Summary
החומר כאן מתאר שיטה שפותחה כדי לשמר את מבנה הכרומטין התלת מימדי של תאי נבט האשכים. שיטה זו נקראה שיטת השקופית התלת-ממדית (תלת-ממדית). שיטה זו משפרת את הרגישות לגילוי מבנים תת-גרעיניים והיא ישימה עבור פלואורסצנטיות חיסונית, דנ"א ופלואורסצנטיות RNA בהכלאה במקום (FISH).
Abstract
במהלך התמיינות תאי נבט האשכים, המבנה של כרומטין גרעיני משתנה באופן דינמי. להלן שיטה שנועדה לשמר את סידור הכרומטין התלת מימדי של תאי נבט האשכים המצויים בעכברים; שיטה זו נקראה שיטת השקופית התלת-ממדית (תלת-ממדית). בשיטה זו, צינוריות האשכים מטופלים ישירות עם שלב חדירה שמסיר חומר ציטופלסמי, ואחריו שלב קיבעון שמתקן חומרים גרעיניים. לאחר מכן, הצינוריות מנותקות, השעיית התא היא ציטוספון, והתאים נצמדים לשקופיות. שיטה זו משפרת את הרגישות לגילוי מבנים תת-גרעיניים והיא ישימה עבור פלואורסצנטיות חיסונית, דנ"א ו- RNA בהכלאה במקום (FISH) והשילוב של שיטות זיהוי אלה. כדוגמה ליישום אפשרי של שיטת השקופית 3D, דג RNA Cot-1 מוצג כדי לזהות RNAs המתהווה. שיטת שקופית 3D תאפשר בדיקה מפורטת של יחסים מרחביים בין מבנה כרומטין, DNA, ו RNA במהלך התמיינות תא נבט האשכים.
Introduction
באשכים, תאי נבט להבדיל זרע דיפלואידית דרך מיוזיס לתוך בוגר, זרע haploid. במהלך תהליך זה, מבנה הכרומטין הגרעיני של תאי נבט הוא שיפץ באופן רציף ודינמי. ממרחי פני השטח משמשים בדרך כלל לבדיקה ציטולוגית של תאי זרע בודדים. שיטה רווחת של התפשטות פני השטח מעסיקה טיפול היפוטוני שבאמצעותו תאים זרע בודדים מופצים ומשוטחים1. תנאים אלה הם אופטימליים לניתוח מפורט של כרומוזומים מיוטיים. תכונות כרומוזומליות כגון מצב סינפטי ומוקדי רקומביניזציה נצפו בקלות בשיטה זו. עם זאת, הטיפול ההיפוטוני משבש את ארכיטקטורת הכרומטין התת-גרעיני, ולכן טכניקה זו אינה מתאימה לניתוח מבני של גרעינים. כתוצאה מכך, שיטה משופרת תוכננה כדי לשמר את מבנה הכרומטין התלת מימדי של תאי נבט האשכים. שיטה זו נקראה שיטת השקופית התלת-ממדית (3D) (איור 1). שיטת שקופית 3D אפשרה זיהוי של לוקליזציה RNA המתהווה בגרעינים כי זה היה אופטימיזציה בתחילה כדי לבחון ביטוי גנים מצבי כרומטין במהלך התמיינות תא נבט האשכים על ידי פלואורסצנטיות RNA בהכלאה situ (FISH)2,3. שיטה תלת-ממדית זו חלה גם על השילוב של כשל חיסוני, דנ"א ודגי RNA. בנוסף, שיטה זו סייעה בגילוי כרומטין מין פוסט-מיוטי (PMSC), תא שקט של כרומוזומי המין שנמצאו בזרעונים פוסט-מיוטיים2.
