheten på peristaltisk pump gradvis för att ge tillräckligt flöde (cirka 2 ml / min) till hjärtat.
- Efter 10 min av stabilisering, BEGJUTA heart med 10 pM blebbistatin och 100-500 nM TMRM. Hjärtslag kommer att sakta ner efter 10 min.
- Applicera ett lätt tryck på hjärtat för att säkerställa tät kontakt av hjärtat med täckglas i botten av kammaren och för att ytterligare undertrycka hjärtslag.
- Följ samma procedur för konfokal avbildning av intakt hjärtmuskeln som beskrivs i steg 2.8 ovan. Justera noggrant fokalplanet att avslöja den tydligaste möjliga bild.
4. Bildbehandling och dataanalys
- Använd verktyg som tillhandahålls av "Fysiologiska Analysis" modulen i konfokala programvara för att analysera enstaka mitokondriella blinkar och membran eventuella förändringar. Denna modul är ofta med i bilden förvärvar programvara för konfokala systemet och tillåter bestämning av vissa områden i bilden, samt produktion av fluorescensintensiteten med tidsetiketter.
- Öppna databasen och sedan serie 2D-bildfilen som skall analyseras.
- Klicka på "RegionIntresse (ROI) menar "att byta till" medelvärdet av ROI "-läge. klicka på" Region of Interest (ROI) menar "att byta till" betyda för ROI "-läge.
- Stäng av visningen av andra kanaler utom kanal cpYFP 488 nm för att välja blinkar.
- Zooma i bilden och manuellt flytta skjutreglaget för att spela serie 2D-bilder.
- Identifiera enskilda mitokondriella superoxid blinkar genom att lokalisera den plats där fluorescerande signalen ökar tillfälligt. Använd lämplig ROI verktyg för att markera blinkar. Det spår som visar tidsberoende fluorescens förändring av varje ROI kommer att dyka upp bredvid bilden.
- När du har valt alla blinkar, slå på visning av andra kanaler. Välj en ROI på bilden utanför cellen för bakgrundssignalen subtraktion. Utgång den genomsnittliga fluorescens för varje ROI tillsammans med tidsetiketter.
- Anteckna antalet blinkningar i varje serie skanning bildfilen tillsammans med tiden för sökningen och områdetcellen. Använd Excel för att beräkna blixtfrekvens som antalet blixtar per 100 sek / 1,000 ìm 2 cellområde.
- Använd en anpassad utvecklat program skrivet i Interactive Data Language (IDL, ResearchSystems) för att beräkna parametrarna för varje blixt (amplitud, tid till topp och efterklangstid). IDL programvara är kommersiellt tillgängliga och anpassade utvecklade program för flash parameteranalys kan erhållas från författaren på begäran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enligt detta protokoll, kan in vivo avbildning av enstaka mitokondriella händelser göras i skelettmuskulaturen i sövda möss följt av in situ avbildning i perfusion hjärtat (figur 1). Den optimala inställningen av bildförhållandena kommer att se tydliga bilder av de intakta muskelvävnad och med enkel mitokondrien upplösning (Figur 2). TMRM används ofta för att kontrollera placeringen av mt-cpYFP och bör visa en fullständig överlappande mönster med mt-cpYFP signal (Figur 2). TMRM är en kommersiellt tillgänglig indikator för mitokondriell membranpotential mätning i intakta celler 23. Dess spektra skiljer sig från den i cpYFP. Vidare, genom att använda den sekventiella excitation metoden, utsläppssignalerna från TMRM och mt-cpYFP kommer inte att störa varandra 17. Representativa bilder visas i figur 3 visar att enda mitokondrie superoxid flash accompanied av membrandepolarisering kan identifieras i de seriella 2D skanning av bilder, med en övergående fluorescens ökning över bakgrundssignalerna i båda skelettmuskelvävnader och hjärtmuskeln (Figur 3). Förutom hög upplösning, är tillräcklig fluorescensintensitet krävs också. Detta kan uppnås genom modulering av laserintensiteten och förstärkningen i uppsamlingskanaler. I allmänhet är den basala fluorescens-signalen från cellen fastställas till en tredjedel till en fjärdedel av den maximala intensiteten för den kanalen. Eftersom uttrycksnivån mt-cpYFP och lastning av TMRM kan variera bland djur, bör finjustering av bildförhållanden göras för varje experiment. Både fysiologiska och patologiska störningar, såsom metaboliska substrat 17,19, elektrisk stimulering (Figur 4) 20, ischemisk-reperfusion 17, har använts för att visa att superoxid flash aktivitet reagerar på förändringar i cellulär metabolisk status. 
