Summary
El material aquí describe un método desarrollado para preservar la estructura tridimensional de la cromatina de las células germinales testiculares. Esto se ha denominado el método de diapositiva tridimensional (3D). Este método mejora la sensibilidad para la detección de estructuras subnucleares y es aplicable para la inmunofluorescencia, el ADN y la hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH).
Abstract
Durante la diferenciación testicular de la célula de germen, la estructura de la cromatina nuclear cambia dinámicamente. A continuación se describe un método diseñado para preservar la disposición tridimensional de la cromatina de las células germinales testiculares que se encuentran en ratones; este método se ha denominado como el método de diapositiva tridimensional (3D). En este método, los túbulos testiculares se tratan directamente con un paso de permeabilización que elimina el material citoplasmático, seguido de un paso de fijación que fija los materiales nucleares. Los túbulos se disocian, la suspensión celular es citospun, y las células se adhieren a los portaobjetos. Este método mejora la sensibilidad hacia la detección de estructuras subnucleares y es aplicable para la inmunofluorescencia, el ADN y la hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH) y la combinación de estos métodos de detección. Como ejemplo de una posible aplicación del método de deslizamiento 3D, se muestra que un COT-1 RNA FISH detecta ARN nacientes. El método de deslizamiento 3D facilitará el examen detallado de las relaciones espaciales entre la estructura de la cromatina, el ADN y el ARN durante la diferenciación testicular de las células germinativas.
Introduction
En los testículos, las células germinales se diferencian de la espermatogonia diploide a través de la meiosis en espermatozoides maduros y haploides. Durante este proceso, la estructura de la cromatina nuclear de las células germinales se remodela de forma continua y dinámica. Las separaciones superficiales son de uso general para la examinación citológica de células espermatogénicas individuales. Un método predominante de diseminaciones superficiales emplea el tratamiento hipotónico por el cual las células espermatogénicas individuales se propagan y aplanan1. Estas condiciones son óptimas para el análisis detallado de cromosomas meióticos. Las características cromosómicas tales como focos sinápticos de la situación y de la recombinación se observan fácilmente usando este método. Sin embargo, el tratamiento hipotónico interrumpe la arquitectura de la cromatina subnuclear, por lo que esta técnica no es adecuada para el análisis estructural de núcleos. Por lo tanto, un método mejorado se ha diseñado para preservar la estructura tridimensional de la cromatina de células de germen testiculares. Este método se ha denominado como el método de diapositiva tridimensional (3D) (Figura 1). El método de deslizamiento 3D ha permitido la detección de localización de ARN naciente en núcleos, ya que inicialmente se optimizó para examinar la expresión génica y los estados de cromatina durante la diferenciación de células germinales testiculares por hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH)2,3. Este método 3D también es aplicable a la combinación de inmunofluorescencia, ADN y ARN FISH. Además, este método ha ayudado en el descubrimiento de la cromatina sexual postmeiótica (EMPS), un compartimento silencioso de los cromosomas sexuales que se encuentran en las espermicidas postmeióticas2.
El método de deslizamiento 3D se optimizó originalmente a través de la combinación de dos pasos esenciales de preparación de diapositivas comúnmente utilizados para la tinción nuclear: el paso de fijación diseñado para fijar materiales nucleares y el paso de permeabilización destinado a eliminar materiales citoplasmáticos para mejorar la accesibilidad de los reactivos de tinción, como anticuerpos y sondas FISH. Como se describió anteriormente en otra publicación3,se ha determinado que la etapa de permeabilización debe preceder a la etapa de fijación con el fin de obtener resultados óptimos con bajo fondo citoplasmático. En este método de deslizamiento 3D, el paso de permeabilización y el paso de fijación posterior se realizan directamente en túbulos seminíferos y son seguidos por la disociación mecánica de células germinales con fórceps antes de citoespinning en diapositivas. Un método alternativo para los PECES DE ARN de las células espermatogénicas se desarrolló en otro laboratorio4. En este método, consistente con el método 3D, el paso de permeabilización debe preceder al paso de fijación para obtener resultados óptimos de RNA FISH.
