Summary
Materialet beskriver här en metod som utvecklats för att bevara den tredimensionella kromatinstrukturen hos testikelceller. Detta har kallats den tredimensionella (3D) bildmetoden. Denna metod förbättrar känsligheten för detektion av subnukleära strukturer och är tillämplig för immunofluorescens, DNA och RNA fluorescens in situ hybridisering (FISH).
Abstract
Under testikel könsceller differentiering förändras strukturen av nukleära kromatin dynamiskt. Nedan beskrivs en metod som är utformad för att bevara det tredimensionella kromatinarrangemanget av testikelceller som finns hos möss. Denna metod har kallats den tredimensionella (3D) bildmetoden. I denna metod behandlas testikelrör direkt med ett permeabiliseringssteg som tar bort cytoplasmiskt material, följt av ett fixeringssteg som fixerar kärnmaterial. Tubuler demonteras sedan, cellupphängningen är cytospun och cellerna klibbar vid diabilder. Denna metod förbättrar känsligheten för detektion av subnukleära strukturer och är tillämplig för immunofluorescens, DNA och RNA fluorescens in situ hybridisering (FISH) och kombinationen av dessa detektionsmetoder. Som ett exempel på en möjlig tillämpning av 3D-glidmetoden visas en Cot-1 RNA FISH för att upptäcka gryende RNAs. 3D-glidmetoden kommer att underlätta detaljerad undersökning av rumsliga relationer mellan kromatinstruktur, DNA och RNA under testikelreceller differentiering.
Introduction
I testilysatorer skiljer sig könsceller från diploid spermatogonia genom meios till mogna, haploid spermatozoa. Under denna process ombyggnads den nukleära kromatinstrukturen hos könsceller kontinuerligt och dynamiskt. Ytspridningar används ofta för cytologisk undersökning av enskilda spermatogena celler. En rådande metod för ytspridning använder hypoton behandling genom vilken enskilda spermatogena celler sprids och plattasut 1. Dessa villkor är optimala för detaljerad analys av meiotiska kromosomer. Kromosomala funktioner som synaptisk status och rekombinationsfoci observeras lätt med denna metod. Hypotona behandlingen stör dock subnukleära chromatin arkitektur, således denna teknik är inte lämplig för strukturell analys av atomkärnor. Följaktligen har en förbättrad metod utformats för att bevara den tredimensionella kromatinstrukturen hos testikelceller. Denna metod har kallats den tredimensionella (3D) bildmetoden (figur 1). 3D-glidmetoden har gjort det möjligt att upptäcka gryende RNA-lokalisering i atomkärnor eftersom den ursprungligen optimerades för att undersöka genuttryck och kromatin tillstånd under testikel könsceller differentiering av RNA fluorescens in situ hybridisering (FISH)2,3. Denna 3D-metod är också tillämplig på kombinationen av immunofluorescens, DNA och RNA FISH. Dessutom har denna metod hjälpt till att upptäcka postmeiotisk könskromatin (PMSC), ett tyst fack av könskromosomerna som finns i postmeiotiska spermatider2.
3D-glidmetoden optimerades ursprungligen genom kombinationen av två viktiga steg för glidberedning som vanligtvis används för kärnfärgning: fixeringssteget som utformats för att fixa kärnmaterial och permeabiliseringssteget avsett att ta bort cytoplasmaiska material för att förbättra tillgängligheten för färgreagenser, såsom antikroppar och FISK-sonder. Som tidigare beskrivits i enannan publikation 3har det fastställts att permeabiliseringssteget måste föregå fixeringssteget för att uppnå optimala resultat med låg cytoplasmisk bakgrund. I denna 3D-glidmetod utförs permeabiliseringssteget och efterföljande fixeringssteg direkt på seminiferous tubules och följs av mekanisk dissociation av könsceller med tång före cytospinning på diabilder. En alternativ metod för RNA FISH av spermatogenic celler utvecklades i ett annat laboratorium4. I denna metod, i överensstämmelse med 3D-metoden, måste permeabiliseringssteget föregå fixeringssteget för att uppnå optimala resultat av RNA FISH.
