Summary
यहां सामग्री वृषण रोगाणु कोशिकाओं की त्रि-आयामी क्रोमेटिन संरचना को संरक्षित करने के लिए विकसित एक विधि का वर्णन करती है। इसे थ्री-डायमेंशनल (3डी) स्लाइड मेथड करार दिया गया है। यह विधि उपनकीय संरचनाओं का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता में सुधार करती है और सीटू संकरण (मछली) में इम्यूनोफ्लोरेसेंस, डीएनए और आरएनए फ्लोरेसेंस के लिए लागू होती है।
Abstract
वृषण रोगाणु कोशिका भेदभाव के दौरान, परमाणु क्रोमेटिन की संरचना गतिशील रूप से बदलती है। निम्नलिखित चूहों में पाए जाने वाले वृषण रोगाणु कोशिकाओं की त्रि-आयामी क्रोमेटिन व्यवस्था को संरक्षित करने के लिए डिज़ाइन की गई एक विधि का वर्णन करता है; इस विधि को त्रि-आयामी (3 डी) स्लाइड विधि कहा गया है। इस विधि में, वृषण ट्यूबलों को सीधे एक पारमेबिलाइजेशन कदम के साथ माना जाता है जो साइटोप्लाज्मिक सामग्री को हटा देता है, जिसके बाद एक निर्धारण कदम होता है जो परमाणु सामग्रियों को ठीक करता है। ट्यूबल्स को फिर अलग किया जाता है, सेल निलंबन साइटोस्पन है, और कोशिकाएं स्लाइड्स का पालन करती हैं। यह विधि उपनकीय संरचनाओं का पता लगाने के प्रति संवेदनशीलता में सुधार करती है और सिटू संकरण (मछली) में इम्यूनोफ्लोरेसेंस, डीएनए और आरएनए फ्लोरेसेंस और इन डिटेक्शन विधियों के संयोजन के लिए लागू होती है। 3 डी स्लाइड विधि के संभावित अनुप्रयोग के उदाहरण के रूप में, एक खाट-1 आरएनए मछली नवजात आरएनए का पता लगाने के लिए दिखाया गया है। 3 डी स्लाइड विधि वृषण रोगाणु कोशिका भेदभाव के दौरान क्रोमेटिन संरचना, डीएनए और आरएनए के बीच स्थानिक संबंधों की विस्तृत जांच की सुविधा प्रदान करेगी।
Introduction
टेस्ट में, रोगाणु कोशिकाएं मेयोसिस के माध्यम से डिप्लॉयड शुक्राणुओं से परिपक्व, हैप्लॉयड शुक्राणुटोजोआ में अंतर करती हैं। इस प्रक्रिया के दौरान, रोगाणु कोशिकाओं की परमाणु क्रोमेटिन संरचना लगातार और गतिशील रूप से फिर से तैयार की जाती है। सतह फैलता आमतौर पर व्यक्तिगत शुक्राणुओं की कोशिकाओं की साइटोलॉजिकल परीक्षा के लिए उपयोग किया जाता है। सतह के प्रसार की एक प्रचलित विधि हाइपोटोनिक उपचार को नियोजित करती है जिसके द्वारा अलग - अलग शुक्राणुओं की कोशिकाएं फैलती हैं और 1 को समतल कियाजाताहै । ये स्थितियां मेयोटिक गुणसूत्रों के विस्तृत विश्लेषण के लिए इष्टतम हैं। इस विधि का उपयोग करके सिनैप्टिक स्थिति और पुनर्संयोजन फोसी जैसी गुणसूत्र विशेषताएं आसानी से देखी जाती हैं। हालांकि, हाइपोटोनिक उपचार उपन्यूक्लियर क्रोमेटिन वास्तुकला को बाधित करता है, इस प्रकार यह तकनीक नाभिक के संरचनात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है। नतीजतन, वृषण रोगाणु कोशिकाओं की त्रि-आयामी क्रोमेटिन संरचना को संरक्षित करने के लिए एक बेहतर विधि तैयार की गई है। इस विधि को त्रि-आयामी (3डी) स्लाइड विधि(चित्रा 1)कहा गया है। 3डी स्लाइड विधि ने नाभिक में नवजात आरएनए स्थानीयकरण का पता लगाने में सक्षम बनाया है क्योंकि इसे शुरू में सीटू संकरण (मछली)2,3में आरएनए फ्लोरेसेंस द्वारा वृषण रोगाणु कोशिका भेदभाव के दौरान जीन अभिव्यक्ति और क्रोमेटिन राज्यों की जांच करने के लिए अनुकूलित किया गया था। यह 3 डी विधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस, डीएनए और आरएनए फिश के संयोजन पर भी लागू होती है। इसके अतिरिक्त, इस विधि ने पोस्टमेयोटिक सेक्स क्रोमेटिन (पीएमएससी) की खोज में सहायता की है, जो पोस्टमेयोटिक शुक्राणुओं में पाए जाने वाले सेक्स गुणसूत्रों का एक मूक डिब्बाहै 2।