שיטת השקופית בתלת-ממד עברה אופטימיזציה במקור באמצעות שילוב של שני שלבים חיוניים של הכנת שקופיות המשמשים בדרך כלל לכתמים גרעיניים: שלב הקיבעון שנועד לתקן חומרים גרעיניים וצעד ההחלחלה שנועד להסיר חומרים ציטופלסמיים על מנת לשפר את הנגישות של ריאגנטים מכתימים, כגון נוגדנים ובדיקות FISH. כפי שתואר קודם לכן בפרסום אחר3, נקבע כי שלב permeabilization חייב להקדים את שלב הקיבעון על מנת להשיג תוצאות אופטימליות עם רקע ציטופלסמי נמוך. בשיטת שקופית תלת-ממדית זו, שלב ההחלחלה ושלב הקיבעון הבאים מבוצעים ישירות על צינוריות חצי-שנתיות ואחריהן הניתוק המכני של תאי נבט עם מלקחיים לפני ציטוספין על שקופיות. שיטה חלופית עבור דג RNA של תאים spermatogenic פותחה במעבדה אחרת4. בשיטה זו, בהתאם לשיטת 3D, שלב permeabilization חייב להקדים את שלב הקיבעון על מנת להשיג תוצאות אופטימליות של RNA FISH.
הפרוטוקול הבא מתאר את שיטת השקופית תלת-ממדית ומספק דוגמה ליישום אפשרי, Cot-1 RNA FISH לגילוי RNAs גרעיניים. דנ"א קוט-1 מורכב מאלמנטים שחוזרים על עצמו בגנום. כאן, גשוש DNA קוט-1 הוא היברידית אינטרון ו UTR של התמלילים המתהווים, ובכך לזהות את האזורים הפעילים שעתוק בגרעין5,6. שקופיות תלת מימד הן רב-תכליתיות וניתן ליישם אותן על שילוב של טכניקות כשל חיסוני, DNA ו- RNA FISH על מנת לקבל בדיקה מפורטת של יחסים מרחביים בין ארכיטקטורת הכרומטין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.3D הכנת שקופיות
- הכן את ריאגנטים הבאים:
- מאגר CSK: 100 mM NaCl, 300 מ"מ סוכרוז, 10 mM צינורות, 3 mM MgCl2. כוונן את ה-pH ל-6.8 עם 1 M NaOH. אחסן את מאגר CSK ב- 4 °C (69 °F).
- מאגר CSK עם 0.5% טריטון X-100: להוסיף 200 מיקרוליטר של טריטון X-100 כדי 40 מ"ל של מאגר CSK. מערבבים את הפתרון באמצעות stirrer מגנטי עד טריטון X-100 מומס לחלוטין. אחסן את מאגר CSK עם 0.5% טריטון X-100 ב 4 °C (69 °F).
- 4% Paraformaldehyde (PFA)–PBS, pH 7.4: להמיס 4 גרם של PFA בכ 70-80 מ"ל של מים. על מנת לזרז את תהליך המסה, להוסיף כ 20 μl של 4 N NaOH ולשמור את הפתרון באמבט מים ב 60 מעלות צלזיוס עד PFA התמוסס לחלוטין ואת הפתרון הוא שקוף. תהליך זה אורך כשעה. לאחר PFA התמוסס לחלוטין, להוסיף 10 מ"ל של 10x PBS. כוונן את הנפח הסופי ל-100 מ"ל במים וצנן את הפתרון לטמפרטורת החדר (25°C). השתמש בפתרון מוכן טרי עבור כל ניסוי חדש.
הערה: קבל אישור מוסדי לכל עבודה בבעלי חיים ופעל בהתאם להנחיות הרלוונטיות לטיפול בבעלי חיים.
- המתת חסד לעכברים זכרים. באמצעות מלקחיים ומספריים, בלו את האשכים מן העכבר. הנח את האשכים ב- PBS (או RPMI 1640). לאחר הסרת האשכים, בצע במהירות את השלבים הבאים 1.3-1.4 על מנת למנוע השפלה של RNA.
- קרע את האשכים על צלחת פטרי קטנה ולהסיר את אלבוגניאה טוניקה. לפענח את הצינוריות חצי-חופן ב- PBS על קרח באמצעות מלקחיים.
- באמצעות מלקחיים, להעביר כמה tubules (כמה חתיכות של tubules כ 5-10 מ"מ אורך) לתוך באר אחת של צלחת 4-באר המכיל 500 מ"ל של חיץ CSK + 0.5% טריטון X-100 על קרח, ואת הדגירה במשך 6 דקות. חשיפת יתר למאגר CSK עלולה לגרום להפרעה לתאים.
