Summary
تصف المادة هنا طريقة تم تطويرها للحفاظ على بنية الكروماتين ثلاثية الأبعاد للخلايا الجرثومية الخصية. وقد أطلق على هذا الأسلوب الشريحة ثلاثية الأبعاد (3D). هذه الطريقة تحسن الحساسية للكشف عن الهياكل شبه النووية وتنطبق على الفلورة المناعية والحمض النووي وفلور الحمض النووي الريبي في التهجين الموقعي (FISH).
Abstract
أثناء تمايز الخلايا الجرثومية الخصية ، يتغير هيكل الكروماتين النووي بشكل ديناميكي. يصف التالي طريقة مصممة للحفاظ على ترتيب الكروماتين ثلاثي الأبعاد للخلايا الجرثومية الخصية الموجودة في الفئران؛ تم وصف هذا الأسلوب كطريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد). في هذه الطريقة ، يتم التعامل مباشرة مع أنابيب الخصية مع خطوة permeabilization أن يزيل المواد السيتوبلازمية ، تليها خطوة التثبيت الذي يصلح المواد النووية. ثم يتم فصل الأنابيب، وتعليق الخلية هو cytospun، والخلايا تلتزم الشرائح. هذه الطريقة تحسن الحساسية تجاه الكشف عن الهياكل دون النووية وتنطبق على الفلورة المناعية والحمض النووي وفلور الحمض النووي الريبي في التهجين الموقعي (FISH) والجمع بين طرق الكشف هذه. كمثال على تطبيق محتمل لأسلوب الشريحة ثلاثية الأبعاد، يظهر جهاز COT-1 RNA FISH للكشف عن الحمض النووي الريبي الوليد. تسهل طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد الفحص التفصيلي للعلاقات المكانية بين بنية الكروماتين والحمض النووي والحمض النووي الريبي أثناء تمايز الخلايا الجرثومية الخصية.
Introduction
في الخصية، الخلايا الجرثومية تفرق من الحيوانات المنوية ثنائية الفصيلة من خلال الميوس إلى ناضجة، الحيوانات المنوية haploid. خلال هذه العملية، يتم تشكيل هيكل الكروماتين النووي للخلايا الجرثومية بشكل مستمر وديناميكي. ينتشر السطح عادة ما تستخدم للفحص الخلوي للخلايا المنوية الفردية. وهناك طريقة سائدة من ينتشر السطح يستخدم العلاج hypotonic التي تنتشر الخلايا المنوية الفردية وسويت1. هذه الشروط هي الأمثل للتحليل التفصيلي للكروموسومات المريوتيكية. الميزات الكروموسومية مثل حالة متشابك و بؤر إعادة التركيب يمكن ملاحظتها بسهولة باستخدام هذه الطريقة. ومع ذلك ، فإن العلاج تحت الحجري يعطل بنية الكروماتين دون النووية ، وبالتالي فإن هذه التقنية ليست مناسبة للتحليل الهيكلي للنوى. وبالتالي، تم تصميم طريقة محسنة للحفاظ على بنية الكروماتين ثلاثية الأبعاد للخلايا الجرثومية الخصية. وقد وصفت هذه الطريقة بأنها طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد (3D)(الشكل 1). وقد مكنت طريقة الشريحة 3D الكشف عن توطين الحمض النووي الريبي الوليدة في النوى لأنه تم الأمثل في البداية لفحص التعبير الجيني وحالات الكروماتين خلال تمايز الخلايا الجرثومية الخصية من قبل RNA مضان في التهجين الموقعي (FISH)2,3. هذه الطريقة ثلاثية الأبعاد تنطبق أيضا على الجمع بين الفلورة المناعية والحمض النووي والأسماك الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، ساعدت هذه الطريقة في اكتشاف كروماتين الجنس بعد ميوتيك (PMSC) ، وهي مقصورة صامتة من الكروموسومات الجنسية الموجودة في الحيوانات المنوية بعد ميوتيك2.