3 डी स्लाइड विधि मूल रूप से आमतौर पर परमाणु धुंधला के लिए इस्तेमाल स्लाइड तैयारी के दो आवश्यक चरणों के संयोजन के माध्यम से अनुकूलित किया गया था: निर्धारण के लिए परमाणु सामग्री को ठीक करने के लिए डिज़ाइन किया गया कदम और पारमेपन कदम के लिए साइटोप्लाज्मिक सामग्री को दूर करने के लिए इस तरह के एंटीबॉडी और मछली जांच के रूप में धुंधला अभिवात की पहुंच में सुधार करने के लिए । जैसा कि पहले एक अन्य प्रकाशन3में वर्णित है, यह निर्धारित किया गया है कि कम साइटोप्लाज्मिक पृष्ठभूमि के साथ इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए पारमेबिलाइजेशन चरण को निर्धारण चरण से पहले होना चाहिए। इस 3 डी स्लाइड विधि में, परमेबिलाइजेशन चरण और बाद में निर्धारण चरण सीधे अर्धनिफेरस ट्यूबल पर किया जाता है और इसके बाद स्लाइड पर साइटोस्पिनिंग से पहले संदंश के साथ रोगाणु कोशिकाओं के यांत्रिक वियोजन होते हैं। शुक्राणुओं की कोशिकाओं की आरएनए मछली के लिए एक वैकल्पिक विधिदूसरीप्रयोगशाला में विकसित की गई थी । इस विधि में, 3 डी विधि के अनुरूप, पारमेबिलाइजेशन चरण को आरएनए मछली के इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए निर्धारण चरण से पहले होना चाहिए।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल 3 डी स्लाइड विधि का वर्णन करता है और परमाणु नवजात आरएनए का पता लगाने के लिए संभावित आवेदन, खाट-1 आरएनए मछली का एक उदाहरण प्रदान करता है। खाट-1 डीएनए में जीनोम में दोहराव वाले तत्व होते हैं। यहां, एक खाट-1 डीएनए जांच नवजात प्रतिलिपियों के एक इंट्रॉन और यूटीआर के लिए संकरित है, जिससे नाभिक5,6में प्रतिलेखन रूप से सक्रिय क्षेत्रों का पता लगाया जाता है। क्रोमेटिन वास्तुकला के बीच स्थानिक संबंधों की विस्तृत जांच प्राप्त करने के लिए 3 डी स्लाइड बहुमुखी हैं और इम्यूनोफ्लोरेसेंस, डीएनए और आरएनए फिश तकनीकों के संयोजन के लिए लागू की जा सकती हैं।
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Protocol
1.3D स्लाइड तैयारी
- निम्नलिखित अभिकर् ता तैयार करें:
- सीएसके बफर: 100 एमएम एनएसीएल, 300 एमएम सुक्रोज, 10 एमएम पाइप, 3 एमएम एमजीसीएल2। पीएच को 1 एम नाओएच के साथ 6.8 पर समायोजित करें। सीएसके बफर को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- सीएसके बफर 0.5% ट्राइटन एक्स-100 के साथ: ट्राइटन एक्स-100 से 40 मिलीलीटर सीएसके बफर के 200 माइक्रोल जोड़ें। ट्राइटन एक्स-100 पूरी तरह से भंग हो जाने तक चुंबकीय रक्षित का उपयोग करके समाधान मिलाएं। सीएसके बफर को 05% ट्राइटन एक्स-100 के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) - पीबीएस, पीएच 