Summary
Materialet her beskriver en metode utviklet for å bevare den tredimensjonale kromatinstrukturen til testikulære bakterieceller. Dette kalles den tredimensjonale (3D) lysbildemetoden. Denne metoden forbedrer følsomheten for påvisning av subnukleære strukturer og gjelder for immunfluorescens, DNA og RNA fluorescens in situ hybridisering (FISH).
Abstract
Under testikkel bakteriecelledifferensiering endres strukturen av kjernefysisk kromatin dynamisk. Følgende beskriver en metode designet for å bevare det tredimensjonale kromatinarrangementet av testikkel bakterieceller som finnes hos mus; Denne metoden kalles den tredimensjonale (3D) lysbildemetoden. I denne metoden behandles testikulære tubuli direkte med et permeabiliseringstrinn som fjerner cytoplasmisk materiale, etterfulgt av et fikseringstrinn som løser kjernefysiske materialer. Tubules blir deretter dissosiert, cellefjæringen er cytospun, og cellene holder seg til lysbilder. Denne metoden forbedrer følsomheten mot deteksjon av subnukleære strukturer og gjelder for immunfluorescens, DNA og RNA fluorescens in situ hybridisering (FISH) og kombinasjonen av disse deteksjonsmetodene. Som et eksempel på en mulig anvendelse av 3D-lysbildemetoden, vises en Cot-1 RNA FISH for å oppdage nascent RNAer. 3D-glidemetoden vil lette den detaljerte undersøkelsen av romlige sammenhenger mellom kromatinstruktur, DNA og RNA under testikkel bakteriecelledifferensiering.
Introduction
I testikler skiller bakterieceller seg fra diploid spermatogonia gjennom meiosis til moden, haploid spermatozoa. Under denne prosessen blir den kjernefysiske kromatinstrukturen til bakterieceller kontinuerlig og dynamisk ombygd. Overflatespredninger brukes ofte til cytologisk undersøkelse av individuelle spermatogene celler. En rådende metode for overflatespredninger bruker hypotonisk behandling der individuelle spermatogene celler spres og flates1. Disse forholdene er optimale for detaljert analyse av meiotiske kromosomer. Kromosomale egenskaper som synaptisk status og rekombinasjonsfokus observeres lett ved hjelp av denne metoden. Den hypotoniske behandlingen forstyrrer imidlertid subnukleær kromatinarkitektur, og denne teknikken er derfor ikke egnet for strukturell analyse av kjerner. Følgelig er en forbedret metode designet for å bevare den tredimensjonale kromatinstrukturen til testikulære bakterieceller. Denne metoden kalles den tredimensjonale (3D) lysbildemetoden (Figur 1). 3D-lysbildemetoden har gjort det mulig å oppdage nascent RNA-lokalisering i kjerner fordi den i utgangspunktet var optimalisert for å undersøke genuttrykk og kromatintilstander under testikkel bakteriecelledifferensiering av RNA fluorescens in situ hybridisering (FISH)2,3. Denne 3D-metoden gjelder også for kombinasjonen av immunfluorescens, DNA og RNA FISH. I tillegg har denne metoden hjulpet til med oppdagelsen av postmetiotisk kjønnskromatin (PMSC), et stille rom i kjønnskromosomene som finnes i postmetiotiske spermatider2.
3D-glidemetoden ble opprinnelig optimalisert gjennom kombinasjonen av to viktige trinn i lysbildeforberedelse som vanligvis brukes til kjernefysisk farging: fikseringstrinnet designet for å fikse kjernefysiske materialer og permeabiliseringstrinnet som er ment å fjerne cytoplasmatiske materialer for å forbedre tilgjengeligheten av fargingsreagenser, for eksempel antistoffer og FISH-sonder. Som tidligere beskrevet i en annen publikasjon3, har det blitt fastslått at permeabiliseringstrinnet må komme før fikseringstrinnet for å oppnå optimale resultater med lav cytoplasmisk bakgrunn. I denne 3D-lysbildemetoden utføres permeabiliseringstrinnet og det påfølgende fikseringstrinnet direkte på seminiferøse tubuli og etterfølges av mekanisk dissosiasjon av bakterieceller med tang før cytospinning på lysbilder. En alternativ metode for RNA FISH av spermatogene celler ble utviklet i et annet laboratorium4. I denne metoden, i samsvar med 3D-metoden, må permeabiliseringstrinnet gå foran fikseringstrinnet for å oppnå optimale resultater av RNA FISH.