تم تحسين طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد في الأصل من خلال الجمع بين خطوتين أساسيتين لإعداد الشرائح المستخدمة عادة للتلطيخ النووي: خطوة التثبيت المصممة لإصلاح المواد النووية وخطوة الثبات التي تهدف إلى إزالة المواد السيتوبلازمية من أجل تحسين إمكانية الوصول إلى الكواشف التلطيخية ، مثل الأجسام المضادة ومسابير FISH. كما سبق وصفه في منشور آخر 3 ، فقد تقرر أن خطوة permeabilization يجب أن تسبق خطوة التثبيت من أجلالحصولعلى أفضل النتائج مع خلفية السيتوبلازمية منخفضة. في طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد هذه ، يتم تنفيذ خطوة permeabilization وخطوة التثبيت اللاحقة مباشرة على الأنابيب شبهiferous ويتبعها الانفصال الميكانيكي للخلايا الجرثومية مع ملقط قبل السيتوسبينينغ على الشرائح. تم تطوير طريقة بديلة لأسماك الحمض النووي الريبي من الخلايا المنوية في مختبر آخر4. في هذا الأسلوب، بما يتفق مع الأسلوب 3D، يجب أن تسبق خطوة permeabilization خطوة التثبيت من أجل الحصول على أفضل النتائج من RNA FISH.
يصف البروتوكول التالي طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد ويقدم مثالا على تطبيق محتمل، Cot-1 RNA FISH للكشف عن الحمض النووي النووي الريبي الناشئ. يتكون الحمض النووي ل Cot-1 من عناصر متكررة في الجينوم. هنا، يتم تهجين مسبار الحمض النووي Cot-1 إلى intron و UTR من النصوص الوليدة، وبالتالي الكشف عن المناطق النشطة نسخيا في النواة5،6. الشرائح ثلاثية الأبعاد متعددة الاستخدامات ويمكن تطبيقها على مزيج من تقنيات immunofluorescence والحمض النووي وRNA FISH من أجل الحصول على فحص مفصل للعلاقات المكانية بين هندسة الكروماتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.3D إعداد الشرائح
- إعداد الكواشف التالية:
- CSK العازلة: 100 mM NaCl, 300 mM السكروز, 10 م م أنابيب, 3 م م م2. ضبط درجة الحموضة إلى 6.8 مع 1 M NaOH. تخزين المخزن المؤقت CSK عند 4 °C.
- CSK العازلة مع 0.5٪ تريتون X-100: إضافة 200 ميكرولتر من تريتون X-100 إلى 40 مل من المخزن المؤقت CSK. امزج المحلول باستخدام الستيرر المغناطيسي حتى يذوب تريتون X-100 تماما. تخزين المخزن المؤقت CSK مع 0.5٪ تريتون X-100 في 4 درجة مئوية.
- 4٪ بارافورمالديهايد (PFA)-PBS، درجة الحموضة 7.4: حل 4 غرام من PFA في ما يقرب من 70-80 مل من الماء. من أجل تسريع عملية الذوبان، إضافة ما يقرب من 20 ميكرولتر من 4 N NaOH والحفاظ على الحل في حمام مائي عند 60 درجة مئوية حتى يذوب PFA تماما والحل شفاف. تستغرق هذه العملية حوالي ساعة واحدة. بعد PFA قد حلت تماما، إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني 10x. ضبط حجم النهائي إلى 100 مل مع الماء وتهدئة الحل لدرجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). استخدم الحل الطازج لكل تجربة جديدة.
ملاحظة: الحصول على إذن مؤسسي لجميع الأعمال الحيوانية والالتزام بالمبادئ التوجيهية ذات الصلة لرعاية الحيوان.
- قتل الفئران الذكور. باستخدام ملقط ومقص، استئصال الخصية من الماوس. ضع testis في برنامج تلفزيوني (أو RPMI 1640). بعد إزالة الخصية، نفذ بسرعة الخطوات التالية 1.3-1.4 من أجل منع تدهور الحمض النووي الريبي.
- تمزق الخصية على طبق بيتري صغيرة وإزالة albuginea تونيكا. كشف الأنابيب شبهiferous في برنامج تلفزيوني على الجليد باستخدام ملقط.
- باستخدام ملقط، نقل العديد من الأنابيب (عدة قطع من الأنابيب حوالي 5-10 ملم في الطول) في بئر واحد من طبق 4-جيدا تحتوي على 500 مل من العازلة CSK + 0.5٪ تريتون X-100 على الجليد، واحتضان لمدة 6 دقائق. التعرض المفرط ل CSK العازلة قد يؤدي إلى تعطيل الخلايا.