7.4: लगभग 70-80 मिलीलीटर पानी में पीएफए के 4 ग्राम को भंग करें। भंग करने की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए, लगभग 20 माइक्रोन 4 एन नाओएच जोड़ें और समाधान को 60 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखें जब तक कि पीएफए पूरी तरह से भंग न हो जाए और समाधान पारदर्शी न हो जाए। इस प्रक्रिया में लगभग 1 घंटा लगता है। पीएफए पूरी तरह से भंग होने के बाद, 10x पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें। अंतिम मात्रा को पानी के साथ 100 मिलीलीटर तक समायोजित करें और कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) के समाधान को ठंडा करें। प्रत्येक नए प्रयोग के लिए ताजा तैयार समाधान का उपयोग करें।
नोट: सभी पशु कार्य के लिए संस्थागत अनुमति प्राप्त करें और प्रासंगिक पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करें।
- पुरुष चूहों को इच्छामृत्यु। संदंश और कैंची का उपयोग करके, माउस से टेस्टिस को उत्पादित करें। टेस्टिस को पीबीएस (या आरपीएमआई 1640) में रखें। टेस्टिस को हटाने के बाद, आरएनए के क्षरण को रोकने के लिए जल्दी से निम्नलिखित चरण 1.3-1.4 करें।
- एक छोटे पेट्री डिश पर टेस्टिस को टूटना और ट्यूनिका अल्बुगिया कोहटा दें । संदंश का उपयोग कर बर्फ पर पीबीएस में अर्धनिफेरस ट्यूबल सुलझाना।
- संदंश का उपयोग करके, कई ट्यूबल (ट्यूबल के कई टुकड़े लगभग 5-10 मिमी लंबाई में) को 4-अच्छी तरह से डिश के एक कुएं में स्थानांतरित करें जिसमें सीएसके बफर + 0.5% ट्राइटन एक्स-100 बर्फ पर होता है, और 6 मिनट के लिए इनक्यूबेट होता है। सीएसके बफर के लिए ओवरएक्सपोजर के परिणामस्वरूप कोशिकाओं में व्यवधान हो सकता है।
- संदंश का उपयोग करके, सभी ट्यूबलों को 4%पीएफए-पीएफबी समाधान वाले 4-अच्छी तरह से पकवान के एक कुएं में स्थानांतरित करें। इस चरण को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के बिना प्रीफॉर्म किया जा सकता है, लेकिन वैकल्पिक रूप से इसका उपयोग किया जा सकता है। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट। साथ ही इनक्यूबेशन अवधि के दौरान 12 साइटोस्पिन कक्षों की तैयारी शुरू करें।
- संदंश का उपयोग करके, सभी ट्यूबलों को पीबीएस युक्त 4-अच्छी तरह से पकवान के एक कुएं में स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
- एक ग्लास स्लाइड के पीछे, सभी ट्यूबल को पीबीएस के 30 माइक्रोल में स्थानांतरित करें (स्लाइड के शीर्ष को cationic चार्ज के कारण टाला जाना चाहिए)। दो संदंश के सुझावों का उपयोग करना, टुकड़ों को ट्यूबल फाड़ें। दो संदंश के सुझावों के बीच ट्यूबलों को क्लिप करके एक क्षैतिज दिशा में ट्यूबल काट लें और संदंश को क्षैतिज रूप से खींच लें। लगभग 10-20 सेकंड के लिए इस कदम के साथ जारी रखें।
- P20 पिपेट का उपयोग करके निलंबन को मिलाएं।
- निलंबन को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, पीबीएस के साथ लगभग 1.3 मिलीलीटर तक पतला करें। 12 साइटोस्पिन कक्षों (1.2 मिलीलीटर कुल) में से प्रत्येक पर निलंबन के 100 माइक्रोन लागू करें। इस कदम पर, कोशिकाओं की एकाग्रता को निर्धारित करने की आवश्यकता नहीं है।
