Summary
这里的材料描述了一种为保存睾丸生殖细胞的三维染色质结构而开发的方法。这被称为三维（3D）滑动方法。该方法提高了对亚核结构检测的灵敏度，适用于 原位 杂交（FISH）中的免疫荧光、DNA和RNA荧光。
Abstract
在睾丸生殖细胞分化过程中，核染色质的结构动态变化。下列描述了一种旨在保存小鼠睾丸生殖细胞的三维染色质排列的方法：此方法被称为三维 （3D） 滑动方法。在这种方法中，睾丸管直接处理与渗透步骤，去除细胞质材料，然后固定步骤，修复核材料。然后，图布分离，细胞悬浮是细胞，细胞粘附在幻灯片上。该方法提高了对亚核结构检测的敏感性，适用于 原位 杂交（FISH）的免疫荧光、DNA和RNA荧光，以及这些检测方法的组合。作为 3D 幻灯片方法可能应用的示例，可显示 Cot-1 RNA FISH 检测新生的RNA。3D滑动方法将促进睾丸生殖细胞分化过程中色度结构、DNA和RNA之间的空间关系的详细检查。
Introduction
在睾丸中，生殖细胞通过肌瘤从双体精氨酸中分离成成熟的、生物体精子。在此过程中，不断动态改造生殖细胞的核染色质结构。表面扩散通常用于个体精子细胞的细胞学检查。表面扩散的一种流行方法采用低血压治疗，通过这种疗法，个体精子细胞被扩散和扁平化。这些条件最适合详细分析美色体。使用这种方法很容易观察到染色体特征，如突触状态和重组 foci。然而，低音治疗破坏亚核染色质结构，因此该技术不适合核结构分析。因此，设计了一种改进的方法来保存睾丸生殖细胞的三维染色质结构。此方法被称为三维 （3D） 滑动法 （图1）。3D滑动方法使核中新生RNA定位的检测成为可能，因为它最初经过优化，通过RNA荧光在原地杂交（FISH）2，3中检查睾丸细菌细胞分化过程中的基因表达和色度状态。这种3D方法也适用于免疫荧光、DNA和RNA FISH的组合。此外，这种方法还有助于发现后美化性染色质（PMSC），这是在后美化精子2中发现的性染色体的无声隔间。
3D 滑动方法最初是通过用于核染色的滑动制备的两个基本步骤的组合进行优化的：用于修复核材料的固定步骤和旨在去除细胞质材料的渗透步骤，以提高染色试剂（如抗体和 FISH 探头）的可访问性。正如另一本出版物3中先前所述，已经确定渗透步骤必须在固定步骤之前进行，以便在低细胞质背景下获得最佳结果。在这种3D滑动方法中，渗透步骤和随后的固定步骤直接在半细管上执行，然后在细胞固定到滑梯上之前，用钳子将生殖细胞与钳子进行机械分离。另一个实验室4开发了一种精子生殖细胞RNA FISH的替代方法。在此方法中，与 3D 方法一致，渗透步骤必须在固定步骤之前进行，以便获得 RNA FISH 的最佳结果。
下列协议描述了 3D 滑动方法，并提供了可能应用 Cot-1 RNA FISH 检测核新生RNA的示例。Cot-1 DNA由基因组中的重复元素组成。在这里，一个Cot-1DNA探针被杂交到新生成绩单的直肠和UTR，从而检测核5，6的转录活跃区域。3D 幻灯片用途广泛，可应用于免疫荧光、DNA 和 RNA FISH 技术的组合，以便详细检查染色质架构之间的空间关系。
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Protocol
1.3D 幻灯片准备
- 准备以下试剂：
- CSK 缓冲器：100 mM 纳克、300 米蔗糖、10 米管道、3 毫米 MgCl2。将pH调整为6.8，并配备1 M NAOH。将 CSK 缓冲区存储在 4 °C。
- CSK 缓冲区，带 0.5% 特里顿 X-100：添加 200 μl 的特里顿 X-100 至 40 毫升 CSK 缓冲器。使用磁搅拌器混合溶液，直到 Triton X-100 完全溶解。将 CSK 缓冲区存储在 4 °C 的 0.5% 特里顿 X-100 中。
- 4% 甲醛 （PFA）– PBS， pH 7.4： 在大约 70-80 毫升水中溶解 4 克 PFA。为了加快溶解过程，添加约 20 μl 的 4 N NaOH，并将溶液保存在 60 °C 的水浴中，直到 PFA 完全溶解，溶液透明。此过程大约需要 1 小时。PFA 完全溶解后，添加 10 毫升 10 倍 PBS。用水将最终体积调整至 100 毫升，冷却室温解决方案（25 °C）。为每个新实验使用新准备的解决方案。
