Summary
O material aqui descreve um método desenvolvido para preservar a estrutura de cromatina tridimensional das células germinativas testiculares. Este foi chamado de método de slides tridimensional (3D). Este método melhora a sensibilidade para detecção de estruturas subnucleares e é aplicável para imunofluorescência, DNA e fluorescência de RNA na hibridização situ (FISH).
Abstract
Durante a diferenciação das células germinativas testiculares, a estrutura da cromatina nuclear muda dinamicamente. Descreve um método projetado para preservar o arranjo tridimensional de cromatina de células germinativas testiculares encontradas em camundongos; este método foi denominado como o método de slides tridimensional (3D). Neste método, os túbulos testiculares são tratados diretamente com uma etapa de permeabilização que remove o material citoplasmático, seguido por uma etapa de fixação que fixa materiais nucleares. Os túbulos são então dissociados, a suspensão celular é citospun, e as células aderem aos slides. Este método melhora a sensibilidade para a detecção de estruturas subnucleares e é aplicável para imunofluorescência, DNA e fluorescência de RNA na hibridização situ (FISH) e a combinação desses métodos de detecção. Como exemplo de uma possível aplicação do método de slides 3D, um PEIXINHO RNA Cot-1 é mostrado para detectar RNAs nascentes. O método de slides 3D facilitará o exame detalhado das relações espaciais entre estrutura de cromatina, DNA e RNA durante a diferenciação de células germinativas testiculares.
Introduction
Em testículos, as células germinativas se diferenciam da espermatogonia diploide através da meiose em espermatozoides maduros e haploides. Durante esse processo, a estrutura de cromatina nuclear das células germinativas é continuamente e dinamicamente remodelada. As propagações superficiais são comumente usadas para o exame citológico de células espermatogênicas individuais. Um método predominante de propagação superficial emprega tratamento hipotônico pelo qual as células espermatogênicas individuais são espalhadas e achatadas1. Estas condições são ideais para análise detalhada de cromossomos meioticos. Características cromossômicas como status sináptico e focos de recombinação são facilmente observadas usando este método. No entanto, o tratamento hipotônico interrompe a arquitetura de cromatina subnuclear, portanto essa técnica não é adequada para análise estrutural de núcleos. Consequentemente, um método melhorado foi projetado para preservar a estrutura de cromatina tridimensional das células germinativas testiculares. Este método foi denominado como o método de slides tridimensional (3D)(Figura 1). O método de slides 3D permitiu a detecção da localização nascente do RNA em núcleos porque foi inicialmente otimizado para examinar a expressão genética e os estados de cromatina durante a diferenciação de células germinativas testiculares pela fluorescência de RNA na hibridização situ (FISH)2,3. Este método 3D também é aplicável à combinação de imunofluorescência, DNA e RNA FISH. Além disso, este método tem auxiliado na descoberta da cromatina sexual pós-amioótica (PMSC), um compartimento silencioso dos cromossomos sexuais encontrados nos espermatozoides pós-meioticos2.
O método de slides 3D foi originalmente otimizado através da combinação de duas etapas essenciais de preparação de slides comumente utilizadas para coloração nuclear: a etapa de fixação projetada para fixar materiais nucleares e a etapa de permeabilização destinada a remover materiais citoplasmáticos a fim de melhorar a acessibilidade de reagentes de coloração, como anticorpos e sondas FISH. Como descrito anteriormente em outrapublicação 3,foi determinado que a etapa de permeabilização deve preceder a etapa de fixação, a fim de obter resultados ideais com baixo fundo citoplasmático. Neste método de slides 3D, a etapa de permeabilização e a etapa de fixação subsequente são realizadas diretamente em túbulos seminiferos e são seguidas pela dissociação mecânica de células germinativas com fórceps antes de citospinning em slides. Um método alternativo para RNA FISH de células espermatogênicas foi desenvolvido em outro laboratório4. Neste método, consistente com o método 3D, a etapa de permeabilização deve preceder a etapa de fixação para obter resultados ideais de RNA FISH.
