Summary
Материал здесь описывает метод, разработанный для сохранения трехмерной хроматиновой структуры клеток зародыша яичек. Это было подемуно трехмерным (3D) методом слайда. Этот метод повышает чувствительность для обнаружения субядерных структур и применяется для иммунофлуоресценции, ДНК и РНК флуоресценции на месте гибридизации (FISH).
Abstract
Во время дифференциации зародышевых клеток яичек структура ядерного хроматина динамически меняется. Ниже описывается метод, предназначенный для сохранения трехмерного хроматина расположение яичек зародышевых клеток, найденных у мышей; этот метод был объявлен трехмерным (3D) методом слайда. В этом методе, трубоубийства яичка сразу обработаны с шагом permeabilization который извлекает цитоплазмический материал, после этого шаг фиксации который фиксирует ядерные материалы. Трубы затем разобщены, подвеска клетки цитоспун, и клетки придерживаются слайдов. Этот метод повышает чувствительность к обнаружению субядерных структур и применим для иммунофлуоресценции, ДНК и РНК флуоресценции на месте гибридизации (FISH) и сочетание этих методов обнаружения. В качестве примера возможного применения метода 3D слайда показана РНК-6 FISH cot-1 для обнаружения зарождающихся РНК. Метод 3D слайда облегчит детальное изучение пространственных отношений между структурой хроматина, ДНК и РНК во время дифференциации зародышевых клеток яичек.
Introduction
В яичках, зародышевые клетки дифференцируют от диплоидной сперматогонии через мейоз в зрелые, гаплоидные сперматозоиды. В ходе этого процесса ядерная хроматиновая структура зародышевых клеток непрерывно и динамически реконструируются. Поверхностные спреды обычно используются для цитологического исследования отдельных сперматозоидов. Преобладающий метод поверхностных спредов использует гипотоническое лечение, с помощью которого отдельные сперматозоидные клетки распространяются исплющиваются 1. Эти условия являются оптимальными для детального анализа мейотических хромосом. Хромосомные функции, такие как синаптический статус и очаги рекомбинации, легко наблюдаются с помощью этого метода. Однако гипотоническое лечение нарушает архитектуру субядерных хроматинов, поэтому этот метод не подходит для структурного анализа ядер. Следовательно, усовершенствован метод был разработан для сохранения трехмерной хроматиновой структуры зародышевых клеток яичек. Этот метод был объявлен трехмерным (3D) методом слайда(рисунок 1). Метод 3D слайда позволил вынашить зарождающуюся локализацию РНК в ядрах, потому что он был первоначально оптимизирован для изучения экспрессии генов и хроматиновых состояний во время дифференциации клеток яичек зародыша рнк флуоресценции на месте гибридизации (FISH)2,3. Этот 3D метод также применим к сочетанию иммунофлуоресценции, ДНК и РНК FISH. Кроме того, этот метод способствовал открытию постмейотического пола хроматина (PMSC), молчаливого отсека половых хромосом, найденных в постмейотических сперматозоидах2.
Метод 3D слайда был первоначально оптимизирован за счет сочетания двух основных этапов подготовки слайдов, обычно используемых для ядерного окрашивания: шаг фиксации, предназначенный для фиксации ядерных материалов, и шаг пермеабилизации, предназначенный для удаления цитоплазмических материалов в целях повышения доступности окрашивающих реагентов, таких как антитела и зонды FISH. Как уже говорилось вдругой публикации 3,было установлено, что шаг пермеабилизации должен предшествовать этапу фиксации, чтобы получить оптимальные результаты с низким цитоплазмическим фоном. В этом методе 3D слайда, шаг промеабилизации и последующий шаг фиксации выполняются непосредственно на семенных трубочки и следуют механической диссоциации зародышевых клеток с типсами до цитоскопирования на слайдах. Альтернативный метод РНК FISH сперматозоидов был разработан в другой лаборатории4. В этом методе, в соответствии с 3D-методом, шаг пермялизации должен предшествовать этапу фиксации, чтобы получить оптимальные результаты РНК FISH.