Følgende protokoll beskriver 3D-glidemetoden og gir et eksempel på et mulig program, Cot-1 RNA FISH for påvisning av kjernefysiske nascent RNAer. Cot-1 DNA består av repeterende elementer i genomet. Her er en Cot-1 DNA-sonde hybridisert til en intron og UTR av de ekkel transkripsjonene, og oppdager dermed de transkripsjonsaktive områdene i kjernen5,6. 3D-lysbilder er allsidige og kan brukes på en kombinasjon av immunfluorescens, DNA- og RNA FISH-teknikker for å oppnå detaljert undersøkelse av romlige sammenhenger mellom kromatinarkitektur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.3D Klargjøring av lysbilde
- Forbered følgende reagenser:
- CSK buffer: 100 mM NaCl, 300 mM sukrose, 10 mM PIPES, 3 mM MgCl2. Juster pH til 6,8 med 1 M NaOH. Oppbevar CSK-bufferen ved 4 °C.
- CSK-buffer med 0,5 % Triton X-100: Tilsett 200 μl Triton X-100 til 40 ml CSK-buffer. Bland oppløsningen ved hjelp av magnetisk omrører til Triton X-100 er helt oppløst. Oppbevar CSK-bufferen med 0,5 % Triton X-100 ved 4 °C.
- 4% Paraformaldehyd (PFA)–PBS, pH 7,4: Løs opp 4 g PFA i ca. 70-80 ml vann. For å fremskynde oppløsningsprosessen, tilsett ca. 20 μl 4 N NaOH og hold løsningen i et vannbad ved 60 °C til PFA er helt oppløst og oppløsningen er gjennomsiktig. Denne prosessen tar omtrent 1 time. Etter at PFA er fullstendig oppløst, tilsett 10 ml 10x PBS. Juster det endelige volumet til 100 ml med vann og avkjøl oppløsningen til romtemperatur (25 °C). Bruk nylaget løsning for hvert nytt eksperiment.
Merk: Få institusjonell tillatelse til alt dyrearbeid og følg relevante retningslinjer for dyrepleie.
- Euthanize mannlige mus. Bruk tang og saks, sluk testisene fra musen. Plasser testisene i PBS (eller RPMI 1640). Etter fjerning av testis, utfør raskt følgende trinn 1.3-1.4 for å forhindre nedbrytning av RNA.
- Rev opp testisene på en liten Petri-tallerken og fjern tunika albuginea. Løs de seminiferøse tubuliene i PBS på is ved hjelp av tang.
- Bruk tang, overfør flere tubuli (flere stykker tubuli ca. 5-10 mm i lengde) til en brønn av en 4-brønns tallerken som inneholder 500 ml CSK buffer + 0,5% Triton X-100 på is, og inkuber i 6 min. Overeksponering for CSK-bufferen kan føre til forstyrrelse av celler.
- Bruk tang, overfør alle tubuliene til en brønn av en 4-brønns tallerken som inneholder 4% PFA-PBS-løsning. Dette trinnet kan forhåndsformes uten stereomikroskop, men eventuelt kan det brukes. Inkuber i 10 min ved romtemperatur. Begynn samtidig å forberede 12 cytospinkamre i inkubasjonsperiodene.
- Bruk tang, overfør alle tubuliene til en brønn av en 4-brønns tallerken som inneholder PBS. Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
- På baksiden av en glasssklie, overfør alle tubuliene til 30 μl PBS (toppen av lysbildet bør unngås på grunn av kationisk ladning). Bruk spissene på to tang, rive tubuliene i stykker. Hakk tubuliene i horisontal retning ved å klippe tubuli mellom spisser på to tang og trekke tang horisontalt. Fortsett med dette trinnet i omtrent 10-20 sek.
- Bland suspensjonen ved å pipettere med en P20 pipette.
- Overfør suspensjonen til et mikrocentrifugerør, fortynn med PBS til ca. 1,3 ml. Påfør 100 μl suspensjon på hvert av de 12 cytospinkamrene (1,2 ml totalt). På dette trinnet trenger konsentrasjonen av celler ikke å bestemmes.
- Cytospin prøvene ved 2000 rpm i 10 min ved romtemperatur. Etter cytospinning, tørre lysbilder på labbenken i noen minutter ved romtemperatur. Etter at lysbilder har fått lov til å tørke helt i noen minutter, gå til neste trinn.