O protocolo a seguir descreve o método de slides 3D e fornece um exemplo de uma possível aplicação, Cot-1 RNA FISH para a detecção de RNAs de nascente nuclear. O DNA do Cot-1 consiste em elementos repetitivos no genoma. Aqui, uma sonda de DNA Cot-1 é hibridizada para um intron e UTR das transcrições nascentes, detectando assim as regiões transcricionáriamente ativas no núcleo5,6. Slides 3D são versáteis e podem ser aplicados a uma combinação de técnicas de imunofluorescência, DNA e RNA FISH, a fim de obter um exame detalhado das relações espaciais entre a arquitetura da cromatina.
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Protocol
Preparação de slides .3D 1
- Prepare os seguintes reagentes:
- Tampão CSK: 100 mM NaCl, 300 mM de sacarose, 10 mM PIPES, 3 mM MgCl2. Ajuste o pH para 6,8 com 1 M NaOH. Armazene o buffer CSK a 4 °C.
- Tampão CSK com 0,5% Triton X-100: Adicione 200 μl de Triton X-100 a 40 ml de tampão CSK. Misture a solução usando agitador magnético até que Triton X-100 esteja completamente dissolvido. Armazene o buffer CSK com 0,5% Triton X-100 a 4 °C.
- 4% Paraformaldeído (PFA)-PBS, pH 7.4: Dissolver 4 g de PFA em aproximadamente 70-80 ml de água. Para agilizar o processo de dissolução, adicione aproximadamente 20 μl de 4 N NaOH e mantenha a solução em um banho de água a 60 °C até que o PFA tenha completamente dissolvido e a solução seja transparente. Esse processo leva aproximadamente 1 hora. Depois que o PFA tiver completamente dissolvido, adicione 10 ml de PBS de 10x. Ajuste o volume final para 100 ml com água e esfrie a solução para temperatura ambiente (25 °C). Use uma solução recém-preparada para cada novo experimento.
Nota: Obtenha permissão institucional para todo o trabalho animal e adere às diretrizes de cuidado animal relevantes.
- Eutanize ratos machos. Usando fórceps e tesouras, extirpe o teste do rato. Coloque o teste em PBS (ou RPMI 1640). Após a remoção do testis, realize rapidamente as seguintes etapas 1.3-1.4, a fim de evitar a degradação do RNA.
- Rompa o testímetro em uma pequena placa de Petri e remova a tunica albuginea. Desvendar os túbulos seminiferos em PBS no gelo usando fórceps.
- Usando fórceps, transfira vários túbulos (vários pedaços de túbulos aproximadamente 5-10 mm de comprimento) em um poço de um prato de 4 poços contendo 500 ml de tampão CSK + 0,5% Triton X-100 no gelo, e incubar por 6 min. A superexposição ao buffer CSK pode resultar na interrupção das células.
- Usando fórceps, transfira todos os túbulos para um poço de um prato de 4 poços contendo 4% de solução PFA-PBS. Esta etapa pode ser pré-formada sem um estereótipo, mas opcionalmente pode ser usada. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Ao mesmo tempo, comece a preparar 12 câmaras de citospin durante os períodos de incubação.
- Usando fórceps, transfira todos os túbulos para um poço de um prato de 4 poços contendo PBS. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Na parte traseira de um escorregador de vidro, transfira todos os túbulos para 30 μl de PBS (a parte superior do slide deve ser evitada devido à carga cationic). Usando as pontas de dois fórceps, rasgue os túbulos em pedaços. Pique os túbulos em uma direção horizontal, cortando túbulos entre as pontas de dois fórceps e puxando as fórceps horizontalmente. Continue com esta etapa por aproximadamente 10-20 segundos.
- Misture a suspensão por pipeta usando uma pipeta P20.
- Transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga, diluída com PBS para aproximadamente 1,3 ml. Aplique 100 μl de suspensão a cada uma das 12 câmaras de citospin (1,2 ml total). Nesta etapa, a concentração das células não precisa ser determinada.
- Citospin as amostras a 2.000 rpm por 10 minutos em temperatura ambiente. Depois de citospinning, lâminas secas no banco do laboratório por alguns minutos em temperatura ambiente. Depois que slides tiverem sido permitidos secar completamente por alguns minutos, vá para o próximo passo.