В следующем протоколе описывается метод 3D слайда и приводится пример возможного применения, Cot-1 РНК FISH для обнаружения ядерных зарождающихся РНК. ДНК Cot-1 состоит из повторяющихся элементов генома. Здесь зонд ДНК Cot-1 гибридизирован с интроном и UTR зарождающихся транскриптов, тем самым обнаруживая транскрипционно активные области вядре 5,6. 3D слайды универсальны и могут быть применены к сочетанию иммунофлуоресценции, ДНК и РНК FISH методов для получения детального изучения пространственных отношений между хроматин архитектуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.3D Подготовка слайда
- Подготовь следующие реагенты:
- Буфер CSK: 100 мм НаКл, 300 мм сахароза, 10 мМ PIPES, 3 мм MgCl2. Отрегулируйте рН до 6,8 с 1 M NaOH. Храните буфер CSK при 4 градусах Цельсия.
- Буфер CSK с 0,5% Triton X-100: Добавьте 200 мл буфера Triton X-100 до 40 мл буфера CSK. Смешайте раствор с помощью магнитного мешалки до полного растворения Triton X-100. Храните буфер CSK с 0,5% Triton X-100 при 4 градусах Цельсия.
- 4% Параформалдегид (PFA)-PBS, рН 7.4: Растворите 4 г ПФА примерно в 70-80 мл воды. Для ускорения процесса растворения добавьте приблизительно 20 мкл 4 N NaOH и держите раствор в водяной бане при 60 градусах Цельсия до полного растворения ПФА и прозрачности раствора. Этот процесс занимает около 1 часа. После того, как PFA полностью растворилась, добавьте 10 мл 10x PBS. Отрегулируйте конечный объем до 100 мл водой и охладив раствор до комнатной температуры (25 градусов по Цельсию). Используйте свежеприготовленное решение для каждого нового эксперимента.
Примечание: Получить институциональное разрешение на все работы с животными и придерживаться соответствующих руководящих принципов по уходу за животными.
- Эвтанизировать мышей мужского пола. Используя типсы и ножницы, вырезать яички из мыши. Поместите яичко в PBS (или RPMI 1640). После удаления яичка, быстро выполнить следующие шаги 1.3-1.4 для того, чтобы предотвратить деградацию РНК.
- Разрыв яичка на небольшой чашке Петри и удалить туника альбугинеа. Разгайте семенные трубочки в PBS на льду с помощью типсов.
- Используя типсы, перенесите несколько трубок (несколько кусочков трубчатых труб длиной примерно 5-10 мм) в один колодец из 4-хорошо блюдо, содержащее 500 мл буфера CSK и 0,5% Triton X-100 на льду, и инкубировать в течение 6 мин. Чрезмерное воздействие буфера CSK может привести к нарушению работы ячеек.
- Используя хлестки, перенесите все трубочные трубочные трубы в один колодец блюда из 4 колодец, содержащий 4% раствора PFA-PBS. Этот шаг может быть предварительно сформирован без стереомикроскопа, но по желанию он может быть использован. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Одновременно начинают готовить 12 цитоспинов в инкубационые периоды.
- Используя типсы, перенесите все трубоубивания в один колодец из 4-хорошо блюдо, содержащее PBS. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.
- На обратной стороне стеклянной горки перенесите все трубоубийки в 30 мкл PBS (верхнюю часть слайда следует избегать из-за катического заряда). Используя кончики двух типсов, разорвь трубоубийцы на куски. Нарезать трубоубий в горизонтальном направлении, вырезая трубоубивания между кончиками двух типсов и потянув миппы горизонтально. Продолжайте этот шаг в течение примерно 10-20 сек.
- Смешайте подвеску с помощью пипетки P20.
- Перенесите суспензию в трубку микроцентрифуга, разбавляют PBS примерно до 1,3 мл. Нанесите 100 мкл суспензии на каждую из 12 цитоскопий (всего 1,2 мл). На этом этапе концентрация клеток не нуждается в определении.
- Цитоспин образцов при температуре 2000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре. После цитоскопирования сухие горки на лабораторной скамейке в течение нескольких минут при комнатной температуре. После слайды было разрешено полностью высохнуть в течение нескольких минут, перейдите к следующему шагу.