- Bruk en Coplin krukke som inneholder PBS, vask lysbildene i 5 min ved romtemperatur.
- Overfør lysbilder til en Coplin krukke som inneholder 70% etanol og vent minst 2 min før oppstart av RNA FISH. Lysbildene er stabile i noen uker i 70% etanol ved 4 °C. For langtidslagring, dehydrere lysbilder ved hjelp av seriell behandling med 80% og 100% etanol i Coplin krukker i 2 min hver og lufttørke helt dehydrere lysbildene. Oppbevares ved -80 °C i en glideboks.
2. Kot-1 DNA-sondeforberedelse ved tilfeldig grunning
- Forbered følgende reagenser:
- Hybridiseringsbuffer: Bland de påløpte komponentene for å forberede 900 ml hybridiseringsbufferlager; denne løsningen vil bli brukt til å lagre sonder. Dette hybridiseringsbufferlageret gjør det mulig å legge til 10% volum RNase-hemmerløsning (Ribonucleoside Vanadyl Complex) før hybridisering.
Før hybridisering, legg til 1/10 vol på 200 mM Ribonucleoside Vanadyl Complex eller vann til hybridiseringsbufferlageret for å matche den endelige konsentrasjonen. Ved -20 °C er denne blandingen stabil i mer enn ett år.komponent Mengde (μl) Endelig konsentrasjon Formamid 500 50 % (v/v) 50% Dextran 200 10 % (med/v) 20x SSC 100 2x 1% BSA 100 0.1% - 20x SSC: Løs opp 88,2 g natriumsitrat og 175,3 g NaCl i ca. 800 ml vann. Juster pH til 7.0 med noen dråper 1 M HCl. Tilsett vann for å justere det endelige volumet til 1 L. Steriliser ved autoklavering. Etter tilberedning kan 20x SSC lagres ved romtemperatur.
- 50% (m/v) Dextran: Rør vann og tilsett sakte 50 g dekstransulfat. Fortsett å røre over natten ved romtemperatur. Tilsett vann for å justere sluttvolumet til 100 ml. Oppbevars ved romtemperatur.
- Hybridiseringsbuffer: Bland de påløpte komponentene for å forberede 900 ml hybridiseringsbufferlager; denne løsningen vil bli brukt til å lagre sonder. Dette hybridiseringsbufferlageret gjør det mulig å legge til 10% volum RNase-hemmerløsning (Ribonucleoside Vanadyl Complex) før hybridisering.
- Legg til følgende bestanddeler som er oppført nedenfor, i et PCR-rør. Bruk en PCR-maskin til å blande og inkubere oppløsningen i 5 min ved 95 °C.
komponent Mengde per reaksjon (μl) finale Cot-1 DNA: 1 mg/ml 1 1 μg Tilfeldig 9mer primer (fra sett) 10 Vann 27 - Sentrifuge kort og legg på is.
- Legg til følgende komponenter. Bland og inkuber i 30 min ved 37 °C ved hjelp av en PCR-maskin. (For detaljer om settet som brukes, se tabellen over reagenser og utstyr).
komponent Mengde per reaksjon (μl) Endelig konsentrasjon Blanding tilberedt fra trinn 2.2 38 5x nukleotidbuffer (fra sett) 9.2 Cy3-dUTP (1 mM) 0.8 16 μM Klenow (fra sett) 2 - Tilsett 2 μl stoppbuffer (fra sett) for å avbryte reaksjonen.
- Rens den stansede reaksjonen ved hjelp av mikrospinkolonner.
- Tilsett 50 μg (5 μl) sildesperm-DNA (50 ganger overskudd av mal Cot-1 DNA) til den rensede fraksjonen.
- Mål det totale volumet ved hjelp av en pipette. Tilsett 0,7x volum 100% etanol og 0,1x volum 3 M natriumacetat (pH 5,2), bland godt og sentrifuger i 15 minutter ved maksimal hastighet (17 000 x g) ved hjelp av en mikrocentrifuge ved 4 °C.
- Fjern væsken, og tilsett 200 μl 70% etanol, bland godt og sentrifuge i 5 min ved maksimal hastighet ved 4 °C.
- Fjern overflødig væske. Tørk bunnfallet i 10-30 min ved romtemperatur.
- Løs opp pelletsen i 20 μl hybridiseringsbufferlager. Fordi pellets ofte er vanskelig å oppløse, pipette gjentatte ganger. Som et alternativt alternativ kan en virvelblander også brukes til å effektivt oppløse pelletsen. Sonder kan holdes ved -20 °C til bruk.