- باستخدام ملقط، نقل جميع الأنابيب إلى بئر واحد من طبق 4-جيدا تحتوي على 4٪ PFA-PBS الحل. يمكن أن تكون هذه الخطوة مسبقا دون مجسم، ولكن اختياريا يمكن استخدامه. حضانة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نفس الوقت بدء إعداد 12 حجرة السيتوسبين خلال فترات الحضانة.
- باستخدام ملقط، نقل جميع الأنابيب إلى بئر واحد من طبق 4-جيدا التي تحتوي على برنامج تلفزيوني. حضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- على الجانب الخلفي من شريحة زجاجية، نقل جميع الأنابيب إلى 30 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني (ينبغي تجنب الجزء العلوي من الشريحة بسبب تهمة cationic). باستخدام نصائح من اثنين من ملقط، المسيل للدموع الأنابيب إلى قطع. ختم الأنابيب في اتجاه أفقي عن طريق قص الأنابيب بين نصائح من اثنين من ملقط وسحب ملقط أفقيا. تابع هذه الخطوة لمدة 10-20 ثانية تقريبا.
- خلط تعليق عن طريق ماصة باستخدام ماصة P20.
- نقل التعليق إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق، تمييع مع برنامج تلفزيوني إلى ما يقرب من 1.3 مل. تطبيق 100 ميكرولتر من التعليق على كل من 12 حجرة سيتوسبين (1.2 مل المجموع). في هذه الخطوة، لا يحتاج تركيز الخلايا إلى تحديد.
- Cytospin العينات في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد السيتوسبينينغ، الشرائح الجافة على مقاعد البدلاء المختبر لبضع دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد السماح للشرائح بالجفاف تماما لبضع دقائق ، انتقل إلى الخطوة التالية.
- باستخدام جرة كوبلين التي تحتوي على برنامج تلفزيوني، وغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- نقل الشرائح إلى جرة كوبلين التي تحتوي على 70٪ الإيثانول والانتظار على الأقل 2 دقيقة قبل بدء RNA FISH. الشرائح مستقرة لبضعة أسابيع في الإيثانول 70٪ في 4 درجة مئوية. للتخزين على المدى الطويل، والشرائح المجففة باستخدام العلاج التسلسلي مع الإيثانول 80٪ و 100٪ في الجرار كوبلين لمدة 2 دقيقة لكل منهما والهواء الجاف يجفف تماما الشرائح. تخزين في -80 درجة مئوية في مربع الشريحة.
2. إعداد مجس الحمض النووي Cot-1 بواسطة فتيلة عشوائية
- إعداد الكواشف التالية:
- المخزن المؤقت للتهجين: امزج مكونات الإجراءات لإعداد 900 مل من مخزون المخزن المؤقت للتهجين؛ سيتم استخدام هذا الحل لتخزين المسابير. يسمح هذا المخزون العازلة التهجين لإضافة حجم 10٪ من محلول مثبطات RNase (ريبونوكليوسيد فاناديل المعقدة) قبل التهجين.
قبل التهجين، إضافة 1/10 فول من 200 mM ريبونوكليوسيد فاناديل مجمع أو الماء إلى المخزون العازلة التهجين لتتناسب مع التركيز النهائي. عند -20 درجة مئوية، هذا الخليط مستقر لأكثر من عام.مكون المبلغ (ميكرولتر) التركيز النهائي فورماميد 500 50٪ (v/v) 50٪ ديكتران 200 10٪ (ث/v) 20x SSC 100 2x 1٪ بكالوريوس 100 0.1% - 20x SSC: حل 88.2 غرام من سترات الصوديوم و 175.3 غرام من NaCl في حوالي 800 مل من الماء. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 باستخدام بضع قطرات من 1 M HCl. إضافة الماء لضبط حجم النهائي إلى 1 L. تعقيم عن طريق الالاستعباد التلقائي. بعد التحضير، يمكن تخزين 20x SSC في درجة حرارة الغرفة.