- Usando um frasco coplin contendo PBS, lave os slides por 5 minutos à temperatura ambiente.
- Transfira slides para um frasco de Coplin contendo 70% de etanol e espere pelo menos 2 minutos antes do início do RNA FISH. Os slides estão estáveis por algumas semanas em 70% de etanol a 4 °C. Para armazenamento a longo prazo, desidratar slides usando tratamento serial com 80% e 100% de etanol em frascos de Coplin por 2 min cada e secar completamente os slides. Armazene a -80 °C em uma caixa de slides.
2. Preparação da sonda de DNA Cot-1 por preparação aleatória
- Prepare os seguintes reagentes:
- Tampão de hibridização: Misture os componentes de processo para preparar 900 ml de estoque tampão de hibridização; esta solução será usada para estocar sondas. Este estoque tampão de hibridização permite a adição de 10% de volume de solução inibidora de RNase (Complexo Vanadyl Ribonucleoside) antes da hibridização.
Antes da hibridização, adicione 1/10 vol de 200 mM Complexo de Vanadyl Ribonucleoside ou água ao estoque de tampão de hibridização para corresponder à concentração final. A -20 °C, esta mistura é estável por mais de um ano.componente Quantidade (μl) Concentração final Formamida 500 50% (v/v) 50% Dextran 200 10% (w/v) 20x SSC 100 2x 1% BSA 100 0.1% - 20x SSC: Dissolva 88,2 g de citrato de sódio e 175,3 g de NaCl em aproximadamente 800 ml de água. Ajuste o pH para 7.0 usando algumas gotas de 1 M HCl. Adicione água para ajustar o volume final a 1 L. Esterilizar por autoclaving. Após a preparação, 20x SSC pode ser armazenado à temperatura ambiente.
- 50% (w/v) Dextran: Mexa água e adicione lentamente 50 g de sulfato de dextran. Continue mexendo durante a noite em temperatura ambiente. Adicione água para ajustar o volume final a 100 ml. Armazene à temperatura ambiente.
- Tampão de hibridização: Misture os componentes de processo para preparar 900 ml de estoque tampão de hibridização; esta solução será usada para estocar sondas. Este estoque tampão de hibridização permite a adição de 10% de volume de solução inibidora de RNase (Complexo Vanadyl Ribonucleoside) antes da hibridização.
- Adicione os seguintes componentes listados abaixo a um tubo PCR. Usando uma máquina PCR, misture e incuba a solução por 5 min a 95 °C.
componente Quantidade por reação (μl) final DNA cot-1: 1 mg/ml 1 1 μg Primer aleatório de 9mer (do kit) 10 Água 27 - Centrífuga brevemente e coloque no gelo.
- Adicione os seguintes componentes. Misture e incubar por 30 min a 37 °C usando uma máquina PCR. (Para detalhes do kit utilizado consulte a tabela de reagentes e equipamentos).
componente Quantidade por reação (μl) Concentração final Mistura preparada a partir da etapa 2.2 38 Tampão nucleotídeo 5x (do kit) 9.2 Cy3-dUTP (1 mM) 0.8 16 μM Klenow (do kit) 2 - Adicione 2 μl de buffer de parada (do kit) para interromper a reação.
- Purifique a reação parada usando colunas de microspin.
- Adicione 50 μg (5 μl) de DNA de espermatozoides de arenque (50 vezes o excesso de DNA de modelo Cot-1) à fração purificada.
- Meça o volume total usando uma pipeta. Adicione 0,7x de volume de 100% etanol e 0,1x de acetato de sódio de 3 M (pH 5.2), misture bem e centrífuga por 15 minutos em velocidade máxima (17.000 x g) usando um microcentrifuge a 4 °C.
- Retire o líquido e adicione 200 μl de 70% de etanol, misture bem e centrífuga por 5 min em velocidade máxima a 4 °C.
- Remova o excesso de líquido. Seque o precipitado por 10-30 min à temperatura ambiente.