- Используя банку Coplin, содержащую PBS, мыть горки в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Передача слайдов в банку Coplin, содержащую 70% этанола и ждать по крайней мере 2 минуты до начала РНК FISH. Слайды стабильны в течение нескольких недель в 70% этанола при 4 градусов по Цельсию. Для длительного хранения, обезвоживать слайды с использованием серийной обработки с 80% и 100% этанола в coplin банки в течение 2 минут каждый и воздух сухой полностью обезвоживают слайды. Хранить при -80 градусов по Цельсию в слайд-бокс.
2. Кот-1 ДНК зонд Подготовка случайных Грунтинг
- Подготовь следующие реагенты:
- Буфер гибридизации: Смешайте компоненты производства для подготовки 900 мл буферного запаса гибридизации; это решение будет использоваться для октяхивных зондов. Этот буферный запас гибридизации позволяет до гибридизации увеличить 10% объема раствора ингибитора RNase (Ribonucleoside Vanadyl Complex).
Перед гибридизацией добавьте 1/10 vol 200 мМ Рибонуклеозидный ванадиловый комплекс или воду в буферный запас гибридизации, чтобы соответствовать окончательной концентрации. При -20 градусов по Цельсию эта смесь стабильна уже больше года.компонент Сумма (ол) Окончательная концентрация Формамид 500 50% (v/v) 50% Декстран 200 10% (ж/в) 20x SSC 100 2x 1% BSA 100 0.1% - 20x SSC: Растворите 88,2 г цитрата натрия и 175,3 г NaCl примерно в 800 мл воды. Отрегулируйте рН до 7,0, используя несколько капель 1 M HCl. Добавить воду, чтобы настроить окончательный объем до 1 л. стерилизовать путем автоклавинга. После приготовления, 20x SSC может храниться при комнатной температуре.
- 50% (ж/в) Декстран: Перемешать воду и медленно добавить 50 г декстрана сульфата. Продолжайте помешивать на ночь при комнатной температуре. Добавить воду, чтобы отрегулировать конечный объем до 100 мл. Хранить при комнатной температуре.
- Буфер гибридизации: Смешайте компоненты производства для подготовки 900 мл буферного запаса гибридизации; это решение будет использоваться для октяхивных зондов. Этот буферный запас гибридизации позволяет до гибридизации увеличить 10% объема раствора ингибитора RNase (Ribonucleoside Vanadyl Complex).
- Добавьте следующие компоненты, перечисленные ниже, в трубку PCR. Используя ПЦР-машину, смешайте и инкубировать раствор в течение 5 минут при 95 градусов по Цельсию.
компонент Сумма за реакцию (ол) последний ДНК кот-1: 1 мг/мл 1 1 мкг Случайный 9mer грунтовка (из комплекта) 10 Вода 27 - Центрифугу ненадолго и помпить на лед.
- Добавьте следующие компоненты. Смешайте и инкубировать в течение 30 минут при 37 градусов по Цельсию с помощью ПЦР машины. (Для получения подробной информации об используемом комплекте см. таблицу реагентов и оборудования).
компонент Сумма за реакцию (ол) Окончательная концентрация Смесь, приготовленная из шага 2.2 38 5x нуклеотидный буфер (из комплекта) 9.2 Cy3-dUTP (1 мМ) 0.8 16 МКМ Кленов (из комплекта) 2 - Добавьте 2 мкл стоп-буфера (из комплекта), чтобы прекратить реакцию.
- Очистить остановленную реакцию с помощью столбцов микроспина.
- Добавьте 50 мкг (5 мкл) ДНК спермы сельди (50 раз больше шаблона Cot-1 ДНК) в очищенную фракцию.
- Измерьте общий объем с помощью пипетки. Добавьте 0,7x объем 100% этанола и 0,1x объем 3 М ацетата натрия (рН 5.2), хорошо перемешать, и центрифуг в течение 15 мин на максимальной скорости (17000 х г) с помощью микроцентрифуга при 4 градусов по Цельсию.
- Удалите жидкость и добавьте 200 мкл 70% этанола, хорошо перемешайте и центрифугу в течение 5 минут при максимальной скорости при 4 градусах Цельсия.
- Удалите лишнюю жидкость. Высушите осадок на 10-30 мин при комнатной температуре.
- Растворите гранулы в 20 мкл буферного запаса гибридизации. Потому что гранулы часто трудно растворить, пипетки неоднократно. В качестве альтернативного варианта, вихревой смеситель также может быть использован для эффективного растворения гранул. Зонды могут храниться при -20 градусов по Цельсию до использования.