- בעזרת מלקחיים, מעבירים את כל הצינוריות לבאר אחת של צלחת של 4 בארות המכילה 4% פתרון PFA-PBS. שלב זה יכול להיות מעוצב מראש ללא סטריאומיקרוסקופ, אך באופן אופציונלי ניתן להשתמש בו. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. במקביל להתחיל להכין 12 תאי ציטוספין במהלך תקופות הדגירה.
- בעזרת מלקחיים, מעבירים את כל הצינוריות לבאר אחת של צלחת של 4 בארות המכילה PBS. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- בחלק האחורי של מגלשת זכוכית, להעביר את כל tubules לתוך 30 μl של PBS (החלק העליון של השקופית יש להימנע עקב תשלום קטיוני). בעזרת קצות שתי מלקחיים, קורעים את הצינוריות לחתיכות. קוצצים את הצינוריות בכיוון אופקי על ידי גזירת צינוריות בין קצות של שני מלקחיים ומושך את המלקחיים אופקית. המשך בשלב זה במשך כ- 10-20 שניות.
- מערבבים את ההשעיה על ידי pipetting באמצעות פיפטה P20.
- מעבירים את ההשעיה לצינור מיקרוצנטריפוגה, מדללים עם PBS ל-1.3 מ"ל בקירוב. החל 100 μl של השעיה על כל אחד 12 תאי ציטוספין (1.2 מיליליטר בסך הכל). בשלב זה, אין צורך לקבוע את ריכוז התאים.
- ציטוספין הדגימות ב 2,000 סל"ד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ציטוספין, יבש שקופיות על ספסל המעבדה במשך כמה דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ששקופיות הורשו להתייבש לחלוטין למשך מספר דקות, עבור לשלב הבא.
- באמצעות צנצנת קופלין המכילה PBS, לשטוף את השקופיות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- מעבירים שקופיות לצנצנת קופלין המכילה 70% אתנול ומחכים לפחות 2 דקות לפני תחילת RNA FISH. שקופיות יציבות במשך כמה שבועות ב 70% אתנול ב 4 מעלות צלזיוס. לאחסון ארוך טווח, לייבש שקופיות באמצעות טיפול סדרתי עם 80% ו 100% אתנול בצנצנות Coplin במשך 2 דקות כל אחד אוויר יבש לחלוטין לייבש את המגלשות. יש לאחסן ב-80°C בתיבת שקופיות.
2. הכנת בדיקת DNA ע"ש קוט-1 על ידי פרימיום אקראי
- הכן את ריאגנטים הבאים:
- מאגר הכלאה: מערבבים את הרכיבים המתקדמת כדי להכין 900 מ"ל של מלאי מאגר הכלאה; פתרון זה ישמש לבדיקות מלאי. מלאי חיץ הכלאה זה מאפשר תוספת של 10% נפח של פתרון מעכבי RNase (ריבונוקלוזיד ונדיל קומפלקס) לפני הכלאה.
לפני הכלאה, להוסיף 1/10 vol של 200 מ"מ ריבונוקלוזיד Vanadyl קומפלקס או מים למלאי חיץ הכלאה כדי להתאים את הריכוז הסופי. ב -20 מעלות צלזיוס, תערובת זו יציבה במשך יותר משנה.רכיב סכום (μl) ריכוז סופי פורמפיד (פירושונים) 500 50% (v/v) 50% דקסטרן 200 10% (עם/v) 20x SSC 100 פי 2 1% BSA 100 0.1% - 20x SSC: להמיס 88.2 גרם של נתרן ציטראט ו 175.3 גרם של NaCl בכ 800 מ"ל של מים. כוונן את ה- pH ל- 7.0 באמצעות כמה טיפות של 1 M HCl. הוסף מים כדי להתאים את עוצמת הקול הסופית ל- 1 L. Sterilize על-ידי שיקום אוטומטי. לאחר ההכנה, ניתן לאחסן 20x SSC בטמפרטורת החדר.