Figur 1. Schematisk illustration av konfokal avbildning av skelettmuskler och Langendorff perfusion hjärta. Den transgena musen uttrycker mt-cpYFP bedövas och skelettmuskulaturen på ett av bakbenen utsätts för konfokal avbildning. Hjärtat är sedan perfusion i Langendorff läget och konfokala bild bedrivs. Bildbehandling och dataanalys används konfokala programvara och anpassade utvecklade program.
Figur 2. Confocal avbildning av skelettmuskelfibrerna in vivo och hjärtmuskeln i perfusion hjärtat. A. Bilderna visar skelettmuskulaturen av icke-transgen (NTG) och mt-cpYFP transgena (mt-cpYFP) mus laddad med mitokondriell membranpotential indikator, TMRM. B. Bilderna visar myoCardium av NTG och mt-cpYFP möss i Langendorff perfusion hjärta. Ex: Excite våglängd. mt-cpYFP exciteras vid 405 och 488 nm med utsläpp som samlats vid 505-530 nm (blå) och 505 till 530 nm (grönt), respektive. TMRM exciteras vid 543 nm med emissions samlats vid> 560 nm (rött). Skalstrecken = 50 | im.
Figur 3. Enstaka mitokondriella superoxid blinkar upptäckts i skelettmuskulaturen in vivo och in perfusion hjärta. A. Bilderna (övre panelen) och spår av tidsberoende fluorescens förändring (mt-cpYFP vid 405 och 488 nm excitation och TMRM vid 543 nm excitation, undre panelen) visar en mitokondriell superoxid blixt (markerad med orange pilar i det utvidgade del av bilderna) i skelettmuskelfibrerna. Notera den ökade mt-cpYFP signal (vid 488 nm excitation) åtföljs av minskad TMRM signal. B. representant images (övre panelen) och spår av tidsberoende fluorescens förändring (nedre panelen) under en enda mitokondriell superoxid blixt i perfusion hjärtmuskeln. Skala barer = 50 um. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Ökad superoxid blixt frekvens i perfunderad hjärta genom elektrisk stimulering. Hjärtat stimuleras elektriskt (Pacing, 4 V och 2 Hz) i 2 min. Data är medelvärde ± SEM, n = 8 celler. *:. P <0,05 kontra Vila Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Imaging enstaka mitokondriella händelser i levande djur eller perfusion organ har betydande fördelar jämfört med traditionella metoder för mitokondriefunktion utvärderings 17,19,21,22,24,25. Den teknik som beskrivs här kan uppnå realtid situ bestämning av mitokondriefunktion i en riktig fysiologiska tillstånd på subcellulära upplösning på. Detta är särskilt användbart, när det kombineras med andra mätningar, till systemiskt studera rollen av mitokondrier i den normala funktionen hos ett speciellt organ eller celltypen in vivo. Detta är en komplicerad teknik som kombinerar konfokalmikroskopi och sofistikerad perfusionssystemet med kontroll av olika parametrar. Ändå har denna teknik använts för att länka hela kroppen glukosmetabolismen med muskelmitokondriefunktion 17,19,20 och är anställd av oss för att studera mitokondriell dysfunktion i hjärtsjukdomar.
Langendorff hjärt perfusion-systemet är kompatibelt med hjärtfunktion utvärdering genom övervakning av vänster kammare trycket och avbildning intracellulära Ca2 + transienter under varje slag. Alternativt kan andra fluorescerande indikatorer såsom MitoSOX eller DCF perfuseras för att underlätta in situ avbildning av steady-state-ROS nivåer i myokardiet. Langendorff perfusion hjärta har i stor utsträckning använts för att utvärdera svaret av hjärta till fysiologiska (t.ex. β-adrenerg stimulering av dobutamin) eller patologiskt (t.ex. ischemi reperfusion) störningar 26-28. Sådana behandlingar kan inkorporeras in i det konfokala avbildningssystemet för att bedöma inre mitokondriefunktion som svar på påkänningar.