El siguiente protocolo describe el método de deslizamiento 3D y proporciona un ejemplo de una posible aplicación, Cot-1 RNA FISH para la detección de ARN nucleares nacientes. El ADN de cot-1 consiste en elementos repetitivos en el genoma. Aquí, una sonda de ADN Cot-1 se hibrida con un intrón y UTR de las transcripciones nacientes, detectando así las regiones transcripcionalmente activas en el núcleo5,6. Las diapositivas 3D son versátiles y se pueden aplicar a una combinación de técnicas de inmunofluorescencia, ADN y ARN FISH para obtener un examen detallado de las relaciones espaciales entre la arquitectura de la cromatina.
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Protocol
1.3D Preparación de diapositivas
- Prepare los siguientes reactivos:
- Tampón CSK: 100 mM NaCl, 300 mM sacarosa, 10 mM PIPAS, 3 mM MgCl2. Ajuste el pH a 6,8 con NaOH de 1 M. Almacene el búfer CSK a 4 °C.
- Tampón CSK con Tampón Tritón X-100 al 0,5%: Añadir 200 μl de Tampón X-100 a 40 ml de Tampón CSK. Mezcle la solución con agitador magnético hasta que Triton X-100 se disuelva por completo. Almacene el tampón CSK con 0,5% tritón X-100 a 4 °C.
- Paraformadehído al 4% (PFA)–PBS, pH 7.4: Disolver 4 g de PFA en aproximadamente 70-80 ml de agua. Para acelerar el proceso de disolución, añadir aproximadamente 20 μl de NaOH de 4 N y mantener la solución en un baño de agua a 60 °C hasta que el PFA se haya disuelto por completo y la solución sea transparente. Este proceso toma aproximadamente 1 hora. Después de que la PFA se haya disuelto por completo, añadir 10 ml de PBS 10x. Ajustar el volumen final a 100 ml con agua y enfriar la solución a temperatura ambiente (25 °C). Utilice una solución recién preparada para cada nuevo experimento.
Nota: Obtenga el permiso institucional para todo el trabajo animal y se adhiera a las pautas relevantes del cuidado animal.
- Eutanasiar ratones machos. Usando las autopsas y las tijeras, elimine el testículo del ratón. Coloque el testículo en PBS (o RPMI 1640). Después de la eliminación del testículo, lleve a cabo rápidamente los siguientes pasos 1.3-1.4 para prevenir la degradación del ARN.
- Romper el testículo en una pequeña placa de Petri y retirar la túnica albugínea. Desentrañar los túbulos seminíferos en PBS sobre hielo usando pórceps.
- Usando fórceps, transfiera varios túbulos (varios trozos de túbulos de aproximadamente 5-10 mm de longitud) en un pocillo de un plato de 4 pocillos que contenga 500 ml de tampón CSK + 0,5% Triton X-100 en hielo, e incube durante 6 min. La sobreexposición al buffer CSK puede dar lugar a la interrupción de células.
- Usando pórceps, transfiera todos los túbulos a un pocillo de un plato de 4 pocillos que contenga una solución de PFA-PBS al 4%. Este paso se puede preformar sin un estereomicroscopio, pero opcionalmente se puede utilizar. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Simultáneamente comenzar a preparar 12 cámaras de citoespino durante los períodos de incubación.
- Usando pórceps, transfiera todos los túbulos a un pocillo de un plato de 4 pocillos que contenga PBS. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
- En la parte posterior de un portaobjetos de vidrio, transfiera todos los túbulos a 30 μl de PBS (la parte superior del portaobjetos debe evitarse debido a la carga catónica). Usando las puntas de dos tórceps, rompa los túbulos en pedazos. Corte los túbulos en una dirección horizontal recortando los túbulos entre las puntas de dos pinzas y tirando de los pinzas horizontalmente. Continúe con este paso durante aproximadamente 10-20 segundos.
- Mezcle la suspensión mediante pipeteo con una pipeta P20.
- Transferir la suspensión a un tubo de microcentrífuga, diluir con PBS a aproximadamente 1,3 ml. Aplicar 100 μl de suspensión en cada una de las 12 cámaras de citoespino (1,2 ml en total). En este paso, no es necesario determinar la concentración de células.
- Cytospin las muestras a 2.000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente. Después del citoespinning, seque los portaobjetos en el banco del laboratorio durante unos minutos a temperatura ambiente. Después de que se haya dejado que los portaobjetos se sequen por completo durante unos minutos, vaya al siguiente paso.