Följande protokoll beskriver 3D-bildmetoden och ger ett exempel på en möjlig tillämpning, Cot-1 RNA FISH för detektion av nukleära gryende RNAs. Cot-1 DNA består av repetitiva element i genomet. Här hybridiseras en Cot-1 DNA-sond till en intron och UTR av de gryende transkriptionerna, vilket detekterar de transkriptionellt aktiva regionerna i kärnan5,6. 3D-bilder är mångsidiga och kan appliceras på en kombination av immunofluorescens-, DNA- och RNA FISH-tekniker för att få detaljerad undersökning av rumsliga relationer mellan kromatinarkitektur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.3D Bildförberedelse
- Förbered följande reagenser:
- CSK-buffert: 100 mM NaCl, 300 mM sackaros, 10 mM rör, 3 mM MgCl2. Justera pH till 6,8 med 1 M NaOH. Förvara CSK-bufferten vid 4 °C.
- CSK-buffert med 0,5% Triton X-100: Tillsätt 200 μl Triton X-100 till 40 ml CSK-buffert. Blanda lösningen med magnetomrörare tills Triton X-100 är helt upplöst. Förvara CSK-bufferten med 0,5% Triton X-100 vid 4 °C.
- 4% Paraformaldehyd (PFA)–PBS, pH 7.4: Lös upp 4 g PFA i cirka 70–80 ml vatten. För att påskynda upplösningsprocessen, tillsätt cirka 20 μl 4 N NaOH och håll lösningen i ett vattenbad vid 60 °C tills PFA har löst sig helt och lösningen är transparent. Denna process tar cirka 1 timme. När PFA har lösts upp helt, tillsätt 10 ml 10x PBS. Justera den slutliga volymen till 100 ml med vatten och kyl ner lösningen till rumstemperatur (25 °C). Använd nylagad lösning för varje nytt experiment.
Anm.: Erhåll institutionellt tillstånd för allt djurarbete och följ relevanta riktlinjer för djurvård.
- Avliva hanmöss. Använd tång och sax och ta bort testiklar från musen. Placera testikel i PBS (eller RPMI 1640). Efter avlägsnandet av testiklingar, utför snabbt följande steg 1.3-1.4 för att förhindra nedbrytning av RNA.
- Spräck testikisen på en liten Petri-skål och ta bort tunica albuginea. Nysta upp de seminiferous tubulerna i PBS på is med tång.
- Använd tång, överför flera tubuler (flera bitar av tubuler ungefär 5-10 mm långa) till en brunn av en 4-brunns skål som innehåller 500 ml CSK-buffert + 0,5% Triton X-100 på is och inkubera i 6 min. Överexponering för CSK-buffert kan leda till störningar i celler.
- Använd tång, överför alla tubules till en brunn av en 4-brunns skål som innehåller 4% PFA-PBS-lösning. Det här steget kan förformateras utan stereomikroskop, men som tillval kan det användas. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Börja samtidigt förbereda 12 cytospinkammare under inkubationsperioderna.
- Använd tång, överför alla tubules till en brunn av en 4-brunns skål som innehåller PBS. Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
- På baksidan av en glasrutschbana, överför alla tubuler till 30 μl PBS (bildens överkant bör undvikas på grund av katjonladdning). Riv tubulerna i bitar med hjälp av spetsarna på två tångar. Hacka tubulerna i horisontell riktning genom att klippa tubule mellan spetsarna på två tångar och dra tången horisontellt. Fortsätt med det här steget i cirka 10-20 sek.
- Blanda fjädringen genom att pipettera med en P20-pipett.
- Överför fjädringen till ett mikrocentrifugrör, späd med PBS till cirka 1,3 ml. Applicera 100 μl suspension på var och en av de 12 cytospinkamrarna (totalt 1,2 ml). I detta steg behöver koncentrationen av celler inte bestämmas.
- Cytospin proverna vid 2 000 varv/min i 10 min vid rumstemperatur. Efter cytospinning, torra diabilder på labbbänken i några minuter vid rumstemperatur. När bilderna har fått torka helt i några minuter går du till nästa steg.