- साइटोस्पिन कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 2,000 आरपीएम पर नमूने। साइटोस्पिनिंग के बाद, कमरे के तापमान पर कुछ मिनट के लिए लैब बेंच पर सूखी स्लाइड। स्लाइड के बाद कुछ मिनटों के लिए पूरी तरह से सूखने की अनुमति दी गई है, अगले कदम पर जाएं ।
- पीबीएस युक्त एक Coplin जार का उपयोग करना, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए स्लाइड धो ।
- 70% इथेनॉल वाले कोप्लिन जार में स्लाइड स्थानांतरित करें और आरएनए मछली की शुरुआत से पहले कम से कम 2 मिनट इंतजार करें। स्लाइड 4 डिग्री सेल्सियस पर 70% इथेनॉल में कुछ हफ्तों के लिए स्थिर हैं। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, 2 मिनट के लिए कॉपलिन जार में 80% और 100% इथेनॉल के साथ सीरियल उपचार का उपयोग करके निर्जलित स्लाइड और हवा-सूखी पूरी तरह से स्लाइड को निर्जलित करती है। एक स्लाइड बॉक्स में -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
2. कॉट-1 डीएनए जांच की तैयारी रैंडम प्राइमिंग द्वारा
- निम्नलिखित अभिकर् ता तैयार करें:
- संकरण बफर: 900 मिलीलीटर संकरण बफर स्टॉक तैयार करने के लिए आगे बढ़ने वाले घटकों को मिलाएं; इस समाधान का उपयोग स्टॉक जांच के लिए किया जाएगा। यह संकरण बफर स्टॉक संकरण से पहले आरएनएसई अवरोधक समाधान (रिबोन्यूक्लिकोसाइड वानाडिल कॉम्प्लेक्स) की 10% मात्रा को शामिल करने की अनुमति देता है।
संकरण से पहले, अंतिम एकाग्रता से मेल खाने के लिए संकरण बफर स्टॉक में 200 एमएम रिबोन्यूक्लिडोसाइड वानाडिल कॉम्प्लेक्स या पानी के 1/10 वोल जोड़ें। -20 डिग्री सेल्सियस पर, यह मिश्रण एक वर्ष से अधिक समय तक स्थिर है।घटक राशि (माइक्रोन) अंतिम एकाग्रता फॉर्ममाइड 500 50% (v/v) 50% डेक्सट्रान 200 10% (w/v) 20x एसएससी 100 2x 1% बीएसए 100 0.1% - 20x एसएससी: लगभग 800 मिलीलीटर पानी में 88.2 ग्राम सोडियम साइट्रेट और 175.3 ग्राम नैसीएल को भंग करें। पीएच को 1 एम एचसीएल की कुछ बूंदों का उपयोग करके 7.0 तक समायोजित करें। अंतिम मात्रा को ऑटोक्लेविंग द्वारा 1 एल स्टरलाइज करने के लिए समायोजित करने के लिए पानी जोड़ें। तैयारी के बाद, 20x एसएससी कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- 50% (w/v) डेक्सट्रान: पानी हिलाएं और धीरे-धीरे 50 ग्राम डेक्सट्रान सल्फेट जोड़ें। कमरे के तापमान पर रात भर सरगर्मी रखें। अंतिम मात्रा को 100 मिलीलीटर में समायोजित करने के लिए पानी जोड़ें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
- संकरण बफर: 900 मिलीलीटर संकरण बफर स्टॉक तैयार करने के लिए आगे बढ़ने वाले घटकों को मिलाएं; इस समाधान का उपयोग स्टॉक जांच के लिए किया जाएगा। यह संकरण बफर स्टॉक संकरण से पहले आरएनएसई अवरोधक समाधान (रिबोन्यूक्लिकोसाइड वानाडिल कॉम्प्लेक्स) की 10% मात्रा को शामिल करने की अनुमति देता है।
- नीचे सूचीबद्ध निम्नलिखित घटकों को पीसीआर ट्यूब में जोड़ें। पीसीआर मशीन का उपयोग करके, 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए समाधान को मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