- 50% (w / v) דקסטרן: מערבבים מים ולאט לאט מוסיפים 50 גרם של דקסטרן סולפט. המשיכו לבחוש לילה בטמפרטורת החדר. מוסיפים מים כדי להתאים את הנפח הסופי ל-100 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
- מאגר הכלאה: מערבבים את הרכיבים המתקדמת כדי להכין 900 מ"ל של מלאי מאגר הכלאה; פתרון זה ישמש לבדיקות מלאי. מלאי חיץ הכלאה זה מאפשר תוספת של 10% נפח של פתרון מעכבי RNase (ריבונוקלוזיד ונדיל קומפלקס) לפני הכלאה.
- הוסף את המרכיבים הבאים המפורטים להלן לצינור PCR. באמצעות מכונת PCR, לערבב ולהדגיר את הפתרון במשך 5 דקות ב 95 °C (69 °F).
רכיב סכום לתגובה (μl) הסופי קוט-1 דנ"א: 1 מ"ג/מ"ל 1 1 מיקרוגרם פריימר 9מר אקראי (מתוך ערכה) 10 מים 27 - צנטריפוגה בקצרה ומניחים על קרח.
- הוסף את הרכיבים הבאים. מערבבים ומדגרים במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמצעות מכונת PCR. (לפרטים על הערכה המשמשת ראו טבלת ריאגנטים וציוד).
רכיב סכום לתגובה (μl) ריכוז סופי תערובת מוכנה משלב 2.2 38 מאגר נוקלאוטידים 5x (מערכת) 9.2 Cy3-dUTP (1 מ"מ) 0.8 16 מיקרומטר קלנאו (מערכה) 2 - הוסף 2 μl של חוצץ עצירה (מתוך ערכה) כדי להפסיק את התגובה.
- לטהר את התגובה שנעצרה באמצעות עמודות microspin.
- הוסף 50 מיקרוגרם (5 μl) של DNA זרע הרינג (50 קיפול עודף של תבנית Cot-1 DNA) לשבר המטוהר.
- מדוד את הנפח הכולל באמצעות פיפטה. הוסף נפח 0.7x של 100% אתנול ונפח 0.1x של 3 M נתרן אצטט (pH 5.2), לערבב היטב, וצנטריפוגה במשך 15 דקות במהירות המרבית (17,000 x g) באמצעות microcentrifuge ב 4 °C (69 °F).
- הסר את הנוזל, ולהוסיף 200 μl של 70% אתנול, לערבב היטב צנטריפוגה במשך 5 דקות במהירות מקסימלית ב 4 מעלות צלזיוס.
- הסר את הנוזל העודף. יבש את המשקעים במשך 10 - 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- להמיס את גלולה ב 20 μl של מלאי חיץ הכלאה. בגלל גלולה לעתים קרובות קשה להתמוסס, פיפטה שוב ושוב. כאפשרות חלופית, מערבל מערבולת יכול לשמש גם כדי להמיס ביעילות את גלולה. ניתן לשמור את הבדיקות ב-20°C עד לשימוש.
3. קוט-1 RNA פיש
- הוסף את הרכיבים המפורטים להלן לצינור PCR. באמצעות מכונת PCR, דגירה במשך 10 דקות ב 80 °C (60 °F), ואחריו צעד preannealing של כ 10-30 דקות ב 42 °C (69 °F). יש לשמור על 42°C עד להכלאה. מתחם ונדיל ריבונוקלוזיד הוא אופציונלי; זה יכול להיות מוחלף במים.
רכיב סכום לתגובה (μl) הסופי בדיקת DNA של מעריסה 1 (50 ng/μl) 2 100 ng מתחם ריבונוקלאוסייד ונדיל (200 מ"ר) 2 20 מ"מ מאגר הכלאה נוסף ל- 20 - לייבש שקופיות בצנצנת Coplin המכיל 80% אתנול במשך 2 דקות, ואחריו צנצנת Coplin המכיל 100% אתנול במשך 2 דקות. יבש שקופיות לחלוטין על ספסל המעבדה בטמפרטורת החדר.
- מחממים מראש תא תיבת קצה (מלא 2-3 ס"מ של מים) באינקובטור 42 מעלות צלזיוס מראש. מקם את השקופית בתא תיבת הקצה. בקצרה צנטריפוגה בדיקות preannealed ופיפט ישירות על שקופיות מיובשות. הימנע מהפיכת בועות. כסו בעדינות את השקופית בתעודת כיסוי.