- 50٪ (ث/v) ديكتران: يحرك الماء ويضيف ببطء 50 غرام من كبريتات ديكتران. استمر في التحريك طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. أضف الماء لضبط الحجم النهائي إلى 100 مل. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
- المخزن المؤقت للتهجين: امزج مكونات الإجراءات لإعداد 900 مل من مخزون المخزن المؤقت للتهجين؛ سيتم استخدام هذا الحل لتخزين المسابير. يسمح هذا المخزون العازلة التهجين لإضافة حجم 10٪ من محلول مثبطات RNase (ريبونوكليوسيد فاناديل المعقدة) قبل التهجين.
- أضف المكونات التالية المذكورة أدناه إلى أنبوب PCR. باستخدام جهاز PCR، قم بمزج المحلول واحتضانه لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية.
مكون الكمية لكل تفاعل (ميكرولتر) نهائي كوت-1 DNA: 1 ملغم/مل 1 1 ميكروغرام التمهيدي عشوائي 9mer (من عدة) 10 الماء 27 - الطرد المركزي لفترة وجيزة ومكان على الجليد.
- إضافة المكونات التالية. مزيج واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية باستخدام جهاز PCR. (للحصول على تفاصيل عن مجموعة تستخدم انظر الجدول من الكواشف والمعدات).
مكون الكمية لكل تفاعل (ميكرولتر) التركيز النهائي خليط معد من الخطوة 2.2 38 5x النيوكليوتيدات العازلة (من عدة) 9.2 Cy3-dUTP (1 متر) 0.8 16 ميكرومتر كلينو (من عدة) 2 - إضافة 2 ميكرولتر من العازلة وقف (من عدة) لوقف رد الفعل.
- تنقية رد الفعل توقف باستخدام أعمدة microspin.
- أضف 50 ميكروغرام (5 ميكرولتر) من الحمض النووي للحيوانات المنوية الرنجة (50 ضعف فائض القالب Cot-1 DNA) إلى الكسر المنقى.
- قياس إجمالي حجم الصوت باستخدام ماصة. أضف 0.7x حجم الإيثانول 100٪ وحجم 0.1x من خلات الصوديوم 3 M (درجة الحموضة 5.2)، مزيج جيدا، والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة بأقصى سرعة (17،000 × غرام) باستخدام جهاز طرد مركزي صغير في 4 درجة مئوية.
- إزالة السائل، وإضافة 200 ميكروغرام من الإيثانول 70٪، مزيج جيدا والطرد المركزي لمدة 5 دقائق بأقصى سرعة في 4 درجة مئوية.
- إزالة السائل الزائد. جفف الترسب لمدة 10-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- حل بيليه في 20 ميكرولتر من المخزون العازلة التهجين. لأن بيليه غالبا ما يكون من الصعب حل، ماصة مرارا وتكرارا. كخيار بديل، يمكن أيضا استخدام خلاط دوامة لإذابة بيليه بكفاءة. يمكن الاحتفاظ المسابير في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
3. كوت-1 RNA الأسماك
- إضافة المكونات المذكورة أدناه إلى أنبوب PCR. باستخدام جهاز PCR، احتضان لمدة 10 دقيقة في 80 درجة مئوية، تليها خطوة ما قبل التنافر من حوالي 10-30 دقيقة في 42 درجة مئوية. ابق عند 42 درجة مئوية حتى التهجين. ريبونوكليوسيد فاناديل مجمع اختياري; يمكن استبداله بالماء.
مكون الكمية لكل تفاعل (ميكرولتر) نهائي مجس الحمض النووي Cot-1 (50 نانوغرام/ميكرولتر) 2 100 نانوغرام مجمع فاناديل ريبونوكليوسيد (200 متر) 2 20 مليون متر المخزن المؤقت للتهجين أضيف إلى 20 - الشرائح المجففة في جرة كوبلين التي تحتوي على 80٪ الإيثانول لمدة 2 دقيقة، تليها جرة كوبلين تحتوي على الإيثانول 100٪ لمدة 2 دقيقة. الشرائح الجافة تماما على مقاعد البدلاء مختبر في درجة حرارة الغرفة.
- سخني غرفة صندوق البقشيش (مليئة ب 2-3 سم من الماء) في حاضنة 42 درجة مئوية مقدما. ضع الشريحة على غرفة صندوق البقشيش. طرد مركزي لفترة وجيزة المسابير preannealed وماصة مباشرة على الشرائح المجففة. تجنب صنع الفقاعات. قم بتغطية الشريحة برفق بقسيمة غطاء.