घटक प्रतिक्रिया प्रति राशि (μl) आखिरी खाट-1 डीएनए: 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर 1 1 माइक्रोग्राम रैंडम 9मर प्राइमर (किट से) 10 पानी 27 - मध्यकेंद्रित्र संक्षेप में और बर्फ पर जगह है।
- निम्नलिखित घटकों को जोड़ें। पीसीआर मशीन का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मिक्स और इनक्यूबेट करें। (उपयोग की गई किट के विवरण के लिए अभिकर् ती और उपकरणों की तालिका देखें)।
घटक प्रतिक्रिया प्रति राशि (μl) अंतिम एकाग्रता मिश्रण चरण 2.2 से तैयार 38 5x न्यूक्लियोटाइड बफर (किट से) 9.2 Cy3-dUTP (1 mM) 0.8 16 माइक्रोन Klenow (किट से) 2 - प्रतिक्रिया को बंद करने के लिए स्टॉप बफर (किट से) के 2 माइक्रोन जोड़ें।
- माइक्रोस्पिन कॉलम का उपयोग करके रोकी गई प्रतिक्रिया को शुद्ध करें।
- शुद्ध अंश में हेरिंग शुक्राणु डीएनए (टेम्पलेट कॉट-1 डीएनए से 50 गुना अधिक) के 50 माइक्रोन (5 माइक्रोन) जोड़ें।
- पिपेट का उपयोग करके कुल मात्रा को मापें। 4 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोसेंट्रफ्यूज का उपयोग करके अधिकतम गति (17,000 x ग्राम) पर 15 मिनट के लिए 100% इथेनॉल और 0.1x वॉल्यूम 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच 5.2) की 0.1x मात्रा जोड़ें।
- तरल निकालें, और 70% इथेनॉल के 200 माइक्रोन जोड़ें, 4 डिग्री सेल्सियस पर अधिकतम गति से 5 मिनट के लिए अच्छी तरह से और अपकेंद्रित्र मिलाएं।
- अतिरिक्त तरल निकालें। कमरे के तापमान पर 10-30 मिनट के लिए वर्षा सूखी।
- संकरण बफर स्टॉक के 20 माइक्रोन में गोली को भंग करें। क्योंकि गोली को अक्सर भंग करना मुश्किल होता है, बार-बार पिपेट। एक वैकल्पिक विकल्प के रूप में, एक भंवर मिक्सर का उपयोग पैलेट को कुशलतापूर्वक भंग करने के लिए भी किया जा सकता है। जांच का उपयोग होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
3. खाट-1 आरएनए मछली
- नीचे सूचीबद्ध घटकों को पीसीआर ट्यूब में जोड़ें। एक पीसीआर मशीन का उपयोग करना, 80 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट, 42 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 10-30 मिनट का एक पूर्वनैनिंग कदम के बाद। संकरण होने तक 42 डिग्री सेल्सियस पर रखें। राइबोन्यूकोसाइड वानाडिल कॉम्प्लेक्स वैकल्पिक है; इसे पानी से बदला जा सकता है।
घटक प्रतिक्रिया प्रति राशि (μl) आखिरी खाट-1 डीएनए जांच (५० एनजी/μl) 2 100 एनजी राइबोन्यूकोसाइड वानाडिल कॉम्प्लेक्स (200 mM) 2 20 एमएमएम संकरण बफर 20 में जोड़ा गया - एक कॉप्लिन जार में डिहाइड्रेट स्लाइड जिसमें 2 मिनट के लिए 80% इथेनॉल होता है, इसके बाद एक कोप्लिन जार जिसमें 2 मिनट के लिए 100% इथेनॉल होता है। कमरे के तापमान पर लैब बेंच पर पूरी तरह से सूखी स्लाइड।
- पहले से 42 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक टिप बॉक्स कक्ष (2-3 सेमी पानी से भरा) पहले से गरम करें। स्लाइड टिप बॉक्स चैंबर पर रखें। संक्षेप में पूर्वनिटेड जांच और पिपेट को निर्जलित स्लाइडों पर सीधे अपकेंद्री करें। बुलबुले बनाने से बचें। धीरे-धीरे स्लाइड को कवर स्लिप से कवर करें।
