Summary
여기서 물질은 고환 세균 세포의 3차원 크로마틴 구조를 보존하기 위해 개발된 방법을 설명한다. 이를 3차원(3D) 슬라이드 방법이라고 합니다. 이 방법은 비핵화 구조의 검출을 위한 감도를 향상시키고, 시상 혼성화(FISH)에서 면역형광, DNA 및 RNA 형광에 적용가능하다.
Abstract
고환 세균 세포 분화 하는 동안, 핵 크로마틴의 구조는 동적으로 변경. 다음은 마우스에서 발견되는 고환 세균 세포의 3차원 크로마틴 배열을 보존하도록 설계된 방법을 설명합니다. 이 방법은 3차원(3D) 슬라이드 방법으로 불려졌다. 이 방법에서 고환 튜블러는 세포질 물질을 제거하는 투과화 단계로 직접 처리되고 핵 물질을 고치는 고정 단계가 뒤따릅니다. 튜블러는 그 때 해리되고, 세포 현탁액은 시토스펀이고, 세포는 슬라이드에 부착됩니다. 이 방법은 비핵화 구조의 검출에 대한 민감도를 향상시키고, 시상 혼성화(FISH)와 이러한 검출 방법의 조합에서 면역형광, DNA 및 RNA 형광에 적용가능하다. 3D 슬라이드 방법의 가능한 적용의 예로, Cot-1 RNA FISH는 초기 RNA를 검출하는 것으로 나타났다. 3D 슬라이드 방법은 고환 세균 세포 분화 중에 크로마틴 구조, DNA 및 RNA 사이의 공간 적 관계의 상세한 검사를 용이하게 할 것이다.
Introduction
고환에서, 생식 세포는 성숙으로 meiosis를 통해 diploid 정자고니아에서 분화, haploid 정자. 이 과정에서 세균 세포의 핵 크로마틴 구조는 지속적으로 동적으로 리모델링됩니다. 표면 확산은 일반적으로 개별 정자 생성 세포의 세포학적 검사에 사용됩니다. 표면 확산의 지배적인 방법은 개별 적인 정자 세포가 퍼지고 1을 평평하게 하는 저혈압 처리를채택합니다. 이 조건은 메이오성 염색체의 상세한 분석에 최적입니다. 시냅스 상태 및 재조합 포시와 같은 염색체 기능은 이 방법을 사용하여 쉽게 관찰된다. 그러나, 저혈압 처리는 핵 염색체 건축을 방해합니다, 따라서 이 기술은 핵의 구조분석에 적합하지 않습니다. 따라서, 향상된 방법은 고환 세균 세포의 3차원 크로마틴 구조를 보존하도록 설계되었습니다. 이 방법은 3차원(3D) 슬라이드방법(도 1)으로지칭되었다. 상기 3D 슬라이드 방법은 시상 혼성화(FISH)2,3에서RNA 형광에 의한 고환 세균 세포 분화 시 유전자 발현 및 크로마티닌 상태를 검사하도록 최적화되었기 때문에 핵에서 초기 RNA 국소화의 검출을 가능하게 하였다. 이 3D 방법은 면역 형광, DNA 및 RNA FISH의 조합에도 적용됩니다. 추가적으로, 이 방법은 포스트 메이오틱 성 크로마틴 (PMSC)의 발견에 도움이되었습니다, 포스트 meiotic 정자2에서발견 된 성 염색체의 조용한 구획.