注：获得所有动物工作的机构许可，并遵守相关动物护理准则。
- 安乐死雄性老鼠。使用钳子和剪刀，从鼠标中切除睾丸。将睾丸放在PBS（或RPMI 1640）中。切除睾丸后，迅速执行以下步骤1.3-1.4，以防止RNA的退化。
- 在一个小的培养皿上破裂睾丸，并去除 图尼卡阿尔布吉内亚。用钳子在冰上解开 PBS 中的半尼化管。
- 使用钳子，将几个管子（几块长约5-10毫米的管子）转移到一口4井的盘子里，里面装着500毫升的CSK缓冲器+0.5%的Triton X-100在冰上，孵育6分钟。过度暴露到 CSK 缓冲区可能导致细胞中断。
- 使用钳子，将所有管子转移到包含 4% PFA-PBS 溶液的 4 井盘中的一口井中。此步骤可以在没有立体显微镜的情况下进行预制，但可以选择地使用。在室温下孵化10分钟。同时在潜伏期开始准备12个细胞平室。
- 使用钳子，将所有管子转移到包含 PBS 的 4 井菜的一口井中。在室温下孵化5分钟。
- 在玻璃滑梯的背面，将所有管子转移到 30 μl 的 PBS 中（由于离子电荷，应避免滑梯顶部）。使用两个钳子的尖端，将管子撕成碎片。通过在两个钳子的尖端之间剪断管子并水平拉动钳子，将管子切成水平方向。继续此步骤约 10-20 秒。
- 使用 P20 移液器通过管道混合悬架。
- 将悬架转移到微中福管中，用PBS稀释至约1.3毫升。在 12 个细胞平室中每个使用 100 μl 的悬浮剂（总计 1.2 毫升）。在此步骤中，不需要确定细胞的浓度。
- 在室温下，以 2，000 rpm 的速度将样品进行 10 分钟。细胞平移后，在室温下在实验室长凳上干滑几分钟。幻灯片允许完全干燥几分钟后，进入下一步。
- 使用含有 PBS 的科普林罐，在室温下清洗幻灯片 5 分钟。
- 将幻灯片转移到含有 70% 乙醇的科普林罐中，并在 RNA FISH 启动前等待至少 2 分钟。幻灯片在 70% 乙醇中稳定了几个星期， 在 4 °C 。 对于长期储存，脱水滑梯使用序列处理与80%和100%乙醇在科普林罐2分钟，空气干燥完全脱水的幻灯片。在幻灯片盒中存储在-80°C。
2. 通过随机引取的 Cot-1 DNA 探针准备
- 准备以下试剂：
- 混合缓冲：混合程序组件，准备 900 毫升杂交缓冲库存：此解决方案将用于库存探头。这种杂交缓冲库存允许在杂交前添加 10% 体积的 RNase 抑制剂溶液（核苷 Vanadyl 复合物）。
在杂交之前，在杂交缓冲库存中加入 1/10 卷 200 mM 核苷 Vanadyl 复合物或水，以匹配最终浓度。在 -20 °C 时，这种混合物稳定一年以上。元件 金额（微升） 最终浓度 甲酰胺 500 50% （v/v） 50% 德克斯特伦 200 10% （带/ v） 20x SSC 100 2倍 1% BSA 100 0.1% - 20x SSC：在大约800毫升水中溶解88.2克柠檬酸钠和175.3克纳克。使用几滴 1 M HCl 将 pH 调整到 7.0。 加入水，通过自动切割将最终体积调整到 1 L. 消毒。准备后，20倍SSC可在室温下存储。
- 50% （w/v） 德克斯特伦： 搅拌水， 慢慢加入 50 克脱硝酸硫酸盐.在室温下保持搅拌过夜。加入水，将最终体积调整为100毫升。在室温下存放。
- 混合缓冲：混合程序组件，准备 900 毫升杂交缓冲库存：此解决方案将用于库存探头。这种杂交缓冲库存允许在杂交前添加 10% 体积的 RNase 抑制剂溶液（核苷 Vanadyl 复合物）。
- 将下面列出的以下成分添加到 PCR 管中。使用 PCR 机器，在 95 °C 下混合并孵育溶液 5 分钟。
元件 每个反应的量（μl） 最后 鳕鱼-1脱氧核糖核酸：1毫克/毫升 1 1 微克 随机 9mer 引号（来自套件） 10 水 27 - 离心机短暂地放在冰上。
- 添加以下组件。使用 PCR 机器在 37 °C 时混合孵育 30 分钟。（有关所使用的工具包的详细信息，请参阅试剂和设备表）。
元件 每个反应的量（μl） 最终浓度 从步骤 2.2 中准备的混合物 38 5x 核苷酸缓冲器（来自套件） 9.2 Cy3-杜特普 （1 mM） 0.8 16 微米 克莱诺 （来自套件） 2 - 添加2μl的停止缓冲（从套件）来停止反应。
- 使用微针柱净化停止反应。