Begränsningar av denna metod är bland annat valet av vävnad / organ som är genomförbara för levande djur avbildning. Ytliga vävnader såsom muskler, subkutana strukturer och ytliga nerver är idealiska för konfokal avbildning i levande animal. Inre organ är tekniskt olämpligt för levande djur avbildning på grund av omfattande skador på musen samtidigt exponera orgeln. Däremot kan inre organ inrättas för orgel perfusion / kultur, till exempel Langendorff perfusion hjärtat eller hjärnan bit kultur, om det kan upprätthållas en fysiologisk mimetiska miljö. Dessutom har konfokalmikroskop en effektiv avbildning djup av 30-50 ^ m, vilket tillåter avbildning av ett par lager av cellerna under organytan. Det är möjligt att detta system kan kombineras med en multifotonmikroskop, som har en mycket högre penetrationsdjup (t.ex. upp till 1 mm) och har använts för att utvärdera mitokondriefunktion i intakt hjärta 29. Motion artefakt är en annan viktig fråga som bör övervägas. Mitokondrierna i skelettmuskulaturen och hjärtmuskelceller visade minimal rörelse under genomsökningen. Vidare kan hjärtslag-inducerad rörelseartefakt undertryckas eller elimineras genom perfusion med blebbistatin and tillämpning av lätt tryck på hjärtat. I andra celltyper, såsom neuroner och fibroblaster kan mitokondrierna undergår ständiga och dramatiska rörelser. Under bildbehandling och analys, bör alla signalförändringar på grund av rörelseartefakt noggrant identifieras och uteslutas.
Ytterligare utmaningar som denna teknik inkluderar upprätthålla lämpliga skick under hela experimentet, positiva kontroller och tolkning av data. För skelettmuskulaturen avbildning i sövda möss, bör den exponerade muskelytan doppas i fysiologiska buffertar hela tiden. Vitala tecken på musen såsom andning bör övervakas under hela experimentet. För perfuserade hjärtstudier, är lämplig syresättning, temperaturkontroll och substrattillförsel krävs. Positiva kontroller rekommenderas för att kontrollera tillståndet och mottaglighet av vävnaderna. För att göra detta, kan möss injiceras med insulin eller glukos och perfusion hjärtan kan vara elektriskt stimurade eller perfusion med isoproterenol. Ökade superoxid blinkar bör observeras efter dessa behandlingar (Figur 4) 19,20. Dessutom är de tidsförlopp bilder tas när rörelseartefakt undertrycks genom att hämma hjärtslag, som tillverkar under fysiologiska förhållanden på grund av minskad arbetsbelastning. Sålunda bör den perfunderade hjärtat försöket betraktas som ett nära härmande av situationen in vivo.
Slutligen var den teknik som utvecklats med hjälp av en Zeiss konfokal (LSM 510). Övriga konfokala systemet (t.ex. Nikon, Olympus och Leica) kan användas om systemet uppfyller följande krav: (1) har tidsförlopp ramen skanningsläge, (2) har en samplingshastighet på 1 sek / ram, och (3) kan nå enstaka mitokondrien upplösning (t.ex. 1 mm x 2 mikrometer). Mjukvaran i ett konfokalt system tillåter oftast enkla bildbehandling och analys, till exempel definiera ROI och fluorescensintensiteten utgång med tIME etiketter. Alternativt kan Bild J programvara användas för både bildanalys och blixt parameterberäkning.