3. Кот-1 РНК РЫБЫ
- Добавьте перечисленные ниже компоненты в трубку PCR. Используя ПЦР-машину, инкубировать в течение 10 минут при 80 градусов по Цельсию, а затем преанналирование шаг примерно 10-30 мин при 42 градусов по Цельсию. Держите при 42 градусов по Цельсию до гибридизации. Комплекс Ribonucleoside Vanadyl является необязательным; его можно заменить водой.
компонент Сумма за реакцию (ол) последний Зонд ДНК Cot-1 (50 нг/ль) 2 100 нг Комплекс Рибонуклеозид Ванадил (200 мМ) 2 20 мМ Буфер гибридизации добавлено до 20 - Обезвоживаемые слайды в банке Coplin, содержащей 80% этанола в течение 2 минут, а затем coplin банку, содержащую 100% этанола в течение 2 мин. Сухие слайды полностью на лабораторной скамейке при комнатной температуре.
- Предварительно разогрейте камеру наконечника коробки (заполненную 2-3 см воды) в инкубаторе на 42 градуса Цельсия. Поместите слайд на камеру наконечника коробки. Кратко центрифуга preannealed зондов и пипетки непосредственно на обезвоженных слайдов. Избегайте пузырей. Аккуратно накройте слайд крышкой скольжения.
- Гибридизировать в течение 6 часов на ночь (14-15 часов) при 42 градусах Цельсия.
- Подготовка мытья растворов в банках Coplin (две банки с 2x SSC и 50% формамид, и две банки с 2x SSC). Разогреть при 42 градусов по Цельсию в течение 30 минут на водяной бане.
- Используйте лезвие бритвы, чтобы удалить крышку скольжения от края слайда. Избегайте царапин образцов. Вымойте слайды в банке Coplin, содержащей 2x SSC и 50% формамид в течение 5 мин при 45 градусах Цельсия. Повторите этот шаг один раз.
- Вымойте слайды в банке Coplin, содержащей 2x SSC в течение 5 минут при 45 градусах Цельсия. Повторите этот шаг один раз.
- Добавьте 20 мкл DAPI-монтажных средств массовой информации на слайды и накройте крышкой. Аккуратно нажмите на стекло крышки, чтобы удалить дополнительные монтажные средства. Пятно дополнительных монтажных средств массовой информации с очисткой тканей. Слайды готовы к оценке микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Репрезентативный результат 3D слайда показан на рисунке 2. В этом эксперименте, Cot-1 РНК FISH была выполнена для обнаружения зарождающейся транскрипции вместе с иммуностимулятором с использованием анти-CBX1 и антитела к Х2АКС. Для объединения РНК FISH и иммуностимулятора, иммуностимулятор был выполнен первым, а затем РНК FISH, как описано в3. CBX1 является хетерохроматином белка, который локализуется в перицентрометрический хетерохроматин и молчание половых хромосом при мейозе называется XY тела (или полового тела). H2AX является фосфорилированной формой гистона вариант H2AX и локализуется на теле XY. На этой картинке сигналы Cot-1 накапливаются на эухроматических областях, но исключаются из перицентрометрического гетерохроматина и тела XY.
Во время подготовки к распространению поверхности лечение гипотоническим раствором набухает ядрами и физически расширяет субядерные структуры. Этот преобладающий метод для мейотического исследования лучше всего подходит для захвата всех мейотических хромосом в одном z-плоскости1. Чтобы прояснить разницу между методом 3D слайда и поверхности распространяется после гипотонического лечения, репрезентативные фотографии pachytene сперматиноцитов каждого эксперимента показаны с использованием того же увеличения с помощью эпифлуоресцентного микроскопа (Цифры 2A и 2B). В поверхностных спредах, обработанных гипотоническим раствором, нарушается трехмерная хроматиновая структура и все мейотические хромосомные оси могут быть захвачены в пределах одной z-плоскости. 3D слайд подготовки, однако, сохраняет нетронутыми хроматина структуры.
Рисунок 1. Схема метода 3D слайда. Метод 3D слайда может сохранить трехмерную структуру хроматина. Из-за трехмерного характера слайда для покрытия ядра требуется получение данных с помощью нескольких z-разделов.