- Dissolva a pelota em 20 μl de estoque tampão de hibridização. Porque a pelota é muitas vezes difícil de dissolver, pipeta repetidamente. Como opção alternativa, um misturador de vórtice também pode ser usado para dissolver eficientemente a pelota. As sondas podem ser mantidas a -20 °C até usar.
3. PEIXE DE RNA COT-1
- Adicione os componentes listados abaixo a um tubo PCR. Usando uma máquina PCR, incubar por 10 min a 80 °C, seguido de uma etapa de pré-estanagem de aproximadamente 10-30 min a 42 °C. Mantenha a 42 °C até a hibridização. O Complexo Vanadyl ribonucleosídeo é opcional; pode ser substituído por água.
componente Quantidade por reação (μl) final Sonda de DNA Cot-1 (50 ng/μl) 2 100 ng Complexo Vanadyl Ribonucleosídeo (200 mM) 2 20 mM Tampão de hibridização adicionado a 20 - Desidratar slides em um frasco de Coplin contendo 80% de etanol por 2 min, seguido por um frasco de Coplin contendo 100% de etanol por 2 min. Lâminas secas completamente no banco do laboratório à temperatura ambiente.
- Pré-aqueça uma câmara de caixa de ponta (cheia com 2-3 cm de água) em uma incubadora de 42 °C com antecedência. Coloque o slide na câmara da caixa de ponta. Centrifufique brevemente as sondas pré-apresentadas e a pipeta diretamente nos slides desidratados. Evite fazer bolhas. Cubra suavemente o slide com um deslizamento de cobertura.
- Hibridize por 6 horas a noite (14-15 horas) a 42 °C.
- Prepare soluções de lavagem em frascos Coplin (dois frascos com 2x SSC e 50% de formamide, e dois frascos com 2x SSC). Pré-aqueça a 42 °C por 30 min em banho-maria.
- Use uma lâmina de barbear para remover o deslizamento da tampa da borda do slide. Evite coçar amostras. Lave lâminas em um frasco de Coplin contendo 2x SSC e 50% de formamida por 5 min a 45 °C. Repita este passo uma vez.
- Lave lâminas em um frasco de Coplin contendo 2x SSC por 5 min a 45 °C. Repita este passo uma vez.
- Adicione 20 μl de mídia de montagem de DAPI aos slides e cubra com um deslizamento de tampa. Pressione suavemente o vidro de cobertura para remover a mídia de montagem extra. Borrar mídia extra de montagem com tecido de limpeza. Os slides estão prontos para avaliação de microscopia.
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Representative Results
Um resultado representativo de um slide 3D é mostrado na Figura 2. Neste experimento, o Cot-1 RNA FISH foi realizado para detectar transcrição nascente juntamente com a imunostaining usando anticorpos anti CBX1 e γH2AX. Para combinar RNA FISH e imunostaining, a imunostaining foi realizada primeiro, seguida por RNA FISH como descrito em3. CBX1 é uma proteína heterocromatina que localiza a heterocromatina pericentromérica e cromossomos sexuais silenciosos na meiose chamada corpo XY (ou corpo sexual). γH2AX é uma forma fosfoilada da variante histona H2AX e localizada no corpo XY. Nesta imagem, os sinais de Cot-1 se acumulam em regiões eucromáticas, mas são excluídos da heterocromatina pericentromérica e do corpo XY.
Durante a preparação da propagação da superfície, o tratamento com solução hipotônica incha núcleos e estende fisicamente estruturas subnucleares. Este método predominante para estudo meiotico é mais adequado para capturar todos os cromossomos meioticos em um único z-plane1. Para esclarecer a diferença entre o método de slides 3D e a superfície se espalha após o tratamento hipotônico, imagens representativas de espermatos pachytene de cada experimento são mostradas usando a mesma ampliação usando um microscópio epifluorescente (Figuras 2A e 2B). Em spreads superficiais tratados com solução hipotônica, a estrutura de cromatina tridimensional é interrompida e todos os eixos cromossomos meioéticos podem ser capturados dentro de um único plano Z. A preparação de slides 3D, no entanto, preserva a estrutura de cromatina intacta.