- Använd en Coplin-burk som innehåller PBS och tvätta rutschkanorna i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Överför diabilder till en Coplinburk som innehåller 70% etanol och vänta minst 2 minuter innan RNA FISH påbörjas. Diabilderna är stabila i några veckor i 70% etanol vid 4 °C. För långtidslagring, dehydrera diabilder med seriell behandling med 80% och 100% etanol i Coplin burkar i 2 min vardera och lufttorka helt dehydrera bilderna. Förvara vid -80 °C i en skjutbox.
2. Cot-1 DNA Probe Förberedelse av Random Priming
- Förbered följande reagenser:
- Hybridiseringsbuffert: Blanda de förfarandekomponenterna för att förbereda 900 ml hybridiseringsbuffertlager. denna lösning kommer att användas för att lagra sonder. Detta hybridiseringsbuffertlager möjliggör tillsats av 10% volym av RNase-hämmarlösning (Ribonucleoside Vanadyl Complex) före hybridisering.
Före hybridisering, tillsätt 1/10 volymprocent Ribonucleoside Vanadyl Complex eller vatten till hybridiseringsbuffertlagret för att matcha den slutliga koncentrationen. Vid -20 °C är denna blandning stabil i mer än ett år.komponent Belopp (μl) Slutlig koncentration Formamid 500 50% (v/v) 50% Dextran 200 10% (w/v) 20x SSC 100 2x 1% BSA 100 0.1% - 20x SSC: Lös upp 88,2 g natriumcitrat och 175,3 g NaCl i cirka 800 ml vatten. Justera pH-talet till 7,0 med några droppar 1 M HCl. Tillsätt vatten för att justera den slutliga volymen till 1 L. Sterilisera genom autoklavering. Efter beredning kan 20x SSC förvaras i rumstemperatur.
- 50% (w/v) Dextran: Rör om vatten och tillsätt långsamt 50 g dextransulfat. Fortsätt att röra om över natten i rumstemperatur. Tillsätt vatten för att justera den slutliga volymen till 100 ml. Förvara i rumstemperatur.
- Hybridiseringsbuffert: Blanda de förfarandekomponenterna för att förbereda 900 ml hybridiseringsbuffertlager. denna lösning kommer att användas för att lagra sonder. Detta hybridiseringsbuffertlager möjliggör tillsats av 10% volym av RNase-hämmarlösning (Ribonucleoside Vanadyl Complex) före hybridisering.
- Lägg till följande komponenter nedan i ett PCR-rör. Blanda och inkubera lösningen i 5 min vid 95 °C med hjälp av en PCR-maskin.
komponent Mängd per reaktion (μl) sist Barnsäng-1 DNA: 1 mg/ml 1 1 μg Slumpmässig 9mer primer (från kit) 10 Vatten 27 - Centrifug kort och placera på is.
- Lägg till följande komponenter. Blanda och inkubera i 30 min vid 37 °C med hjälp av en PCR-maskin. (För närmare uppgifter om det använda satsen, se tabellen över reagenser och utrustning).
komponent Mängd per reaktion (μl) Slutlig koncentration Blandning framställd från steg 2.2 38 5x nukleotidbuffert (från satsen) 9.2 Cy3-dUTP (1 mM) 0.8 16 μM Klenow (från kit) 2 - Tillsätt 2 μl stoppbuffert (från satsen) för att avbryta reaktionen.
- Rena den stoppade reaktionen med hjälp av mikrospinkolonner.
- Tillsätt 50 μg (5 μl) sillsperma DNA (50 gånger överskott av mall Cot-1 DNA) till den renade fraktionen.
- Mät den totala volymen med en pipett. Tillsätt 0,7x volym på 100% etanol och 0,1x volym på 3 M natriumacetat (pH 5.2), blanda väl och centrifugera i 15 min vid maximal hastighet (17 000 x g) med en mikrocentrifug vid 4 °C.
- Ta bort vätskan och tillsätt 200 μl 70% etanol, blanda väl och centrifugera i 5 minuter vid maximal hastighet vid 4 °C.
- Ta bort överskottsvätskan. Torka fällningen i 10-30 min vid rumstemperatur.
- Lös upp pelleten i 20 μl hybridiseringsbuffertlager. Eftersom pelleten ofta är svår att lösa upp, pipett upprepade gånger. Som ett alternativt alternativ kan en virvelblandare också användas för att effektivt lösa upp pelleten. Sonder kan hållas vid -20 °C tills de används.