- 42 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे से रात भर (14-15 घंटे) के लिए हाइब्रिड।
- कॉप्लिन जार (2x एसएससी और 50% फॉर्ममाइड दोनों के साथ दो जार, और 2x एसएससी के साथ दो जार) में वॉश समाधान तैयार करें। पानी के स्नान में 30 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट करें।
- स्लाइड के किनारे से कवर स्लिप को हटाने के लिए रेजर ब्लेड का इस्तेमाल करें। नमूनों को खरोंचने से बचें। 45 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2x एसएससी और 50% फॉर्ममाइड युक्त कोप्लिन जार में स्लाइड धोएं। इस स्टेप को एक बार दोहराएं।
- 45 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2x एसएससी युक्त कोप्लिन जार में स्लाइड धोएं। इस स्टेप को एक बार दोहराएं।
- आगे की स्लाइड्स में देखें दापी-माउंटिंग मीडिया के 20 माइक्रोन और कवर स्लिप के साथ कवर करें। अतिरिक्त बढ़ते मीडिया को हटाने के लिए धीरे-धीरे कवर ग्लास दबाएं। ऊतक की सफाई के साथ अतिरिक्त बढ़ते मीडिया दाग। स्लाइड्स में है माइक्रोस्कोपी मूल्यांकन के लिए तैयार।
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Representative Results
3डी स्लाइड का एक प्रतिनिधि परिणाम चित्र 2 में दिखाया गयाहै । इस प्रयोग में, कॉट-1 आरएनए फिश को एंटी CBX1 और γH2AX एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोस्टेपिंग के साथ नवजात प्रतिलेखन का पता लगाने के लिए किया गया था। आरएनए फिश और इम्यूनोस्टेनिंग को मिलाने के लिए, पहले इम्यूनोस्टेटिंग किया गया था, इसके बाद आरएनए फिश द्वारा3में वर्णित किया गया था। CBX1 एक हेट्रोक्रोमोमाटिन प्रोटीन है जो मेयोसिस में पेरिसेन्ट्रोमेरिक हेट्रोक्रोमीटरटिन और साइलेंट सेक्स गुणसूत्रों को स्थानीयता देता है जिसे एक्सी बॉडी (या सेक्स बॉडी) कहा जाता है। γH2AX हिस्टोन वैरिएंट एच2एक्स का फॉस्फोरिलेटेड रूप है और एक्सवाई बॉडी पर स्थानीयता है। इस तस्वीर में, कॉट-1 संकेत यूक्रोमैटिक क्षेत्रों पर जमा होते हैं, लेकिन परिष्कारिक हेट्रोक्रोमेटिन और एक्सवाई शरीर से बाहर रखा गया है।
सतह प्रसार की तैयारी के दौरान, हाइपोटोनिक समाधान के साथ उपचार नाभिक को बढ़ाता है और शारीरिक रूप से उपनैरक संरचनाओं का विस्तार करता है। मेयोटिक अध्ययन के लिए यह प्रचलित विधि एक जेड-प्लेन1में सभी मेयोटिक गुणसूत्रों को कैप्चर करने के लिए सबसे उपयुक्त है। हाइपोटोनिक उपचार के बाद 3डी स्लाइड विधि और सतह फैलने के बीच अंतर को स्पष्ट करने के लिए, प्रत्येक प्रयोग के पाचिटीन शुक्राणुओं के प्रतिनिधि चित्रों को एक एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप(आंकड़े 2A और 2B)का उपयोग करके समान आवर्धन का उपयोग करके दिखाया गया है। हाइपोटोनिक समाधान के साथ इलाज की सतह फैलता है, त्रि-आयामी गुणसूत्र संरचना बाधित होती है और सभी मेयोटिक गुणसूत्र कुल्हाड़ियों को एक जेड-प्लेन के भीतर कैप्चर किया जा सकता है। 3डी स्लाइड तैयारी, हालांकि, बरकरार क्रोमेटिन संरचना को बरकरार रखता है।