- Usando un frasco de Coplin que contenga PBS, lave los portaobjetos durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Transfiera los portaobjetos a un frasco de Coplin que contenga etanol al 70% y espere al menos 2 minutos antes del inicio de RNA FISH. Los portaobjetos son estables durante unas semanas en etanol al 70% a 4 °C. Para el almacenamiento a largo plazo, deshidrate los portaobjetos mediante tratamiento en serie con etanol al 80% y 100% en frascos coplin durante 2 min cada uno y se seque al aire completamente deshidratar los portaobjetos. Almacenar a -80 °C en una caja deslizante.
2. Preparación de la sonda de ADN Cot-1 por cebado aleatorio
- Prepare los siguientes reactivos:
- Tampón de hibridación: Mezcle los componentes de procedimiento para preparar 900 ml de tampón de hibridación; esta solución se utilizará para almacenar sondas. Esta acción tampón de hibridación permite la adición de un volumen del 10% de solución inhibidora de la ARNasa (Ribonucleósido Complejo Vanadyl) antes de la hibridación.
Antes de la hibridación, agregue 1/10 vol de 200 mM Ribonucleoside Vanadyl Complex o agua a la acción tampón de hibridación para que coincida con la concentración final. A -20 °C, esta mezcla es estable durante más de un año.componente Cantidad (μl) Concentración final formamida 500 50% (v/v) 50% Dextrano 200 10% (p/v) 20x SSC 100 2x 1% BSA 100 0.1% - 20x SSC: Disolver 88,2 g de citrato de sodio y 175,3 g de NaCl en aproximadamente 800 ml de agua. Ajuste el pH a 7.0 usando unas gotas de 1 M HCl. Agregue agua para ajustar el volumen final a 1 L. Esterilice por autoclave. Después de la preparación, 20x SSC se puede almacenar a temperatura ambiente.
- 50% (p/v) Dextrano: Remover agua y añadir lentamente 50 g de sulfato de dextrano. Siga revolviendo durante la noche a temperatura ambiente. Añadir agua para ajustar el volumen final a 100 ml. Conservar a temperatura ambiente.
- Tampón de hibridación: Mezcle los componentes de procedimiento para preparar 900 ml de tampón de hibridación; esta solución se utilizará para almacenar sondas. Esta acción tampón de hibridación permite la adición de un volumen del 10% de solución inhibidora de la ARNasa (Ribonucleósido Complejo Vanadyl) antes de la hibridación.
- Agregue los siguientes componentes que se enumeran a continuación a un tubo de PCR. Usando una máquina de PCR, mezcle e incube la solución durante 5 min a 95 °C.
componente Cantidad por reacción (μl) final ADN de Cot-1: 1 mg/ml 1 1 μg Imprimación aleatoria de 9mers (del kit) 10 Agua 27 - Centrífuga brevemente y colocar sobre hielo.
- Agregue los siguientes componentes. Mezclar e incubar durante 30 min a 37 °C utilizando una máquina de PCR. (Para más detalles del kit utilizado ver la tabla de reactivos y equipos).
componente Cantidad por reacción (μl) Concentración final Mezcla preparada a partir de la etapa 2.2 38 Tampón de nucleótidos 5x (del kit) 9.2 Cy3-dUTP (1 mM) 0.8 μM 16 Klenow (de kit) 2 - Añadir 2 μl de tampón de parada (desde el kit) para interrumpir la reacción.
- Purificar la reacción detenida usando columnas de microspin.
- Añadir 50 μg (5 μl) de ADN de espermatozoides arenqueros (50 veces más de ADN Cot-1 plantilla) a la fracción purificada.
- Mida el volumen total con una pipeta. Añadir 0,7x volumen de etanol al 100% y 0,1x volumen de acetato de sodio 3 M (pH 5,2), mezclar bien y centrífuga durante 15 min a velocidad máxima (17.000 x g) utilizando una microcentrífuga a 4 °C.
- Retire el líquido, y agregue 200 μl de etanol al 70%, mezcle bien y centrífuga durante 5 min a la velocidad máxima a 4 °C.
- Retire el exceso de líquido. Seque el precipitado durante 10-30 min a temperatura ambiente.