3D 슬라이드 방법은 원래 핵 염색에 일반적으로 사용되는 슬라이드 제제의 두 가지 필수 단계의 조합을 통해 최적화되었다: 핵 물질을 고치기 위한 고정 단계와 세포질 물질을 제거하기 위한 투과성 단계, 항체 및 FISH 프로브와 같은 염색 시약의 접근성을 향상시키기 위한 것입니다. 앞서 다른 간행물3에설명된 바와 같이, 투과성 단계는 낮은 세포질 배경으로 최적의 결과를 얻기 위해 고정 단계에 선행되어야 한다고 판단되었다. 이 3D 슬라이드 방법에서, 투과 단계 및 후속 고정 단계는 반열관에서 직접 수행되며, 슬라이드에 사이토스피닝하기 전에 포셉을 가진 세균 세포의 기계적 해리에 선행된다. 정자 세포의 RNA FISH에 대한 대체 방법은 다른 실험실4에서개발되었다. 이 방법에서, 3D 방법과 일치, 침투 단계는 RNA FISH의 최적의 결과를 얻기 위해 고정 단계 앞에 있어야합니다.
다음 프로토콜은 3D 슬라이드 방법을 설명하고 핵 초기 RNA의 검출을 위한 가능한 응용 프로그램인 Cot-1 RNA FISH의 예를 제공한다. Cot-1 DNA는 게놈에 있는 반복적인 요소로 이루어져 있습니다. 여기서, Cot-1 DNA 프로브는 초기 성적증명서의 인트론 및 UTR에 혼성화되어 핵5,6에서전사 활성 영역을 검출한다. 3D 슬라이드는 다재다능하며 크로마틴 아키텍처 간의 공간 적 관계에 대한 상세한 검사를 얻기 위해 면역 형광, DNA 및 RNA FISH 기술의 조합에 적용 될 수 있습니다.
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Protocol
1.3D 슬라이드 준비
- 다음 시약을 준비합니다.
- CSK 버퍼: 100 mM NaCl, 300 mM 자당, 10 mM 파이프, 3 mM MgCl2. pH를 1M NaOH로 6.8로 조정합니다. CSK 버퍼를 4°C에 저장합니다.
- 0.5% 트리톤 X-100을 가진 CSK 버퍼: 트리톤 X-100 ~ 40ml의 200 μl을 CSK 버퍼를 추가합니다. 트리톤 X-100이 완전히 용해될 때까지 자기 교반기로 용액을 섞습니다. CSK 버퍼를 0.5% 트리톤 X-100을 4°C에 저장합니다.
- 4% 파라포름알데히드(PFA)-PBS, pH 7.4: 약 70-80ml의 물에 PFA 4 g을 녹입니다. 용해 과정을 촉진하기 위해, 4 N NaOH의 약 20 μl을 추가하고 PFA가 완전히 용해되고 용액이 투명해질 때까지 60 °C에서 수조에 용액을 유지합니다. 이 프로세스는 약 1 시간이 걸립니다. PFA가 완전히 용해 된 후 10x PBS 10ml를 추가하십시오. 최종 부피를 물로 100ml로 조정하고 용액을 실온(25°C)으로 식힙니다. 새로 준비된 솔루션을 각 새로운 실험에 사용합니다.
참고: 모든 동물 작업에 대한 제도적 허가를 받고 관련 동물 관리 지침을 준수합니다.
- 수컷 마우스를 안락사시합니다. 집게와 가위를 사용하여 마우스에서 고환을 소비합니다. PBS(또는 RPMI 1640)에 고환을 배치합니다. 고환제거 후 RNA의 분해를 방지하기 위해 다음 단계 1.3-1.4를 신속하게 수행한다.
- 작은 페트리 접시에 고환을 파열하고 튜니카 알부진을제거합니다. 집게를 사용하여 얼음에 PBS에서 반열관을 해명.
- 집게를 사용하여 여러 튜블러(길이 약 5-10mm)를 CSK 버퍼 500ml + 얼음 위에 0.5% 트리톤 X-100이 들어 있는 4웰 접시 한 웰로 옮기고 6분 동안 배양합니다. CSK 버퍼에 과도하게 노출되면 셀이 중단될 수 있습니다.
- 집게를 사용하여 모든 튜블을 4% PFA-PBS 용액이 들어 있는 4웰 접시한 웰로 옮직합니다. 이 단계는 스테레오 현미경없이 미리 형성 될 수 있지만, 선택적으로 사용할 수 있습니다. 실온에서 10분 동안 배양하십시오. 동시에 잠복 기간 동안 12 개의 사이토 스핀 챔버를 준비하기 시작합니다.