चित्रा 1. 3 डी स्लाइड विधि की योजनाबद्ध। 3 डी स्लाइड विधि त्रि-आयामी क्रोमेटिन संरचना को संरक्षित कर सकती है। स्लाइड की त्रि-आयामी प्रकृति के कारण, एक नाभिक को कवर करने के लिए कई जेड-सेक्शन के साथ डेटा अधिग्रहण की आवश्यकता होती है।
चित्रा 2। 3 डी स्लाइड विधि और सतह के बीच तुलना एक ही आवर्धन पर हाइपोटोनिक उपचार के बाद फैलता है। (ए)3डी स्लाइड का उपयोग करके, कॉट-1 आरएनए फिश (cy3) और एंटी CBX1 (फिटसी) और γH2AX (cy5) एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेटिंग किया जाता है। एक जेड-सेक्शन के साथ एक पैचिटेन स्पर्मेटोसाइट दिखाया गया है। (ख)सतह फैलता का उपयोग कर, विरोधी SCP3 और γH2AX एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोदाता प्रदर्शन कर रहे हैं । एक पैचिटेन शुक्राणुओं को दिखाया गया है। हलकों: XY शरीर। सलाखों: 10 μm।
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Discussion
3डी स्लाइड तैयारी में, पारमेबिलाइजेशन चरण निर्धारण चरण से पहले है। ये कदम सीधे अर्धनिफेरस ट्यूबलों पर किए जाते हैं, जिससे त्रि-आयामी क्रोमेटिन संरचना का संरक्षण होता है। आरएनए/डीएनए फिश के लिए क्रोमेटिन संरचना को संरक्षित करने का एक वैकल्पिक विकल्प पारमेबिलाइजेशन स्टेप और फिक्सेशन स्टेप को एक साथ करना है । यह वैकल्पिक तकनीक मार्सुपियल रोगाणु कोशिकाओं और माउस प्रीइम्प्लांटेशन भ्रूण7,8में की गई है । हालांकि, यदि निर्धारण चरण पारमेबिलाइजेशन चरण से पहले है, तो यह उच्च साइटोप्लाज्मिक पृष्ठभूमि को जन्म दे सकता है। इसलिए, आरएनए और डीएनए मछली के लिए स्लाइड अनुकूलन का महत्वपूर्ण निर्धारक पारमेबिलाइजेशन और निर्धारण चरणों के क्रम पर निर्भर करता है। पारमेबिलाइजेशन स्टेप की अवधि भी स्लाइड तैयारी के अनुकूलन के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है। इस विधि के लिए छह मिनट सामान्य स्थिति है। हालांकि, इसका उपयोग की जाने वाली सामग्रियों की भिन्नता के आधार पर इसे समायोजित किया जा सकता है।
त्रि-आयामी क्रोमेटिन संरचना का संरक्षण 3डी स्लाइड की एक विशेषता है जो इसे सतह प्रसार स्लाइड से अलग करती है। यह लाभ गुणसूत्र प्रसार की तैयारी से बहुत अलग है। 3 डी स्लाइड विधि त्रि-आयामी क्रोमेटिन संरचना को बरकरार रखता है, लेकिन पूरे नाभिक को शामिल करने के लिए कई जेड-सेक्शन के साथ डेटा अधिग्रहण की आवश्यकता होती है। एक एकल जेड-सेक्शन नाभिक के सभी संकेतों को कैप्चर नहीं कर सकता है। इस प्रकार, कई जेड-वर्गों की आवश्यकता इस विधि की एक प्रमुख सीमा है। एक ही जेड-सेक्शन में नाभिक को पकड़ने के लिए, सतह फैलने का एक फायदा होता है। इसलिए, 3 डी विधि और सतह प्रसार तैयारी के अलग फायदे हैं और एमियोसिस और शुक्राणुओं के अध्ययन के लिए एक-दूसरे की विशेषताओं की पारस्परिक रूप से भरपाई करते हैं।