- 在纯化部分添加 50 微克 （5μl） 的鱼精子 DNA（模板 Cot-1 DNA 的 50 倍） 。
- 使用移液器测量总体积。加入 0.7 倍体积 100% 乙醇和 0.1 倍体积 3 M 醋酸钠 （pH 5.2），混合良好，离心机在最大速度 （17，000 x g） 使用微中熔体在 4 °C 下 15 分钟。
- 去除液体，加入200微升的70%乙醇，混合好离心机5分钟，最高速度为4°C。
- 去除多余的液体。在室温下将沉淀物干燥10-30分钟。
- 在 20μl 的杂交缓冲库存中溶解颗粒。由于颗粒通常难以溶解，移液器反复。作为替代选项，涡流搅拌机还可用于有效溶解颗粒。探头可保持在-20°C，直到使用。
3. 科特-1 RNA 鱼
- 将下面列出的组件添加到 PCR 管中。使用 PCR 机器，在 80 °C 时孵育 10 分钟，然后在 42 °C 时预接约 10-30 分钟。 保持在42°C，直到杂交。里博内库塞德瓦纳迪尔综合体是可选的;它可以被水取代。
元件 每个反应的量（μl） 最后 科特-1 DNA探针（50 ng/μl） 2 100 ng 里博内库塞德瓦纳迪尔综合体 （200 mM） 2 20立方米 混合缓冲区 添加到20 - 脱水滑入含有80%乙醇的科普林罐中2分钟，然后在2分钟内将含有100%乙醇的科普林罐中滑落。室温下，实验室长凳上完全干燥滑动。
- 提前在 42 °C 孵化器中预热尖端盒室（充满 2-3 厘米水）。将幻灯片放在尖端盒室上。将预制探头和移液器直接直接离心到脱水滑梯上。避免制造气泡。用盖子滑动轻轻盖住幻灯片。
- 混合6小时至夜间（14-15小时），42°C。
- 在科普林罐中准备洗涤溶液（两个罐子，均带有 2 倍 SSC 和 50% 的表酰胺，两个罐装 2x SSC）。在42°C预热30分钟，在水浴。
- 使用剃须刀刀片从滑梯边缘取下盖滑。避免抓取样本。在含有2x SSC和50%甲酰胺的科布林罐中清洗幻灯片，在45°C下5分钟。 重复此步骤一次。
- 在含有2x SSC的科布林罐中清洗幻灯片5分钟，在45°C。 重复此步骤一次。
- 在幻灯片中添加 20μl 的 DAPI 安装介质，并盖上封面滑。轻轻按盖玻璃，以去除额外的安装介质。用清洁组织点额外的安装介质。幻灯片已准备好进行显微镜评估。
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Representative Results
3D 幻灯片的代表性结果显示在 图 2 中。在这个实验中，使用抗CBX1和γH2AX抗体检测新生转录和免疫染色。为了结合RNA FISH和免疫染色，首先进行免疫染色，然后是RNA FISH，如3所述。CBX1是一种异色素蛋白，其局部化为外周异色素和无声性染色体，称为XY体（或性体）。γH2AX是一种磷化形式的高石变种H2AX和XY身体的局部。在这张照片中，Cot-1信号积聚在欧色学区域，但被排除在外周异色素和XY体之外。
在表面扩散准备过程中，使用低音溶液治疗膨胀核，并实际扩展亚核结构。这种流行的美化研究方法最适合在单个z平面1中捕获所有美色染色体。为了澄清3D滑动方法和低音量治疗后表面扩散的区别，使用表观显微镜（图2A 和 2B）显示每个实验中帕奇滕精子细胞的代表性图片。在用低音溶液处理的表面扩散中，三维染色质结构被破坏，所有美色体轴都可以在单个 z 平面内捕获。然而，3D幻灯片制备保留了完整的染色质结构。
图1。3D 幻灯片方法的示意图。3D滑动法可以保持三维染色质结构。由于幻灯片的三维性质，需要使用多个 z 节采集数据才能覆盖一个原子核。
图2。3D 滑动方法与表面在相同放大后低音处理后的比较。（A） 使用 3D 幻灯片，使用抗 CBX1 （fitc） 和γH2AX （cy5） 抗体进行 Cot-1 RNA FISH （cy3） 和免疫污染。显示带有单个 z 节的帕奇滕精子细胞。（B） 利用表面扩散，用抗SCP3和γH2AX抗体进行免疫。显示一个帕奇滕精子细胞。圆圈：XY身体。酒吧： 10 微米。
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Discussion