- تهجين لمدة 6 ساعات إلى ليلة واحدة (14-15 ساعة) في 42 درجة مئوية.
- إعداد حلول الغسيل في الجرار كوبلين (اثنين من الجرار مع كل من 2X SSC و 50٪ formamide، وجرارتين مع 2x SSC). سخني على حرارة 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام مائي.
- استخدم شفرة حلاقة لإزالة الغطاء من حافة الشريحة. تجنب خدش العينات. اغسل الشرائح في جرة كوبلين التي تحتوي على 2x SSC و 50٪ formamide لمدة 5 دقائق عند 45 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
- اغسل الشرائح في جرة كوبلين التي تحتوي على 2x SSC لمدة 5 دقائق عند 45 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
- أضف 20 ميكرولتر من وسائط DAPI المتصاعدة إلى الشرائح، ثم قم بتغطيتها بقسيمة غطاء. اضغط بلطف على زجاج الغطاء لإزالة وسائط التركيب الإضافية. لطخة وسائل الإعلام تصاعد اضافية مع تنظيف الأنسجة. الشرائح جاهزة لتقييم المجهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تظهر نتيجة تمثيلية لشريحة ثلاثية الأبعاد في الشكل 2. في هذه التجربة، تم إجراء Cot-1 RNA FISH للكشف عن النسخ الوليد جنبا إلى جنب مع التلطخ المناعي باستخدام الأجسام المضادة CBX1 و γH2AX. للجمع بين RNA FISH و المناعة ، تم إجراء التلطخ المناعي أولا ، يليه RNA FISH كما هو موضح في3. CBX1 هو بروتين هيتيركروماتين الذي يحط من الهتيروماتين المحيطي والكروموسومات الجنسية الصامتة في الميوس يسمى جسم XY (أو الجسم الجنسي). γH2AX هو شكل فوسفوري من متغير الهستون H2AX ويوضع على الجسم XY. في هذه الصورة، تتراكم إشارات Cot-1 على المناطق euchromatic، ولكن يتم استبعادها من الهتيروماتين المحيطي بالزمرة وجسم XY.
أثناء إعداد انتشار السطح ، يتضخم العلاج بمحلول هيبوتونيك النوى ويمتد جسديا الهياكل شبه النووية. هذه الطريقة السائدة لدراسة meiotic هي الأنسب لالتقاط جميع الكروموسومات meiotic في طائرة واحدةz-1. لتوضيح الفرق بين طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد وينتشر السطح بعد العلاج تحت التوتر ، يتم عرض صور تمثيلية لخلايا الحيوانات المنوية pachytene لكل تجربة باستخدام نفس التكبير باستخدام المجهر الظهاري(الشكلان 2A و 2B). في انتشار السطح المعالج بمحلول هيبوتونيك ، يتم تعطيل بنية الكروماتين ثلاثية الأبعاد ويمكن التقاط جميع محاور الكروموسوم المريوتيكي داخل طائرة z واحدة. إعداد الشرائح ثلاثية الأبعاد، ومع ذلك، يحافظ على هيكل الكروماتين سليمة.
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 التخطيطي لأسلوب الشريحة ثلاثية الأبعاد. يمكن لطريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد الحفاظ على بنية الكروماتين ثلاثية الأبعاد. ونظرا للطبيعة ثلاثية الأبعاد للشريحة، يلزم الحصول على البيانات مع عدة أقسام z لتغطية النواة.