- 집게를 사용하여 모든 튜블을 PBS가 함유된 4웰 요리의 우물로 옮기습니다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오.
- 유리 슬라이드의 뒷면에, PBS의 30 μl에 모든 튜비를 전송 (슬라이드의 상단은 양이온 충전으로 인해 피해야한다). 두 개의 집게의 끝을 사용하여, 조각으로 튜룰을 찢어. 두 개의 집게 끝 사이에 튜비를 클리핑하고 집게를 수평으로 당겨 서 튜블을 수평 방향으로 잘라. 약 10-20 초 동안이 단계를 계속하십시오.
- P20 파이펫을 사용하여 파이펫팅하여 서스펜션을 혼합합니다.
- 서스펜션을 미세원심분리기로 옮기고 PBS로 약 1.3ml로 희석한다. 12개의 사이토스핀 챔버(총 1.2ml)에 각각 100 μl의 현탁액을 적용합니다. 이 단계에서, 세포의 농도는 결정될 필요가 없습니다.
- Cytospin는 실온에서 10 분 동안 2,000 rpm에서 샘플을 스핀합니다. 사이토스피닝 후 실온에서 몇 분 동안 실험실 벤치에서 건조 슬라이드가 제공됩니다. 슬라이드가 몇 분 동안 완전히 건조 할 수 있게 된 후 다음 단계로 이동하십시오.
- PBS가 들어있는 코플린 항아리를 사용하여 실온에서 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오.
- 70% 에탄올을 함유한 코플린 항아리로 슬라이드를 옮기고 RNA FISH가 시작되기 전에 적어도 2분 이상 기다립니다. 슬라이드는 4 °C에서 70 % 에탄올에서 몇 주 동안 안정적입니다. 장기 보관을 위해 코플린 항아리에 80%와 100% 에탄올로 직렬 처리를 사용하여 탈수 슬라이드를 각각 2분 동안 사용하고 공기 건조는 슬라이드를 완전히 탈수합니다. 슬라이드 상자에 -80 °C에 보관하십시오.
2. 무작위 프라이밍에 의한 코트-1 DNA 프로브 준비
- 다음 시약을 준비합니다.
- 혼성화 버퍼: 진행 구성 요소를 혼합하여 하이브리드화 버퍼 스톡 900ml를 준비합니다. 이 솔루션은 프로브를 재고하는 데 사용됩니다. 이러한 혼성화 완충제 스톡은 혼성화 전에 RNase 억제제 용액(리보뉴클레오사이드 바나딜 복합체)의 10% 부피를 첨가할 수 있게 한다.
혼성화 전에, 최종 농도에 맞게 혼성화 버퍼 스톡에 200mM 리보뉴클레오사이드 바나딜 컴플렉스 또는 물의 1/10 vol을 추가한다. -20°C에서 이 혼합물은 1년 이상 안정적입니다.구성 요소 양(μl) 최종 농도 포르마미드 500 50% (v/v) 50% 더스네 200 10% (/v) 20x SSC 100 2x 1% BSA 100 0.1% - 20x SSC: 구연산나트륨 88.2g과 NaCl 175.3g을 약 800ml의 물에 녹입니다. 1 M HCl의 몇 방울을 사용하여 pH를 7.0으로 조정합니다. 준비 후, 20 x SSC는 실온에서 저장할 수 있습니다.
- 50% (w/v) Dextran: 물을 저어서 천천히 50g의 황산염을 넣습니다. 실온에서 밤새 저어주세요. 물을 추가하여 최종 볼륨을 100ml로 조정합니다. 실온에서 보관하십시오.