在 3D 幻灯片准备中，渗透步骤先于固定步骤。这些步骤直接在半细管上执行，从而保持三维染色质结构。保存RNA/DNA FISH染色质结构的另一种选择是同时执行渗透步骤和固定步骤。这种替代技术已在母体生殖细胞和小鼠预植胚胎7，8中进行。但是，如果固定步骤先于渗透步骤，则可能导致高细胞质背景。因此，RNA和DNA FISH滑动优化的关键决定因素取决于渗透顺序和固定步骤。渗透步骤的持续时间也是优化幻灯片准备的一个重要因素。六分钟是这种方法的一般条件。但是，可以根据所用材料的变化进行调整。
三维染色质结构的保存是 3D 幻灯片的一个特征，它与表面分布滑梯明显分离。这一优势与染色体扩散制备有很大不同。3D 幻灯片方法保留了三维染色质结构，但需要具有多个 z 节的数据采集以包含整个原子核。单个z节无法捕获核的所有信号。因此，多个z节的必要性是这一方法的主要限制。要在单个 z 节中捕获核，表面点差具有优势。因此，3D方法和表面扩散制剂在研究肌瘤和精子生成方面具有明显的优势，相互补偿。
3D滑动方法可应用于睾丸中发现的所有细胞类型，包括精子、圆形精子和塞尔托利细胞。该方法还应用于检查性染色体在性染色体失活开始时的染色质压实，并检查PMSC10上的表观遗传修饰。就未来的应用而言，这种方法可以应用于其他组织或细胞。如果是这样，建议在固定步骤之前进行渗透步骤。或者，渗透步骤和固定步骤可以同时执行。
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Disclosures
作者无可透露。
Acknowledgments
我感谢珍妮 T. 李监督这个项目时， 我在李实验室和泰勒布罗林编辑手稿。这项工作得到了迪姆斯基金会3月颁发的巴兹尔·奥康纳初学者奖和NIH赠款GM098605的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | |
| Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit | Agilent | 300380 | |
| Herring sperm DNA Solution | Invitrogen | 15634-017 | |
| Ethanol. 200 proof (absolute) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Formamide deionized | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Lifeblood Medical | 77110-100 | |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D6001 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | A10491-01 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 76240 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | |
| Illustra MicroSpin G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Forceps | VWR | 300-050 | |
| Microcentrifuge tubes | Bioexpress | C-3262-1 | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| Coplin Jar | Fisher | 08-815 | |
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| 4-well dish | Fisher | 12-566-301 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Air incubator | Revolutionary Science | RS-IF-203 |
References
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