3. Barneseng-1 RNA FISK
- Legg komponentene som er oppført nedenfor, i et PCR-rør. Bruk en PCR-maskin til å inkubere i 10 minutter ved 80 °C, etterfulgt av et preannealingstrinn på ca. 10-30 min ved 42 °C. Hold ved 42 °C til hybridisering. Ribonucleoside Vanadyl Complex er valgfritt; den kan erstattes med vann.
komponent Mengde per reaksjon (μl) finale Cot-1 DNA-sonde (50 ng/μl) 2 100 ng Ribonucleoside Vanadyl-komplekset (200 mM) 2 20 mM Hybridiseringsbuffer lagt til 20 - Dehydrere lysbilder i en Coplin krukke som inneholder 80% etanol i 2 min, etterfulgt av en Coplin krukke som inneholder 100% etanol i 2 min. Tørre sklier helt på labbenken ved romtemperatur.
- Forvarm et spissbokskammer (fylt med 2-3 cm vann) i en 42 °C inkubator på forhånd. Plasser lysbildet på tuppbokskammeret. Sentrifuger kort de preannealerte sondene og pipetten direkte på de dehydrerte lysbildene. Unngå å lage bobler. Dekk forsiktig til lysbildet med en dekselglidning.
- Hybridiser i 6 timer til over natten (14-15 timer) ved 42 °C.
- Forbered vaskeløsninger i Coplin krukker (to krukker med både 2x SSC og 50% formamid, og to krukker med 2x SSC). Forvarm ved 42 °C i 30 min i et vannbad.
- Bruk et barberblad til å fjerne dekselslippet fra kanten av lysbildet. Unngå riper i prøver. Vask lysbilder i en Coplin krukke som inneholder 2x SSC og 50% formamid i 5 min ved 45 °C. Gjenta dette trinnet én gang.
- Vask lysbildene i en Coplin-krukke som inneholder 2x SSC i 5 minutter ved 45 °C. Gjenta dette trinnet én gang.
- Tilsett 20 μl DAPI-monteringsmedier på lysbildene, og dekk med en dekselslipp. Trykk forsiktig på dekkglasset for å fjerne ekstra monteringsmedier. Blot ekstra monteringsmedier med rengjøringsvev. Lysbildene er klare for mikroskopievaluering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et representativt resultat av et 3D-lysbilde vises i figur 2. I dette eksperimentet ble Cot-1 RNA FISH utført for å oppdage nascent transkripsjon sammen med immunostaining ved hjelp av anti CBX1 og γH2AX antistoffer. For å kombinere RNA FISH og immunstaining ble immunstaining utført først, etterfulgt av RNA FISH som beskrevet i3. CBX1 er et heterokromatinprotein som lokaliserer til pericentromerisk heterokromatin og stille kjønnskromosomer i meiosis kalt en XY-kropp (eller sexkropp). γH2AX er en fosforylatert form av histone variant H2AX og lokaliserer på XY kroppen. På dette bildet akkumuleres Cot-1-signaler på eukromatiske regioner, men er utelukket fra pericentromerisk heterokromatin og XY-kroppen.
Under overflatespredningspreparatet svulmer behandling med hypotonisk løsning kjerner og utvider fysisk subnukleære strukturer. Denne rådende metoden for meiotisk studie er best egnet for å fange alle meiotiske kromosomer i et enkelt z-plan1. For å klargjøre forskjellen mellom 3D-glidemetoden og overflatespredningen etter hypotonisk behandling, vises representative bilder av pachytene spermatocytter av hvert eksperiment ved hjelp av samme forstørrelse ved hjelp av et epifluorescerende mikroskop (Figur 2A og 2B). I overflatespredninger behandlet med hypotonisk løsning blir den tredimensjonale kromatinstrukturen forstyrret og alle meiotiske kromosomakser kan fanges i et enkelt z-plan. 3D-lysbildeforberedelse bevarer imidlertid den intakte kromatinstrukturen.
Figur 1. Skjematisk for 3D-lysbildemetode. 3D-glidemetoden kan bevare den tredimensjonale kromatinstrukturen. På grunn av lysbildets tredimensjonale natur er det nødvendig med datainnsamling med flere z-seksjoner for å dekke en kjerne.