3 डी स्लाइड विधि को अंडकोष के भीतर पाए जाने वाले सभी सेल प्रकारों पर लागू किया जा सकता है, जिसमें शुक्राणुओं, गोल शुक्राणुओं और सेर्टोली कोशिकाओं शामिल हैं। इस विधि को मेयोटिक सेक्स गुणसूत्र निष्क्रियता की शुरुआत में सेक्स गुणसूत्रों के गुणसूत्रों के गुणसूत्रों की जांच करने और पीएमएससी10पर एपिजेनेटिक संशोधनों की जांच करने के लिए भी लागू किया गया है। भविष्य के अनुप्रयोगों के संदर्भ में, इस विधि को अन्य ऊतकों या कोशिकाओं पर लागू किया जा सकता है। यदि हां, तो यह सिफारिश की जाती है कि पारमेबिलाइजेशन चरण निर्धारण चरण से पहले है। वैकल्पिक रूप से, पारमेबिलाइजेशन चरण और निर्धारण चरण एक साथ किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखक के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
मैं इस परियोजना के पर्यवेक्षण के लिए जैनी टी ली शुक्रिया अदा करता हूं जब मैं पांडुलिपि संपादन के लिए ली प्रयोगशाला और टायलर Broering में था । इस काम को मार्च ऑफ डाइम्स फाउंडेशन और एनआईएच ग्रांट GM098605 से तुलसी ओ कॉनर स्टार्टर स्कॉलर अवार्ड द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | |
| Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit | Agilent | 300380 | |
| Herring sperm DNA Solution | Invitrogen | 15634-017 | |
| Ethanol. 200 proof (absolute) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Formamide deionized | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Lifeblood Medical | 77110-100 | |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D6001 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | A10491-01 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 76240 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | |
| Illustra MicroSpin G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Forceps | VWR | 300-050 | |
| Microcentrifuge tubes | Bioexpress | C-3262-1 | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| Coplin Jar | Fisher | 08-815 | |
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| 4-well dish | Fisher | 12-566-301 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Air incubator | Revolutionary Science | RS-IF-203 |
References
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Namekawa, S. H., et al. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr Biol. 16, 660-667 (2006).
- Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
- Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis. Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).
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- Huynh, K. D., Lee, J. T. Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos. Nature. 426, 857-862 (2003).
- Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).
- Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse. Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).
- Ichijima, Y., et al. MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells. Genes Dev. 25, 959-971 (2011).
- Sin, H. S., et al. RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids. Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).