Рисунок 2. Сравнение метода 3D слайда и поверхности распространяется после гипотонического лечения при том же увеличении. (A) Использование 3D слайда, Cot-1 РНК FISH (cy3) и иммуностиминга с анти CBX1 (фитк) и qH2AX (cy5) антитела выполняются. Показано пахитеново сперматомоцит с одним z-разделом. (B)Использование поверхностных спредов, иммуностимуляторы с анти SCP3 и антителами КХ2АК выполняются. Показано пахитеново сперматомоцит. Круги: XY тела. Бары: 10 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В подготовке 3D слайда этап пермеабилизации предшествует этапу фиксации. Эти шаги выполняются непосредственно на семенных трубочки, тем самым сохраняя трехмерную структуру хроматина. Альтернативным вариантом сохранения хроматиновой структуры для РНК/ДНК FISH является одновременное выполнить шаг протеабилизации и шаг фиксации. Этот альтернативный метод был выполнен в сумчатых зародышевых клетках и в эмбрионах преимплантациимыши 7,8. Однако, если этап фиксации предшествует этапу пермеабилизации, это может привести к высокому цитоплазме. Таким образом, критический детерминант оптимизации слайдов для РНК и ДНК FISH зависит от порядка протеабилизации и шагов фиксации. Длительность шага пермяки также является важным фактором оптимизации подготовки слайдов. Шесть минут является общим условием для этого метода. Тем не менее, он может быть скорректирован в зависимости от изменения используемых материалов.
Сохранение трехмерной структуры хроматина является особенностью 3D слайда, который отчетливо отделяет его от слайдов поверхности распространения. Это преимущество сильно отличается от хромосомной подготовки распространения. Метод 3D слайда сохраняет трехмерную структуру хроматина, но требует сбора данных с помощью нескольких z-разделов, охватывающих все ядро. Один z-раздел не может захватить все сигналы ядра. Таким образом, необходимость в нескольких z-разделах является одним из основных ограничений для этого метода. Для захвата ядра в одном z-разделе поверхностные спреды имеют преимущество. Поэтому 3D-метод и препарат поверхностного распространения имеют явные преимущества и взаимно компенсируют особенности друг друга для изучения мейоза и сперматогенеза.
Метод 3D слайда может быть применен ко всем типам клеток, найденных в яичках, включая сперматогонию, круглые сперматозоиды и клетки Сертоли. Этот метод также был применен для изучения хроматина уплотнения половых хромосом в начале активации мейотической половой хромосомы, а также для изучения эпигенетических изменений на PMSC10. С точки зрения будущих применений, этот метод может быть применен к другим тканям или клеткам. Если это так, рекомендуется, чтобы этап протеабилизации предшествовал этапу фиксации. Кроме того, шаг пермяки и этап фиксации могут быть выполнены одновременно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автору нечего разглашать.
Acknowledgments
Я благодарю Джинни Т. Ли за наблюдение за этим проектом, когда я была в лаборатории Ли, и Тайлера Броэринга за редактирование рукописи. Эта работа была поддержана Basil O'Connor Starter Scholar Award от Фонда Марта Dimes и NIH Грант GM098605.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | |
| Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit | Agilent | 300380 | |
| Herring sperm DNA Solution | Invitrogen | 15634-017 | |
| Ethanol. 200 proof (absolute) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Formamide deionized | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Lifeblood Medical | 77110-100 | |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D6001 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | A10491-01 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 76240 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | |
| Illustra MicroSpin G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Forceps | VWR | 300-050 | |
| Microcentrifuge tubes | Bioexpress | C-3262-1 | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| Coplin Jar | Fisher | 08-815 | |
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| 4-well dish | Fisher | 12-566-301 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Air incubator | Revolutionary Science | RS-IF-203 |
References
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Namekawa, S. H., et al. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr Biol. 16, 660-667 (2006).
- Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
- Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis. Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).
- Hall, L. L., et al. An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).
- Huynh, K. D., Lee, J. T. Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos. Nature. 426, 857-862 (2003).
- Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).
- Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse. Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).
- Ichijima, Y., et al. MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells. Genes Dev. 25, 959-971 (2011).
- Sin, H. S., et al. RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids. Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).