Figur 2. Sammenligning mellom 3D-glidemetoden og overflaten sprer seg etter hypotonisk behandling med samme forstørrelse. (A) Bruk av 3D-sklien, Cot-1 RNA FISH (cy3) og immunostaining med anti CBX1 (fitc) og γH2AX (cy5) antistoffer utføres. En pachytene spermatocytt med en enkelt z-seksjon vises. (B) Bruk av overflatespredningene, immunstaining med anti SCP3- og γH2AX-antistoffer utføres. En pachytene spermatocytt er vist. Sirkler: XY kropp. Stenger: 10 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I 3D-lysbildeforberedelse går permeabiliseringstrinnet foran fikseringstrinnet. Disse trinnene utføres direkte på seminiferøse tubuli, og bevarer dermed den tredimensjonale kromatinstrukturen. Et alternativt alternativ til å bevare kromatinstruktur for RNA/DNA FISH er å utføre permeabiliseringstrinnet og fikseringstrinnet samtidig. Denne alternative teknikken har blitt utført i buktige bakterieceller og i musepreimplantasjonsembryoer7,8. Men hvis fikseringstrinnet går foran permeabiliseringstrinnet, kan det gi opphav til høy cytoplasmisk bakgrunn. Derfor er den kritiske determinanten for lysbildeoptimalisering for RNA og DNA FISH avhengig av rekkefølgen på permeabiliseringen og fikseringstrinnene. Varigheten av permeabiliseringstrinnet er også en viktig faktor for optimalisering av lysbildeforberedelse. Seks minutter er den generelle betingelsen for denne metoden. Det kan imidlertid justeres avhengig av variasjonen av materialene som brukes.
Bevaringen av den tredimensjonale kromatinstrukturen er en funksjon av 3D-lysbildet som tydelig skiller den fra overflatespredningsskred. Denne fordelen adskiller seg sterkt fra kromosomspredningspreparatet. 3D-lysbildemetoden bevarer tredimensjonal kromatinstruktur, men krever datainnsamling med flere z-seksjoner for å omfatte en hel kjerne. En enkelt z-seksjon kan ikke fange opp alle signaler fra en kjerne. Dermed er nødvendigheten av flere z-seksjoner en stor begrensning for denne metoden. For å fange en kjerne i en enkelt z-seksjon, har overflatespredning en fordel. Derfor har 3D-metoden og overflatespredningspreparatet tydelige fordeler og kompenserer hverandres egenskaper gjensidig for studiet av meiosis og spermatogenese.
3D-glidemetoden kan brukes på alle celletyper som finnes i testiklene, inkludert spermatogonia, runde spermatider og Sertoli-celler. Denne metoden har også blitt brukt til å undersøke kromatinkomprimeringen av kjønnskromosomene ved utbruddet av meiotisk kjønnskromosominaktivering, og for å undersøke epigenetiske modifikasjoner på PMSC10. Når det gjelder fremtidige applikasjoner, kan denne metoden brukes på andre vev eller celler. I så fall anbefales det at permeabiliseringstrinnet kommer før fikseringstrinnet. Alternativt kan permeabiliseringstrinnet og fikseringstrinnet utføres samtidig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Jeg takker Jeannie T. Lee for tilsyn med dette prosjektet da jeg var i Lee-laboratoriet og Tyler Broering for redigering av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Basil O'Connor Starter Scholar Award fra March of Dimes Foundation og NIH Grant GM098605.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | |
| Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit | Agilent | 300380 | |
| Herring sperm DNA Solution | Invitrogen | 15634-017 | |
| Ethanol. 200 proof (absolute) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Formamide deionized | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Lifeblood Medical | 77110-100 | |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D6001 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | A10491-01 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 76240 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | |
| Illustra MicroSpin G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Forceps | VWR | 300-050 | |
| Microcentrifuge tubes | Bioexpress | C-3262-1 | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| Coplin Jar | Fisher | 08-815 | |
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| 4-well dish | Fisher | 12-566-301 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Air incubator | Revolutionary Science | RS-IF-203 |
References
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Namekawa, S. H., et al. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr Biol. 16, 660-667 (2006).
- Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
- Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis. Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).
- Hall, L. L., et al. An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).
- Huynh, K. D., Lee, J. T. Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos. Nature. 426, 857-862 (2003).
- Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).
- Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse. Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).
- Ichijima, Y., et al. MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells. Genes Dev. 25, 959-971 (2011).
- Sin, H. S., et al. RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids. Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).