3. Barnsäng-1 RNA FISH
- Lägg till komponenterna nedan i ett PCR-rör. Använd en PCR-maskin, inkubera i 10 min vid 80 °C, följt av ett förannealt steg på cirka 10-30 min vid 42 °C. Håll vid 42 °C tills hybridiseringen. Ribonukleoside Vanadyl Complex är valfritt; det kan ersättas med vatten.
komponent Mängd per reaktion (μl) sist SPett-1 DNA-sond (50 ng/μl) 2 100 ng Ribonucleoside Vanadyl Komplex (200 mM) 2 20 mM Hybridiseringsbuffert läggs till i 20 - Dehydrera diabilder i en Coplinburk som innehåller 80% etanol i 2 min, följt av en Coplinburk som innehåller 100% etanol i 2 min. Torra rutschkanor helt på labbbänken vid rumstemperatur.
- Förvärm en tippboxkammare (fylld med 2-3 cm vatten) i en 42 °C inkubator i förväg. Placera bilden på tippboxkammaren. Centrifugera kort de förannealerade sonderna och pipetten direkt på de uttorkade bilderna. Undvik att göra bubblor. Täck försiktigt över rutschkanan med en täcksnederett.
- Hybridisera i 6 timmar till över natten (14-15 timmar) vid 42 °C.
- Förbered tvättlösningar i Coplin burkar (två burkar med både 2x SSC och 50% formamide, och två burkar med 2x SSC). Förvärm vid 42 °C i 30 min i ett vattenbad.
- Använd ett rakblad för att ta bort täcksnederdelen från bildens kant. Undvik att skrapa prover. Tvätta diabilder i en Coplinburk som innehåller 2x SSC och 50% formamid i 5 min vid 45 °C. Upprepa det här steget en gång.
- Tvätta diabilder i en Coplinburk som innehåller 2x SSC i 5 min vid 45 °C. Upprepa det här steget en gång.
- Tillsätt 20 μl DAPI-monteringsmedier i bilderna och täck med en täckspäck. Tryck försiktigt på täckglaset för att ta bort extra monteringsmedier. Blot extra monteringsmedia med rengöringsvävnad. Bilderna är klara för mikroskopiutvärdering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett representativt resultat av en 3D-bild visas i figur 2. I detta experiment utfördes Cot-1 RNA FISH för att upptäcka gryende transkription tillsammans med immunostaining med anti CBX1 och γH2AX antikroppar. För att kombinera RNA FISH och immunostaining utfördes immunostaining först, följt av RNA FISH som beskrivs i3. CBX1 är ett heterokromatinprotein som lokaliserar till pericentromeric heterochromatin och tysta könskromosomer i meios som kallas en XY-kropp (eller sexkropp). γH2AX är en fosforylerad form av histonvariant H2AX och lokaliserar på XY-kroppen. I denna bild ackumuleras Cot-1 signaler på eukromatiska regioner, men är uteslutna från pericentromeric heterochromatin och XY kroppen.
Under ytspridningspreparat sväller behandlingen med hypoton lösning atomkärnor och förlänger fysiskt subkärnor. Denna rådande metod för meiotisk studie är bäst lämpad för att fånga alla meiotiska kromosomer i ett enda z-plan1. För att klargöra skillnaden mellan 3D-glidmetoden och ytspridningen efter hypoton behandling visas representativa bilder av pachytens spermatocyter i varje experiment med samma förstoring med hjälp av ett epifluorescerande mikroskop (figurerna 2A och 2B). I ytspridare behandlade med hypoton lösning störs den tredimensionella kromatinstrukturen och alla meiotiska kromosomaxlar kan fångas inom ett enda z-plan. 3D-bildberedning bevarar dock den intakta kromatinstrukturen.
Figur 1. Schematisk 3D-bildmetod. 3D-bildmetoden kan bevara den tredimensionella kromatinstrukturen. På grund av bildens tredimensionella karaktär krävs datainsamling med flera z-avsnitt för att täcka en kärna.