Figura 1. Esquema do método de slides 3D. O método de slides 3D pode preservar a estrutura de cromatina tridimensional. Devido à natureza tridimensional do slide, a aquisição de dados com várias seções z é necessária para cobrir um núcleo.
Figura 2. A comparação entre o método de deslizamento 3D e a superfície se espalha após o tratamento hipotônico na mesma ampliação. (A) Utilizando o slide 3D, são realizados os anticorpos Cot-1 RNA FISH (cy3) e imunostaining com anticorpos anti CBX1 (fitc) e γH2AX (cy5). Um espermatozoide pachytene com uma única seção z é mostrado. (B) Utilizando as propagações da superfície, são realizadas imunosmunas com anticorpos anti SCP3 e γH2AX. Um espermatozoide pachytene é mostrado. Círculos: Corpo XY. Barras: 10 μm.
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Discussion
Na preparação do slide 3D, a etapa de permeabilização precede a etapa de fixação. Essas etapas são realizadas diretamente em túbulos seminiferos, preservando assim a estrutura de cromatina tridimensional. Uma opção alternativa para preservar a estrutura de cromatina para RNA/DNA FISH é realizar a etapa de permeabilização e a etapa de fixação simultaneamente. Esta técnica alternativa tem sido realizada em células germinativas marsupiais e embriões de pré-implantação de camundongos7,8. No entanto, se a etapa de fixação preceder a etapa de permeabilização, ela pode dar origem a um alto fundo citoplasmático. Portanto, o determinante crítico da otimização de slides para RNA e DNA FISH depende da ordem da permeabilização e das etapas de fixação. A duração da etapa de permeabilização também é um fator importante para a otimização da preparação de slides. Seis minutos é a condição geral para este método. No entanto, pode ser ajustado dependendo da variação dos materiais utilizados.
A preservação da estrutura de cromatina tridimensional é uma característica do slide 3D que a separa distintamente dos slides espalhados pela superfície. Essa vantagem difere muito da preparação de propagação de cromossomo. O método de slides 3D preserva a estrutura de cromatina tridimensional, mas requer aquisição de dados com múltiplas seções z para abranger um núcleo inteiro. Uma única seção Z não pode capturar todos os sinais de um núcleo. Assim, a necessidade de múltiplas seções z é uma grande limitação para este método. Para capturar um núcleo em uma única seção Z, as propagações de superfície têm uma vantagem. Portanto, o método 3D e a preparação da propagação da superfície têm vantagens distintas e compensam mutuamente as características uns dos outros para o estudo da meiose e espermatogênese.
O método de slides 3D pode ser aplicado a todos os tipos de células encontradas nos testículos, incluindo espermatogonia, espermatozoides redondos e células sertoli. Este método também foi aplicado para examinar a compactação da cromostina cromossa dos cromossomos sexuais no início da inativação do cromossomo do sexo meiotic, e para examinar modificações epigenéticas no PMSC10. Em termos de aplicações futuras, este método pode ser aplicado a outros tecidos ou células. Se assim for, recomenda-se que a etapa de permeabilização preceda a etapa de fixação. Alternativamente, a etapa de permeabilização e a etapa de fixação podem ser realizadas simultaneamente.
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Disclosures
O autor não tem nada a revelar.
Acknowledgments
Agradeço a Jeannie T. Lee pela supervisão deste projeto quando eu estava no laboratório Lee e Tyler Broering por editar o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Basil O'Connor Starter Scholar Award da Fundação March of Dimes e do NIH Grant GM098605.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | |
| Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit | Agilent | 300380 | |
| Herring sperm DNA Solution | Invitrogen | 15634-017 | |
| Ethanol. 200 proof (absolute) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Formamide deionized | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Lifeblood Medical | 77110-100 | |
| Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D6001 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | A10491-01 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 76240 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | |
| Illustra MicroSpin G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Forceps | VWR | 300-050 | |
| Microcentrifuge tubes | Bioexpress | C-3262-1 | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| Coplin Jar | Fisher | 08-815 | |
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| 4-well dish | Fisher | 12-566-301 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Air incubator | Revolutionary Science | RS-IF-203 |
References
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