- 혼성화 버퍼: 진행 구성 요소를 혼합하여 하이브리드화 버퍼 스톡 900ml를 준비합니다. 이 솔루션은 프로브를 재고하는 데 사용됩니다. 이러한 혼성화 완충제 스톡은 혼성화 전에 RNase 억제제 용액(리보뉴클레오사이드 바나딜 복합체)의 10% 부피를 첨가할 수 있게 한다.
- PCR 튜브에 아래에 나열된 다음 성분을 추가합니다. PCR 기계를 사용하여 95°C에서 5분 동안 용액을 혼합하고 배양합니다.
구성 요소 반응당 양(μl) 결승전 코트-1 DNA: 1 mg/ml 1 1 μg 랜덤 9머 프라이머(키트에서) 10 물 27 - 원심분리기는 잠시 얼음 위에 놓습니다.
- 다음 구성 요소를 추가합니다. PCR 기계를 사용하여 37°C에서 30분 동안 혼합하고 배양합니다. (사용된 키트의 자세한 내용은 시약 및 장비 테이블을 참조하십시오).
구성 요소 반응당 양(μl) 최종 농도 2.2 단계에서 제조된 혼합물 38 5x 뉴클레오티드 버퍼(키트에서) 9.2 Cy3-dUTP (1mM) 0.8 16 μM 클레나우 (키트에서) 2 - 반응을 중단하려면 스톱 버퍼 2 μl(키트에서)을 추가합니다.
- 마이크로스핀 컬럼을 사용하여 중지된 반응을 정화합니다.
- 청어 정자 DNA (템플릿 Cot-1 DNA의 50 배 초과)의 50 μg (5 μl)를 정제 된 분획에 추가합니다.
- 파이펫을 사용하여 총 볼륨을 측정합니다. 0.7x 부피 100% 에탄올과 0.1x 부피 3M 아세테이트(pH 5.2),잘 섞고 원심분리기를 최대 속도(17,000 x g)로 4°C에서 사용하는 최대 속도(17,000 x g)로 섞는다.
- 액체를 제거하고 70 % 에탄올의 200 μl을 추가하고 4 °C에서 최대 속도로 5 분 동안 잘 혼합하고 원심 분리기를 섞습니다.
- 여분의 액체를 제거합니다. 실온에서 10-30 분 동안 침전을 건조시.
- 펠릿을 하이브리드화 버퍼 스톡의 20μl로 용해합니다. 펠릿은 용해하기가 어렵기 때문에 파이펫을 반복적으로 구사합니다. 대체 옵션으로, 소용돌이 믹서는 펠릿을 효율적으로 용해시키는 데 사용할 수도 있습니다. 프로브는 사용 전까지 -20°C로 보관할 수 있습니다.
3. 코트-1 RNA 물고기
- 아래에 나열된 구성 요소를 PCR 튜브에 추가합니다. PCR 기계를 사용하여 80 °C에서 10 분 동안 배양하고 42 °C에서 약 10-30 분의 사전 단계로 배양합니다. 혼성화 될 때까지 42 °C에서 유지하십시오. 리보뉴클레오사이드 바나딜 컴플렉스는 선택 사항입니다. 물로 대체 할 수 있습니다.
구성 요소 반응당 양(μl) 결승전 Cot-1 DNA 프로브 (50 ng/μl) 2 100 ng 리보뉴클레오사이드 바나딜 컴플렉스 (200mMM) 2 20mM 하이브리드화 버퍼 20에 추가 - 코플린 항아리에 80% 에탄올이 들어 있는 탈수 슬라이드가 2분 동안 100% 에탄올을 함유한 코플린 항아리가 2분 동안 들어오게 됩니다. 실온에서 실험실 벤치에 완전히 건조 슬라이드.
- 팁 박스 챔버 (물 2 -3cm로 채워진)를 42 °C 인큐베이터에서 미리 예열합니다. 팁 박스 챔버에 슬라이드를 놓습니다. 미리 된 프로브와 파이펫을 탈수 슬라이드에 직접 원심 분리합니다. 거품을 하지 마십시오. 커버 슬립으로 슬라이드를 부드럽게 덮습니다.