Figur 2. Jämförelse mellan 3D-glidmetoden och ytan sprider sig efter hypotonisk behandling vid samma förstoring. (A) Med hjälp av 3D-diabilden utförs Cot-1 RNA FISH (cy3) och immunostaining med anti CBX1 (fitc) och γH2AX (cy5) antikroppar. En pachyten spermatocyte med en enda z-sektion visas. (B) Med hjälp av ytspridningarna utförs immunostaining med anti SCP3- och γH2AX-antikroppar. En pachyten spermatocyte visas. Cirklar: XY kropp. Stänger: 10 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I 3D-bildförberedelser föregår permeabiliseringssteget fixeringssteget. Dessa steg utförs direkt på seminiferous tubules, vilket bevarar den tredimensionella kromatinstrukturen. Ett alternativt alternativ till att bevara kromatinstrukturen för RNA/DNA FISH är att utföra permeabiliseringssteget och fixeringssteget samtidigt. Denna alternativa teknik har utförts i pungbakterier och i musförimplantationsembryon7,8. Men om fixeringssteget föregår permeabiliseringssteget kan det ge upphov till hög cytoplasmisk bakgrund. Därför är den kritiska bestämningsfaktorn för glidoptimering för RNA och DNA FISH beroende av permeabiliseringens ordning och fixeringsstegen. Varaktigheten av permeabiliseringssteget är också en viktig faktor för optimering av bildberedning. Sex minuter är det allmänna villkoret för denna metod. Det kan dock justeras beroende på variationen av de använda materialen.
Bevarandet av den tredimensionella kromatinstrukturen är en egenskap hos 3D-bilden som tydligt skiljer den från ytspridningsbilder. Denna fördel skiljer sig mycket från kromosomspridningsberedningen. 3D-bildmetoden bevarar tredimensionell kromatinstruktur, men kräver datainsamling med flera z-sektioner för att omfatta en hel kärna. Ett enda z-avsnitt kan inte fånga alla signaler om en kärna. Således är behovet av flera z-sektioner en stor begränsning av denna metod. För att fånga en kärna i en enda z-sektion har ytspridningar en fördel. Därför har 3D-metoden och ytspridningspreparatet tydliga fördelar och kompenserar varandras egenskaper för studier av meios och spermatogenes.
3D-glidmetoden kan tillämpas på alla celltyper som finns i testiklarna, inklusive spermatogonia, runda spermatider och Sertoli-celler. Denna metod har också tillämpats för att undersöka kromatinkomprimeringen av könskromosomerna vid uppkomsten av meiotisk könskromosominaktivering och för att undersöka epigenetiska modifieringar på PMSC10. När det gäller framtida tillämpningar kan denna metod tillämpas på andra vävnader eller celler. I så fall rekommenderas att permeabiliseringssteget föregår fixeringssteget. Alternativt kan permeabiliseringssteget och fixeringssteget utföras samtidigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har inget att avslöja.
Acknowledgments
Jag tackar Jeannie T. Lee för övervakningen av detta projekt när jag var i Lee-laboratoriet och Tyler Broering för att ha redigerat manuskriptet. Detta arbete stöddes av Basil O'Connor Starter Scholar Award från March of Dimes Foundation och NIH Grant GM098605.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | |
| Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit | Agilent | 300380 | |
| Herring sperm DNA Solution | Invitrogen | 15634-017 | |
| Ethanol. 200 proof (absolute) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Formamide deionized | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Lifeblood Medical | 77110-100 | |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D6001 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | A10491-01 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 76240 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | |
| Illustra MicroSpin G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Forceps | VWR | 300-050 | |
| Microcentrifuge tubes | Bioexpress | C-3262-1 | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| Coplin Jar | Fisher | 08-815 | |
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| 4-well dish | Fisher | 12-566-301 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Air incubator | Revolutionary Science | RS-IF-203 |
References
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Namekawa, S. H., et al. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr Biol. 16, 660-667 (2006).
- Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
- Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis. Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).
- Hall, L. L., et al. An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).
- Huynh, K. D., Lee, J. T. Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos. Nature. 426, 857-862 (2003).
- Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).
- Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse. Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).
- Ichijima, Y., et al. MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells. Genes Dev. 25, 959-971 (2011).
- Sin, H. S., et al. RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids. Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).