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم المقارنة بين طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد وينتشر السطح بعد المعالجة تحت التوتر في نفس التكبير. (أ)باستخدام الشريحة ثلاثية الأبعاد، يتم تنفيذ Cot-1 RNA FISH (cy3) واحتواء المناعة مع الأجسام المضادة CBX1 (fitc) و γH2AX (cy5). يظهر الحيوانات المنوية pachytene مع مقطع z واحد. (ب) باستخدام ينتشر السطح، يتم تنفيذ الأجسام المضادة المناعية مع SCP3 المضادة و γH2AX. يظهر الحيوانات المنوية pachytene. الدوائر: XY الجسم. القضبان: 10 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في إعداد الشرائح ثلاثية الأبعاد، تسبق خطوة permeabilization خطوة التثبيت. يتم تنفيذ هذه الخطوات مباشرة على الأنابيب شبهiferous، وبالتالي الحفاظ على بنية الكروماتين ثلاثي الأبعاد. خيار بديل للحفاظ على بنية الكروماتين لسمك الحمض النووي الريبي / الحمض النووي هو تنفيذ خطوة permeabilization وخطوة التثبيت في وقت واحد. وقد أجريت هذه التقنية البديلة في الخلايا الجرثومية المريخية وفي أجنة ما قبل زرع الماوس7,8. ومع ذلك، إذا كانت خطوة التثبيت تسبق خطوة permeabilization، فإنه قد يؤدي إلى خلفية السيتوبلازمية عالية. لذلك ، يعتمد المحدد الحاسم لتحسين الشرائح ل RNA و DNA FISH على ترتيب permeabilization وخطوات التثبيت. مدة خطوة permeabilization هو أيضا عامل مهم لتحسين إعداد الشرائح. ست دقائق هو الشرط العام لهذه الطريقة. ومع ذلك، يمكن تعديلها اعتمادا على اختلاف المواد المستخدمة.
الحفاظ على بنية الكروماتين ثلاثية الأبعاد هو سمة من سمات الشريحة ثلاثية الأبعاد التي تفصلها بوضوح عن شرائح الانتشار السطحي. هذه الميزة تختلف اختلافا كبيرا عن تلك التي من إعداد انتشار الكروموسوم. تحافظ طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد على بنية الكروماتين ثلاثية الأبعاد ، ولكنها تتطلب الحصول على البيانات مع أقسام z متعددة لتشمل نواة كاملة. لا يمكن للمقطع z واحد التقاط كافة الإشارات من نواة. وبالتالي، فإن ضرورة عدة أقسام z هي قيد رئيسي على هذه الطريقة. لالتقاط نواة في مقطع z واحد، ينتشر السطح لها ميزة. لذلك ، فإن الطريقة ثلاثية الأبعاد وإعداد انتشار السطح لها مزايا متميزة وتعوض بشكل متبادل ميزات بعضها البعض لدراسة الميزوس وتولد الحيوانات المنوية.
يمكن تطبيق طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد على جميع أنواع الخلايا الموجودة داخل الخصيتين، بما في ذلك الحيوانات المنوية، والحيوانات المنوية المستديرة، وخلايا سيرتولي. وقد تم تطبيق هذه الطريقة أيضا لفحص ضغط الكروماتين الكروموسومات الجنس في بداية تعطيل كروموسوم الجنس المريوتيكي، ودراسة التعديلات اللاجينية على PMSC10. من حيث التطبيقات المستقبلية، يمكن تطبيق هذه الطريقة على الأنسجة أو الخلايا الأخرى. إذا كان الأمر كذلك، فمن المستحسن أن تسبق خطوة permeabilization خطوة التثبيت. بدلا من ذلك، يمكن تنفيذ خطوة permeabilization وخطوة التثبيت في وقت واحد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحب البلاغ ما يكشف عنه.
Acknowledgments
أشكر جيني ت. لي على الإشراف على هذا المشروع عندما كنت في مختبر لي وتايلر برويرينغ لتحرير المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل جائزة الباحث باسل أوكونور كاتب من مسيرة مؤسسة الدايمات ومنحة المعاهد القومية للصحة GM098605.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | |
| Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit | Agilent | 300380 | |
| Herring sperm DNA Solution | Invitrogen | 15634-017 | |
| Ethanol. 200 proof (absolute) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Formamide deionized | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Lifeblood Medical | 77110-100 | |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D6001 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | A10491-01 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 76240 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | |
| Illustra MicroSpin G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Forceps | VWR | 300-050 | |
| Microcentrifuge tubes | Bioexpress | C-3262-1 | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| Coplin Jar | Fisher | 08-815 | |
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| 4-well dish | Fisher | 12-566-301 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Air incubator | Revolutionary Science | RS-IF-203 |
References
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Namekawa, S. H., et al. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr Biol. 16, 660-667 (2006).
- Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
- Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis. Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).
- Hall, L. L., et al. An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).
- Huynh, K. D., Lee, J. T. Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos. Nature. 426, 857-862 (2003).
- Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).
- Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse. Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).
- Ichijima, Y., et al. MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells. Genes Dev. 25, 959-971 (2011).
- Sin, H. S., et al. RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids. Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).