- 42°C에서 하룻밤(14-15시간)까지 6시간 동안 혼성화한다.
- 코플린 항아리 (2 x SSC와 50 % 포르마이드모두 2 개의 항아리, 2 배 SSC가있는 2 개의 항아리)에서 세척 솔루션을 준비하십시오. 수조에서 30 분 동안 42 °C에서 예열하십시오.
- 면도날을 사용하여 슬라이드 가장자리에서 덮개 미끄러짐을 제거합니다. 시료를 긁지 마십시오. 45°C에서 2배 SSC와 50% 포름아미드를 함유한 코플린 항아리에서 슬라이드를 세척합니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.
- 45°C에서 5분 동안 2x SSC가 포함된 코플린 항아리에서 슬라이드를 세척합니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.
- 슬라이드에 DAPI 장착 용지 20 μl을 추가하고 커버 슬립으로 덮습니다. 커버 글래스를 부드럽게 눌러 장착 용지를 제거합니다. 청소 조직이있는 블롯 추가 마운팅 미디어. 슬라이드는 현미경 평가를 위해 준비됩니다.
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Representative Results
3D 슬라이드의 대표적인 결과는 도 2에표시됩니다. 본 실험에서, Cot-1 RNA FISH는 항 CBX1 및 γH2AX 항체를 사용하여 면역 염색과 함께 초기 전사를 검출하기 위해 수행되었다. RNA FISH와 면역염색을 결합하기 위하여는, 면역염색은3에서기술된 바와 같이 RNA FISH에 선행된 1차 행하되었습니다. CBX1은 XY 바디 (또는 성몸)에게 불린 메이오시스에 있는 pericentromeric 이종및 침묵하는 성 염색체에 현지화하는 이종국단백질 단백질입니다. γH2AX는 히스톤 변종 H2AX의 인포화 형이며 XY 본체에 국한된다. 이 그림에서, Cot-1 신호는 유축 영역에 축적되지만, pericentromeric 이종학 및 XY 바디에서 제외됩니다.
표면 확산 준비 중에 저혈압 용액을 가진 치료는 핵을 팽창시키고 물리적으로 비핵화 구조를 확장합니다. 메이오틱 연구를 위한 이 일반적인 방법은 단일 z-plane1에서모든 메이오틱 염색체를 포착하는 데 가장 적합합니다. 저근증 처리 후 3D 슬라이드 방법과 표면 확산 의 차이를 명확히하기 위해, 각 실험의 파시텐 정자 세포의 대표적인 사진은 상형광현미경(그림 2A 및 2B)을사용하여 동일한 배율을 사용하여 나타난다. 저혈압 용액으로 처리된 표면 확산에서 3차원 크로마틴 구조가 중단되고 모든 메이오틱 염색체 축을 하나의 z 평면 내에서 캡처할 수 있습니다. 그러나 3D 슬라이드 준비는 그대로 크로마틴 구조를 보존합니다.
그림 1. 3D 슬라이드 방법의 회로도. 3D 슬라이드 방법은 3차원 크로마틴 구조를 보존할 수 있다. 슬라이드의 입체 특성으로 인해 핵을 커버하려면 여러 z 단면을 가진 데이터 수집이 필요합니다.
그림 2. 동일한 배율에서 저근증 처리 후 3D 슬라이드 방법과 표면 확산 사이의 비교. (a)3D 슬라이드를 이용하여, 코트-1 RNA FISH(cy3) 및 항 CBX1(fitc) 및 γH2AX(cy5) 항체를 이용한 면역염색이 수행된다. 단일 z 단면을 가진 pachytene 정자 세포가 표시됩니다. (b)표면 확산을 이용하여, 항SCP3 및 γH2AX 항체를 이용한 면역염색이 수행된다. 파키텐 정자 세포가 표시됩니다. 원: XY 바디. 바: 10 μm.