- להכלאה למשך 6 שעות עד לילה (14-15 שעות) ב-42 מעלות צלזיוס.
- הכינו פתרונות שטיפה בצנצנות קופלין (שתי צנצנות עם 2x SSC ו-50% פורממיד, ושתי צנצנות עם 2x SSC). מחממים ב 42 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות באמבט מים.
- השתמש בסכין גילוח כדי להסיר את החלקת המכסה מקצה השקופית. הימנע מגרד דגימות. לשטוף שקופיות בצנצנת Coplin המכיל 2x SSC ו 50% formamide במשך 5 דקות ב 45 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה פעם אחת.
- לשטוף שקופיות בצנצנת Coplin המכיל 2x SSC במשך 5 דקות ב 45 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה פעם אחת.
- הוסף 20 μl של מדיה להרכבה על-ידי DAPI לשקופיות, וכסה באמצעות שובר כיסוי. לחץ בעדינות על זכוכית כיסוי כדי להסיר מדיית הרכבה נוספת. כתם מדיה הרכבה נוספת עם רקמת ניקוי. השקופיות מוכנות להערכת מיקרוסקופיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאה מייצגת של שקופית תלת-ממדית מוצגת באיור 2. בניסוי זה, Cot-1 RNA FISH בוצע כדי לזהות שעתוק המתהווה יחד עם immunostaining באמצעות נוגדנים נגד CBX1 ו γH2AX. כדי לשלב RNA FISH ו immunostaining, immunostaining בוצע ראשון, ואחריו RNA FISH כמתואר ב3. CBX1 הוא חלבון הטרוכרומטין הממוקם בהטרוכרומטין פריקנטרומרי וכרומוזומי מין שקטים במיאוזה הנקראת גוף XY (או גוף מין). γH2AX היא צורה זרחנית של גרסה היסטון H2AX ו לוקליזציה על גוף XY. בתמונה זו, אותות קוט-1 מצטברים באזורים אוכרומטיים, אך אינם נכללים בהטרוכרומטין הצמיג וגוף ה- XY.
במהלך הכנת התפשטות פני השטח, הטיפול בתמיסה היפוטונית מתנפח גרעינים ומרחיב פיזית מבנים תת-גרעיניים. שיטה רווחת זו למחקר מיוטי מתאימה ביותר ללכידת כל הכרומוזומים המיטיים במישור z יחיד1. כדי להבהיר את ההבדל בין שיטת שקופית 3D לבין משטח מתפשט לאחר טיפול hypotonic, תמונות מייצגות של זרע pachytene של כל ניסוי מוצגים באמצעות הגדלה זהה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent (איורים 2A ו 2B). בכפועות פני השטח המטופלות בתמיסה היפוטונית, מבנה הכרומטין התלת מימדי משובש וכל צירי הכרומוזום המיוטיים ניתנים ללכידה בתוך מישור z יחיד. הכנת שקופיות תלת-ממדיות, לעומת זאת, משמרת את מבנה הכרומטין שלם.
איור 1. סכמטי של שיטת שקופית תלת-ממדית. שיטת השקופית התלת-ממדית יכולה לשמר את מבנה הכרומטין התלת-ממדי. בשל האופי התלת מימדי של השקופית, רכישת נתונים עם מקטע z מרובים נדרשת כדי לכסות גרעין.