- Disuelva el pellet en 20 μl de hibridación de tampón. Debido a que el pellet es a menudo difícil de disolver, pipeta repetidamente. Como opción alternativa, un mezclador de vórtice también se puede utilizar para disolver eficientemente el pellet. Las sondas se pueden mantener a -20 °C hasta su uso.
3. Cuna-1 ARN PESCADO
- Agregue los componentes que se enumeran a continuación a un tubo de PCR. Usando una máquina de PCR, incubar durante 10 min a 80 °C, seguido de un paso previo de aproximadamente 10-30 min a 42 °C. Mantener a 42 °C hasta la hibridación. Ribonucleoside Vanadyl Complex es opcional; se puede reemplazar con agua.
componente Cantidad por reacción (μl) final Sonda de ADN Cot-1 (50 ng/μl) 2 100 ng Complejo Ribonucleósido Vanadyl (200 mM) 2 20 mM Búfer de hibridación agregado a 20 - Deshidrate los portaobjetos en un frasco de Coplin que contiene etanol del 80% por 2 minutos, seguido por un frasco de Coplin que contiene el etanol del 100% por 2 minutos. Secar completamente en el banco de laboratorio a temperatura ambiente.
- Precaliente una cámara de caja de punta (llena de 2-3 cm de agua) en una incubadora de 42 °C por adelantado. Coloque la diapositiva en la cámara de la caja de la punta. Centrifugar brevemente las sondas preannealed y pipeta directamente sobre las diapositivas deshidratadas. Evite hacer burbujas. Cubra suavemente la corredera con un resbalón de cubierta.
- Hibridar durante 6 horas a la noche (14-15 horas) a 42 °C.
- Prepare soluciones de lavado en frascos Coplin (dos frascos con 2x SSC y 50% formamida, y dos frascos con 2x SSC). Precalentar a 42 °C durante 30 min en un baño de agua.
- Utilice una cuchilla de afeitar para quitar el resbalón de la cubierta del borde de la corredera. Evite rascarse las muestras. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin que contenga 2x SSC y 50% de formamida durante 5 min a 45 °C. Repita este paso una vez.
- Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin que contenga 2x SSC durante 5 minutos a 45 °C. Repita este paso una vez.
- Agregue 20 μl de soporte de montaje DAPI a las guías y cubra con un resbalón de cubierta. Presione suavemente el vidrio de la cubierta para quitar los medios de montaje adicionales. Blot medios de montaje adicionales con tejido de limpieza. Los portaobjetos están listos para la evaluación de microscopía.
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Representative Results
Un resultado representativo de una diapositiva 3D se muestra en la Figura 2. En este experimento, cot-1 ARN FISH se realizó para detectar la transcripción naciente junto con inmunostaining utilizando anticuerpos anti CBX1 y γH2AX. Para combinar el ARN FISH y el immunostaining, el immunostaining fue realizado primero, seguido por el PESCADO del ARN según lo descrito en3. CBX1 es una proteína heterocromatina que se localiza en heterocromatina pericentromérica y cromosomas sexuales silenciosos en la meiosis llamada cuerpo XY (o cuerpo sexual). γH2AX es una forma fosforilada de la variante de histonas H2AX y se localiza en el cuerpo XY. En este cuadro, las señales Cot-1 acumulan en regiones eucromáticas, pero se excluyen de la heterocromatina pericentromérica y del cuerpo XY.
Durante la preparación de la extensión superficial, el tratamiento con la solución hipotónica hincha núcleos y extiende físicamente las estructuras subnucleares. Este método predominante para el estudio meiótico es el más adecuado para capturar todos los cromosomas meióticos en un solo plano z1. Para aclarar la diferencia entre el método de deslizamiento 3D y las dispersiones superficiales después del tratamiento hipotónico, se muestran imágenes representativas de espermatocitos paquitenos de cada experimento utilizando el mismo aumento utilizando un microscopio epifluorescente(Figuras 2A y 2B). En las diseminaciones superficiales tratadas con solución hipotónica, la estructura tridimensional de la cromatina se interrumpe y todos los ejes cromosómicos meióticos se pueden capturar dentro de un solo plano z. La preparación de diapositivas 3D, sin embargo, preserva la estructura intacta de la cromatina.