Sammanfattningsvis är den avbildning av enstaka mitokondriella händelser såsom superoxid blinkar i skelettmuskulaturen in vivo eller in perfusion hjärta en unik metod för realtidsbestämning av mitokondriell funktion. Denna teknik är ett betydande framsteg under de traditionella in vitro-mätningar och kommer att ge en mer exakt bedömning av mitokondriell funktion och dess förhållande till cellulära processer / funktioner under verkliga fysiologiska förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr. Heping Cheng, Huiliang Zhang och Stephen Kolwicz för deras värdefulla kommentarer och teknisk support för att utveckla denna metod. Denna studie stöddes av NIH bidrag och Scientist utveckling Grant från American Heart Association till WW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Blebbistatin | Toronto Research Chemicals | B592500 | |
| CaCl2 | Acros Organics | AC34961-5000 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006-500 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1 | |
| MgCl2•6H2O | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | M1880-1 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282-500 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014-1 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25 | |
| TMRM | Invitrogen | T-668 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module. | |||
References
- Brookes, P. S., Yoon, Y., Robotham, J. L., Anders, M. W., Calcium Sheu, S. S. Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, 817-833 (2004).
- Scheffler, I. E. Mitochondria. , 2nd, J. Wiley and Sons, Inc. (2008).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondria in heart failure. Cardiovasc. Res. 88, 40-50 (2010).
- Griffiths, E. J. Mitochondria and heart disease. Adv. Exp. Med. Biol. 942, 249-267 (2012).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).
- Pieczenik, S. R., Neustadt, J. Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease. Exp. Mol. Pathol. 83, 84-92 (2007).
- Szentesi, P., Zaremba, R., van Mechelen, W., Stienen, G. J. M. ATP utilization for calcium uptake and force production in different types of human skeletal muscle fibres. J. Physiol. 531, 393-403 (2001).
- Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J. Bioenerg. Biomembr. 41, 99-106 (2009).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. J. Biol. Chem. 217, 409-427 (1955).
- Lambert, A. J., Brand, M. D. Reactive oxygen species production by mitochondria. Methods Mol Biol. 554, 165-181 (2009).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
- Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15038-15043 (2006).
- Dickinson, B. C., Srikun, D., Chang, C. J. Mitochondrial-targeted fluorescent probes for reactive oxygen species. Curr. Opin. Chem. Biol. 14, 50-56 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 13044-13053 (2004).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat. Methods. 3, 281-286 (2006).
- Wang, W., et al. Superoxide Flashes in Single Mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
- Wei-Lapierre, L., et al. Respective Contribution of Mitochondrial Superoxide and pH to Mitochondria-targeted Circularly Permuted Yellow Fluorescent Protein (mt-cpYFP) Flash Activity. J. Biol. Chem. 288, 10567-10577 (2013).
- Fang, H., et al. Imaging superoxide flash and metabolism-coupled mitochondrial permeability transition in living animals. Cell Res. 21, 1295-1304 (2011).
- Wei, L., et al. Mitochondrial superoxide flashes: metabolic biomarkers of skeletal muscle activity and disease. FASEB J. 25, 3068-3078 (2011).
- Sheu, S. S., Wang, W., Cheng, H., Dirksen, R. T. Superoxide flashes: illuminating new insights into cardiac ischemia/reperfusion injury. Future Cardiol. 4, 551-554 (2008).
- Wei, L., Dirksen, R. T. Perspectives on: SGP symposium on mitochondrial physiology and medicine: mitochondrial superoxide flashes: from discovery to new controversies. J. Gen. Physiol. 139, 425-434 (2012).
- Johnson, I., Spence, M. T. Z. Ch. 12.2. The Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , Life Technologies Corp. 510-511 (2013).
- Wang, X., et al. Superoxide flashes: elemental events of mitochondrial ROS signaling in the heart. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 940-948 (2012).
- Li, K., et al. Superoxide flashes reveal novel properties of mitochondrial reactive oxygen species excitability in cardiomyocytes. Biophys. J. 102, 1011-1021 (2012).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
- Pasdois, P., et al. Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers. Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).
- Granville, D. J., et al. Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1321-1326 (2004).
- Davidson, S. M., Yellon, D. M., Murphy, M. P., Duchen, M. R. Slow calcium waves and redox changes precede mitochondrial permeability transition pore opening in the intact heart during hypoxia and reoxygenation. Cardiovasc. Res. 93, 445-453 (2012).