איור 2. ההשוואה בין שיטת השקופית תלת-ממדית לבין התפשטות פני השטח לאחר טיפול היפוטוני באותה הגדלה. (A)באמצעות שקופית 3D, Cot-1 RNA FISH (cy3) ו immunostaining עם נוגדנים נגד CBX1 (fitc) ו γH2AX (cy5) מבוצעים. זרעון פצ'יטן עם קטע z יחיד מוצג. (B)באמצעות התפשטות פני השטח, מבוצעים חיסונים עם נוגדנים נגד SCP3 ו- γH2AX. זרעון פצ'יטן מוצג. עיגולים: גוף XY. פסים: 10 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בהכנת שקופיות תלת-ממדיות, שלב ההחלחלה מקדים את שלב הקיבעון. שלבים אלה מבוצעים ישירות על צינוריות חצי-חצי, ובכך משמרים את מבנה הכרומטין התלת מימדי. אפשרות חלופית לשימור מבנה הכרומטין עבור RNA / DNA FISH היא לבצע את שלב permeabilization ואת שלב הקיבעון בו זמנית. טכניקה חלופית זו בוצעה בתאי נבט כיס בעוברים קדם-השתלה של העכבר7,8. עם זאת, אם שלב הקיבעון מקדים את שלב ההחלחלה, הוא עשוי להוליד רקע ציטופלסמי גבוה. לכן, הקובע הקריטי של אופטימיזציה שקופיות עבור RNA ודגים DNA תלוי בסדר של חדירות ואת שלבי הקיבעון. משך שלב ההחלחלה הוא גם גורם חשוב לאופטימיזציה של הכנת שקופיות. שש דקות הוא התנאי הכללי לשיטה זו. עם זאת, זה יכול להיות מותאם בהתאם וריאציה של החומרים המשמשים.
השימור של מבנה הכרומטין התלת מימדי הוא תכונה של שקופית התלת-ממד המפרידה אותו באופן מובהק מגלשות התפשטות פני השטח. יתרון זה שונה מאוד מזה של הכנת התפשטות כרומוזום. שיטת השקופית התלת-ממדית משמרת מבנה כרומטין תלת-ממדי, אך דורשת רכישת נתונים עם מקטעי z מרובים כדי להקיף גרעין שלם. מקטע z יחיד אינו יכול ללכוד את כל האותות של גרעין. לפיכך, הצורך במספר סעיפי z הוא מגבלה עיקרית לשיטה זו. כדי ללכוד גרעין בקטע z יחיד, לממרחי פני השטח יש יתרון. לכן, השיטה 3D והכנת התפשטות פני השטח יש יתרונות ברורים לפצות הדדית את התכונות של זה לחקר מיוזיס ו spermatogenesis.
ניתן להחיל את שיטת השקופית תלת-ממדית על כל סוגי התאים הנמצאים באשכים, כולל זרעונים, זרעונים עגולים ותאי סרטולי. שיטה זו יושמה גם כדי לבחון את דחיסת הכרומטין של כרומוזומי המין בתחילת איון כרומוזום המין המיוטי, ולבחון שינויים אפיגנטיים ב- PMSC10. במונחים של יישומים עתידיים, שיטה זו עשויה להיות מיושמת על רקמות או תאים אחרים. אם כן, מומלץ לשלב ההחלחלה לפני שלב הקיבעון. לחלופין, ניתן לבצע בו-זמנית את שלב ההחלחלה ואת שלב הקיבעון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחבר אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אני מודה לג'יני טי לי על הפיקוח על הפרויקט הזה כשהייתי במעבדה של לי וטיילר ברורינג על עריכת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי פרס בזיל אוקונור סטרטר מלומד מקרן מצעדת דימס ו- NIH Grant GM098605.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | |
| Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit | Agilent | 300380 | |
| Herring sperm DNA Solution | Invitrogen | 15634-017 | |
| Ethanol. 200 proof (absolute) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Formamide deionized | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Lifeblood Medical | 77110-100 | |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D6001 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | A10491-01 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 76240 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | |
| Illustra MicroSpin G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Forceps | VWR | 300-050 | |
| Microcentrifuge tubes | Bioexpress | C-3262-1 | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| Coplin Jar | Fisher | 08-815 | |
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| 4-well dish | Fisher | 12-566-301 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Air incubator | Revolutionary Science | RS-IF-203 |
References
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Namekawa, S. H., et al. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr Biol. 16, 660-667 (2006).
- Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
- Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis. Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).
- Hall, L. L., et al. An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).
- Huynh, K. D., Lee, J. T. Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos. Nature. 426, 857-862 (2003).
- Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).
- Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse. Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).
- Ichijima, Y., et al. MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells. Genes Dev. 25, 959-971 (2011).
- Sin, H. S., et al. RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids. Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).