Figura 1. Esquema del método de diapositiva 3D. El método de diapositiva 3D puede preservar la estructura tridimensional de la cromatina. Debido a la naturaleza tridimensional de la diapositiva, se requiere la adquisición de datos con múltiples secciones z para cubrir un núcleo.
Figura 2. Comparación entre el método de deslizamiento 3D y las dispersiones superficiales después del tratamiento hipotónico con el mismo aumento. (A)Utilizando el portaobjetos 3D, se realiza cot-1 ARN FISH (cy3) e inmunotensidad con anticuerpos anti CBX1 (fitc) y γH2AX (cy5). Se muestra un espermatocitos paquiteno con una sola sección z. (B)Utilizando las diseminaciones superficiales, se realiza inmunotensación con anticuerpos anti SCP3 y γH2AX. Se muestra un espermatocitos paquiteno. Círculos: Cuerpo XY. Barras: 10 μm.
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Discussion
En la preparación de diapositivas 3D, el paso de permeabilización precede al paso de fijación. Estos pasos se realizan directamente sobre túbulos seminíferos, preservando así la estructura tridimensional de la cromatina. Una opción alternativa para preservar la estructura de la cromatina para el ARN/ADN FISH es realizar la etapa de permeabilización y la etapa de fijación simultáneamente. Esta técnica alternativa se ha realizado en células germinales marsupiales y en embriones preimplantacional de ratón7,8. Sin embargo, si el paso de fijación precede al paso de permeabilización, puede dar lugar a un fondo citoplasmático alto. Por lo tanto, el determinante crítico de la optimización de diapositivas para el ARN y el ADN FISH depende del orden de la permeabilización y los pasos de fijación. La duración de la etapa de permeabilización también es un factor importante para la optimización de la preparación de diapositivas. Seis minutos es la condición general de este método. Sin embargo, se puede ajustar en función de la variación de los materiales utilizados.
La preservación de la estructura tridimensional de la cromatina es una característica de la diapositiva 3D que la separa claramente de las diapositivas de dispersión superficial. Esta ventaja difiere en gran medida de la de la preparación de la dispersión cromosómica. El método de diapositiva 3D conserva la estructura tridimensional de la cromatina, pero requiere la adquisición de datos con múltiples secciones z para abarcar todo un núcleo. Una sola sección z no puede capturar todas las señales de un núcleo. Por lo tanto, la necesidad de varias secciones z es una limitación importante para este método. Para capturar un núcleo en una sola sección z, las dispersiones de superficie tienen una ventaja. Por lo tanto, el método 3D y la preparación de la dispersión superficial tienen ventajas distintas y compensan mutuamente las características de cada uno para el estudio de la meiosis y la espermatogénesis.
El método de deslizamiento 3D se puede aplicar a todos los tipos de células que se encuentran dentro de los testículos, incluyendo espermatogonia, espermatótidas redondas y células de Sertoli. Este método también se ha aplicado para examinar la compactación de la cromatina de los cromosomas de sexo en el inicio de la inactivación meiótica del cromosoma de sexo, y para examinar modificaciones epigenéticas en PMSC10. En términos de aplicaciones futuras, este método se puede aplicar a otros tejidos o células. Si es así, se recomienda que el paso de permeabilización preceda al paso de fijación. Alternativamente, el paso de permeabilización y el paso de fijación se pueden realizar simultáneamente.
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Disclosures
El autor no tiene nada que revelar.
Acknowledgments
Agradezco a Jeannie T. Lee por la supervisión de este proyecto cuando estaba en el laboratorio Lee y a Tyler Broering por editar el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Basil O'Connor Starter Scholar Award de march of dimes Foundation y la nih grant GM098605.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | |
| Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit | Agilent | 300380 | |
| Herring sperm DNA Solution | Invitrogen | 15634-017 | |
| Ethanol. 200 proof (absolute) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Formamide deionized | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Lifeblood Medical | 77110-100 | |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D6001 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | A10491-01 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 76240 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | |
| Illustra MicroSpin G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Forceps | VWR | 300-050 | |
| Microcentrifuge tubes | Bioexpress | C-3262-1 | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| Coplin Jar | Fisher | 08-815 | |
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| 4-well dish | Fisher | 12-566-301 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Air incubator | Revolutionary Science | RS-IF-203 |
References
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