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Discussion
3D 슬라이드 준비에서, 투과단계는 고정 단계 앞에 있다. 이러한 단계는 반열구관에서 직접 수행되어 3차원 크로마틴 구조를 보존합니다. RNA/DNA FISH에 대한 크로마틴 구조를 보존하는 대체 옵션은 투과화 단계와 고정 단계를 동시에 수행하는 것입니다. 이 대체 기술은 marsupial 세균 세포및 마우스 전 이식 배아7,8에서수행되었습니다. 그러나, 고정 단계가 투과화 단계보다 앞서는 경우, 높은 세포질 배경을 야기할 수 있다. 따라서, RNA 및 DNA FISH에 대한 슬라이드 최적화의 중요한 결정요인은 투과화 및 고정 단계의 순서에 의존한다. 투과화 단계의 지속 시간또한 슬라이드 준비의 최적화를 위한 중요한 요소입니다. 6분은 이 방법의 일반적인 조건입니다. 그러나 사용되는 재료의 변화에 따라 조정할 수 있습니다.
3차원 크로마틴 구조의 보존은 표면 확산 슬라이드와 뚜렷하게 분리되는 3D 슬라이드의 특징입니다. 이 장점은 염색체 퍼짐 준비와 크게 다릅니다. 3D 슬라이드 방법은 3차원 크로마틴 구조를 보존하지만 전체 핵을 포괄하기 위해 여러 z 단면을 사용하여 데이터 수집이 필요합니다. 단일 z 단면은 핵의 모든 신호를 캡처할 수 없습니다. 따라서 여러 z 단면의 필요성은 이 방법에 대한 주요 제한사항입니다. 단일 z 단면에서 핵을 포획하기 위해 표면 스프레드가 이점이 있습니다. 따라서, 3D 방법 및 표면 확산 제제는 뚜렷한 장점을 가지며, 메이오증과 정자 발생의 연구를 위해 서로의 특징을 상호 보상한다.
3D 슬라이드 방법은 정자, 둥근 정자 및 세르톨리 세포를 포함하여 고환 내에서 발견되는 모든 세포 유형에 적용 될 수있다. 이 방법은 또한 메이오성 염색체의 발병시 성 염색체의 크로마틴 다짐을 검사하고 PMSC10에대한 후성 유전학적 수정을 검사하기 위해 적용되었다. 향후 응용 프로그램의 관점에서 이 방법은 다른 조직 또는 세포에 적용될 수 있습니다. 그렇다면 투과화 단계가 고정 단계 앞에 있는 것이 좋습니다. 대안적으로, 투과화 단계및 고정 단계는 동시에 수행될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
나는 리 연구소와 타일러 브루링에있을 때이 프로젝트의 감독 지니 T. 리 감사 원고를 편집. 이 작품은 Dimes 재단과 NIH 그랜트 GM098605의 3 월에서 바질 오코너 스타터 장학금 상에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | |
| Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit | Agilent | 300380 | |
| Herring sperm DNA Solution | Invitrogen | 15634-017 | |
| Ethanol. 200 proof (absolute) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Formamide deionized | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Lifeblood Medical | 77110-100 | |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D6001 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | A10491-01 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 76240 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | |
| Illustra MicroSpin G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Forceps | VWR | 300-050 | |
| Microcentrifuge tubes | Bioexpress | C-3262-1 | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| Coplin Jar | Fisher | 08-815 | |
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| 4-well dish | Fisher | 12-566-301 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Air incubator | Revolutionary Science | RS-IF-203 |
References
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Namekawa, S. H., et al. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr Biol. 16, 660-667 (2006).
- Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
- Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis. Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).
- Hall, L. L., et al. An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).
- Huynh, K. D., Lee, J. T. Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos. Nature. 426, 857-862 (2003).
- Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).
- Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse. Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).
- Ichijima, Y., et al. MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells. Genes Dev. 25, 959-971 (2011).
- Sin, H. S., et al. RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids. Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).
